不同生長時(shí)期羅漢果高效液相指紋圖譜研究

盧鳳來，劉金磊，黃永林，李典鵬*

(廣西壯族自治區(qū)-中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

不同生長時(shí)期羅漢果高效液相指紋圖譜研究

盧鳳來，劉金磊，黃永林，李典鵬*

(廣西壯族自治區(qū)-中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

探索羅漢果藥材的質(zhì)量變化規(guī)律，確定羅漢果的關(guān)鍵生長期與采收期，指導(dǎo)羅漢果GAP生產(chǎn)，同時(shí)為羅漢果藥材建立一種更合理的質(zhì)量控制方法。采用高效液相色譜法建立不同生長時(shí)期青皮果與長灘果的特征性化學(xué)成分指紋圖譜，通過聚類分析以及對(duì)11個(gè)指標(biāo)性成分的鑒定及峰面積變化分析，研究羅漢果生長過程中的質(zhì)量變化情況。結(jié)果表明不同栽培品種羅漢果在生長過程中具有相似的化學(xué)成分變化規(guī)律，不同生長時(shí)期化學(xué)成分特征不同。中藥化學(xué)成分色譜指紋圖譜技術(shù)是一種全方位多角度控制中藥質(zhì)量方法，可以更有效地指導(dǎo)中藥材規(guī)范化種植。

羅漢果；色譜指紋圖譜；高效液相色譜法；聚類分析

羅漢果(Siraitia grosvenorii)從1977年以來一直被《中華人民共和國藥典》收錄，為藥食兩用植物，具有清熱潤肺、涼血、潤腸通便的功效，在治療百日咳、慢性氣管炎、感冒、便秘、胃腸小疾等方面療效顯著[1]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、飲料和調(diào)味品當(dāng)中。其化學(xué)成分復(fù)雜，含有多種皂苷成分[2-7]，尚含有黃酮甙[8]和少量的甘露醇，鮮羅漢果中還富含豐富的VC[9]，且不同生長時(shí)期羅漢果果實(shí)中黃酮類化合物含量不同[10]；苷類成分也不一致，成熟羅漢果富含羅漢果甜苷，主要為羅漢果苷Ⅳ、Ⅴ(mogrosideⅣ、Ⅴ)，味極甜；未成熟的羅漢果主要含有羅漢果苦苷A(mogrosideⅡE)，味苦。李典鵬等利用薄層層析以及高效液相色譜法研究了不同生長時(shí)期羅漢果中苷類成分的變化[11]，并對(duì)羅漢果及羅漢果花化學(xué)成分進(jìn)行了深入研究，從中分離得到多個(gè)苷類成分及黃酮類成分[12-13]。

指紋圖譜技術(shù)作為一種多組分復(fù)雜樣品的有效質(zhì)量控制方法，能夠反映出待測樣品的整體性、特征性，目前已被廣泛用于中草藥及其各種制劑的質(zhì)量控制[14-15]。但至今未發(fā)現(xiàn)有關(guān)不同生長時(shí)期羅漢果指紋圖譜研究的報(bào)道。本研究通過RP-HPLC法建立不同生長時(shí)期羅漢果的指紋圖譜，旨在將化學(xué)成分色譜指紋圖譜技術(shù)運(yùn)用于生產(chǎn)實(shí)踐，利用多個(gè)單體作參照物，對(duì)羅漢果生長過程中化學(xué)成分的變化規(guī)律作全面地了解，以確定羅漢果生長的關(guān)鍵時(shí)期與最佳的采收期，指導(dǎo)羅漢果GAP生產(chǎn)

管理，并為羅漢果的相關(guān)藥效研究以及新藥的研發(fā)提供全面的信息基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)羅漢果產(chǎn)業(yè)快速健康地發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

羅漢果盛花期，于廣西植物所羅漢果藥材地里給長灘、青皮果掛牌點(diǎn)花。點(diǎn)花5d后，相繼采摘不同日齡的果實(shí)適量，采集后分別冷凍干燥，過40目篩，然后裝在封口袋于干燥瓶內(nèi)保存?zhèn)溆谩悠返木唧w來源見表1。

表1 不同生長時(shí)期青皮果與長灘果的來源Table 1 Origin of tested samples at different growth stages

1.2 對(duì)照品

LHG1：羅漢果黃Ⅰ(3-O-β-D-glucopyranosyl kaempferol 7-O-[β-D-glucopyranosyl-(1-2)-α-L-rhamnopyranoside]，LHG2：山奈酚-3,7-O-α-L-吡喃鼠李糖雙糖甙(kaempferol-3,7-α-L-dirhamnopyranoside)，LHG3：3-O-β-D-吡喃鼠李糖基-山奈酚-7-O[β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-α-L-吡喃鼠李糖甙](3-O-α-L-rhamnopyranosyl kaempferol 7-O[β-D-glucopyranosyl (1-2)-α-L- rhamnopyranoside])，LHG4：3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-山奈酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖甙(3-O-β-D-glucopyranosyl kaempferol 7-O-α-L-rhamnopyranoside)及LHG5：11-氧化羅漢果苷Ⅴ(11-oxomogrosideⅤ)；LHG6：羅漢果苷Ⅴ(mogroside Ⅴ)；LHG7：羅漢果苷ⅣA(mogrosideⅣA)； LHG8：羅漢果苷Ⅲ(mogrosideⅢ)；LHG9：11-氧化羅漢果苷Ⅲ(11-oxomogroside Ⅲ)；LHG10：羅漢果苷ⅡE(mogroside ⅡE)；LHG11：11-氧化羅漢果苷ⅡE(11-oxomogroside ⅡE)為本實(shí)驗(yàn)小組自制，所有的化合物均經(jīng)光譜學(xué)確定結(jié)構(gòu)。

1.3 儀器與設(shè)備

1100分析型高效液相色譜儀(包括二極管陣列多波長DVD檢測器、四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、7725i手動(dòng)進(jìn)樣器、HP化學(xué)工作站) 美國Agilent公司；超聲波清洗器； B3500S-MT超聲波清洗器 必能信超聲(上海)有限公司；分析純甲醇、乙醇、磷酸 廣東汕頭市西隴化工廠；色譜純乙腈 美國TEDIA公司；重蒸蒸餾水 自制。

1.4 方法

1.4.1 供試品溶液的制備

取羅漢果藥材粉末0.5μg，精密稱量，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，搖勻，稱量，超聲處理1μh，冷卻，再稱量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以0.45μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

1.4.2 對(duì)照品溶液的制備

稱取LHG1、LHG2、LHG3、LHG4、LHG5、LHG6、LHG7、LHG8、LHG9、LHG10、LHG11適量，用甲醇溶解到5mL的容量瓶中，超聲使其充分溶解，并用甲醇定容至刻度，以0.45μm的微孔濾膜濾過，濾液作為對(duì)照品溶液。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱溫：20℃；流動(dòng)相：0.05%磷酸(A)-乙腈(B)(梯度洗脫：0～8min，3%～13.5% B；8～35min，13.5%～35% B；35～45min：35% B)；檢測時(shí)間：45min；流速：0.8mL/min；檢測波長：203nm；進(jìn)樣量：10μL。

1.5 數(shù)據(jù)軟件

中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

選擇了青皮果45d樣品考察分析方法的可靠性，對(duì)儀器精密度、方法重現(xiàn)性以及樣品穩(wěn)定性作了相應(yīng)考察。取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察精密度；另取供試品5份，分別按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，檢測指紋圖譜，考察重現(xiàn)性；再取同一供試品分別在2、8、14、20、30、48h，檢測指紋圖譜考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示其主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積RSD分別小于3%和5%，符合指紋圖譜技術(shù)要求。說明儀器精密度、供試品溶液穩(wěn)定性及方法重現(xiàn)性良好。

2.2 青皮果與長灘果指紋圖譜的比較

按1.4.2節(jié)供試品溶液的制備方法，制備不同生長時(shí)期青皮果和長灘果的供試液，分別進(jìn)樣進(jìn)行檢測，得到不同生長時(shí)期青皮果和長灘果的指紋圖譜(圖1、2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同生長時(shí)期羅漢果液相色譜可分離出多個(gè)成分，在觀察眾多樣品色譜圖的基礎(chǔ)上，根據(jù)是否為共有峰，同時(shí)在不同時(shí)期的樣品中其相對(duì)峰面積是否有變化，能否構(gòu)成“指紋”為依據(jù)從中選取20個(gè)可以構(gòu)成指紋圖譜的穩(wěn)定的特征峰(圖3B)。青皮果和長灘果均具有這些特征峰，但峰面積的大小隨生長時(shí)期有很大變化，有些峰僅在生長周期的某個(gè)階段出現(xiàn)。這說明這些色譜峰對(duì)應(yīng)的化合物為羅漢果的共有化學(xué)成分，選取它們?yōu)樘卣鞣寰哂写硇?。同時(shí)也提示羅漢果的化學(xué)成分是隨著生長而積累并轉(zhuǎn)化的。比較兩個(gè)品種各個(gè)時(shí)段的指紋圖譜可以發(fā)現(xiàn)，長灘果比青皮果具有多一些未知的小峰，說明長灘果化學(xué)成分較復(fù)雜。在同樣的日齡內(nèi)兩個(gè)品種，其色譜峰的強(qiáng)度不盡相同，也就是說它們化學(xué)成分的含量也不一致。

圖1 不同生長時(shí)期青皮果HPLC指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of Qingpiguo variety of Siraitia grosvenorii at different growth stages

圖2 不同生長時(shí)期長灘果HPLC指紋圖譜Fig.2 Fingerprints of Changtanguo variety of Siraitia grosvenorii at different growth stages

2.3 指紋圖譜主要色譜峰的鑒定

在上述的色譜條件下，分別測定樣品與11種對(duì)照品的指紋圖譜，比較樣品圖譜與對(duì)照品圖譜，發(fā)現(xiàn)樣品指紋圖譜中4、6、7、9、13、14、15、17、18、19、20號(hào)峰的保留時(shí)間及紫外光譜分別與此11種對(duì)照品吻合，故樣品指紋圖譜中4、6、7、9、13、14、15、17、18、19、20號(hào)特征峰分別鑒定為LHG1、LHG2、LHG3、LHG4、LHG5、LHG6、LHG7、LHG8、LHG9、LHG10、LHG11(圖3)。

圖3 對(duì)照品(A)和青皮45d HPLC指紋圖譜(B)Fig.3 Fingerprints of reference substance and Qingpiguo variety of Siraitia grosvenorii at the 45thday of growth period

2.4 指標(biāo)性成分的變化分析

從不同時(shí)期羅漢果的11個(gè)指標(biāo)性成分的峰面積來看，這些成分在羅漢果的生長過程有明顯的變化規(guī)律。羅漢果的苷類成分有明顯的變化規(guī)律。45d以前其主要苷類成分是LHG10、LHG11，且10d時(shí)兩者含量最高，而LHG6、LHG8和LHG9含量均比較低，在40d以前看不到LHG7峰出現(xiàn)。45～55d是各個(gè)苷類都存在，且含量相對(duì)均勻的時(shí)期。55d以后則以LHG6為主要成分。除LHG6外，所有的苷類呈相似的變化規(guī)律，即先增長后降低。其黃酮類化合物在羅漢果的早期，尤其是5d時(shí)百分含量最大，隨后逐漸下降，5～10d變化最顯著，下降幅度最大，此后緩慢下降，或者保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的范圍之內(nèi)。除LHG3的峰面積還比較高以外，其他峰的峰面積都比較小。見表2、3。

表2 不同生長時(shí)期青皮果的11個(gè)指標(biāo)性化合物峰面積變化Table 2 Peak areas of 11 reference compounds in Qingpiguo variety of Siraitia grosvenorii at different growth stages

表3 不同生長時(shí)期長灘果的10個(gè)指標(biāo)性化合物峰面積變化Table 3 Peak areas of 11 reference compounds in Changtanguo variety of Siraitia grosvenorii at different growth stages

2.5 指紋圖譜聚類分析

對(duì)青皮果和長灘果不同時(shí)期的各16個(gè)樣品作指紋圖譜分析，獲得20個(gè)共有色譜峰，以各個(gè)峰的峰面積作參量，得到16×20階原始數(shù)據(jù)，由SPSS軟件利用歐氏距離作為樣品的測度作聚類分析。結(jié)果顯示兩個(gè)品種聚類結(jié)果大致相同(圖4)，均將不同生長時(shí)期的羅漢果分為五類，第一類為5d，第二類為10～15d，第三類為20～40d，第四類為45～55d，大于等于60d為第五類。這說明不同栽培品種的羅漢果具有相似的生長規(guī)律。同時(shí)也說明5、10、20、45、60d左右為羅漢果生長的重要時(shí)期，是羅漢果化學(xué)成分產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時(shí)期。

圖4 不同生長時(shí)期青皮果與長灘果指紋圖譜聚類分析圖Fig.4 Clustering analysis for fingerprints of both varieties of Siraitia grosvenorii at different growth stages

3 討論與結(jié)論

3.1 在得到相對(duì)完備的中藥指紋圖譜后，應(yīng)進(jìn)入研究的高級(jí)階段，即指紋圖譜譜效學(xué)的研究。本實(shí)驗(yàn)利用對(duì)照品鑒別出指紋圖譜中主要的11個(gè)色譜峰，充分體現(xiàn)在強(qiáng)調(diào)色譜指紋圖譜模糊整體性評(píng)價(jià)的同時(shí)，也應(yīng)對(duì)其主要色譜峰進(jìn)行鑒別的思路，為進(jìn)一步的譜效學(xué)研究提供參考。

3.2 由HCA的結(jié)果可以看出5、10、20、45、60d左右為羅漢果生長的重要時(shí)期，是羅漢果化學(xué)成分產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時(shí)期。這是否表示如果這些時(shí)期對(duì)羅漢果采取特別的栽培管理方式，更有利于羅漢果化學(xué)成分的積累，還有待于研究。

3.3 目前LHG6是羅漢果的主要活性成分，也是控制羅漢果質(zhì)量的重要指標(biāo)，由表2、3可以看出，青皮果60d、長灘果65d以后，LHG6的峰面積變化不大，而且其他苦苷也幾乎不存在，因此我們認(rèn)為羅漢果65～70d采收較為適宜。及時(shí)采收不僅確保較高的LHG6含量，同時(shí)從植物生長的角度來看，還能減少果實(shí)對(duì)植株養(yǎng)分的消耗，有利于其他未成熟果實(shí)的生長。

3.4 近二十年來，黃酮類化合物日益引起人們的重視。國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物有數(shù)千種，大多數(shù)具有顯著生理藥理活性，在醫(yī)藥上已經(jīng)廣泛應(yīng)用，在功能食品開發(fā)方面越來越受到重視。由指紋圖譜可以看出羅漢果中含有的黃酮類種類及含量都不少。而且實(shí)驗(yàn)證明羅漢果黃酮具有一定的抗血栓形成、抗血小板聚集、降血脂、抗凝血等活血化瘀藥理作用[16]。因此，羅漢果黃酮類物質(zhì)具有很大的開發(fā)潛力。本研究為開發(fā)羅漢果潛在的活性成分以及羅漢果新藥的研發(fā)提供了化學(xué)信息研究資料，對(duì)指導(dǎo)羅漢果的生產(chǎn)與深入開發(fā)具有重要意義。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1977: 1356-1357.

[2]TAKEMOTO T, ARIHARA S, NAKAJIMA T, et al. Study on the constituents of fructus momordicae.I-III[J]. Yakugaku Zasshi, 1983, 103: 1151-1173.

[3]KASAI R, NIE R L, NASHI K, et al. Sweet cucurbitane glycosides from fruits of Siraitia siamensic (chi-zi Luo-han-guo): a Chinese folk medicine [J]. Agric Biol Chem, 1989, 53: 3347-3349.

[4]MATSUMOTO K, KASAI R, OHTANI K, et al. Minor cucurbitane glycosides from fruits of Siraitia grosvenorii (cucurbitancaae)[J]. Chem Pharm Bull, 1990, 38: 2030-2032.

[5]CHANG Q, CHEN D H, SI J Y, et al. The studies on the NMR spectra of mogrosides V[J]. Chin J Mag Res, 1994, 11: 43-48.

[6]SI J Y, CHEN D H, SHEN L G. Isolation and determination of cucurbitaneglycosides from fresh fruits of Siraitia grosvenorii[J]. Acta Botanica Sinica, 1996, 38: 489-494.

[7]ZHANG J Y, YANG X W. Assignment of1H and13C NMR signals of mogroside IV[J]. Chin Pharm Sci, 2003, 12: 196-200.

[8]SI J Y, CHEN D H, CHANG Q, et al. Isolation and strcture determination of flavonol glycosides from the fresh fruits of Siraitia grosvenorii[J]. Acta Pharm Sinica, 1994, 29: 158-160．

[9]李峰, 李典鵬, 蔣水元．羅漢果栽培與開發(fā)利用[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 2003.

[10]陳全斌, 義祥輝, 余麗娟, 等．不同生長周期的羅漢果鮮果中甜甙Ⅴ和總黃酮含量變化規(guī)律研究[J]. 廣西植物, 2005, 25(3): 274-277.

[11]LI Dianpeng, IKEDA T, HUANG Yonglin, et al. Seasonal variation of mogrosides in Lo Han Kuo (Siraitia grosvenori) fruits[J]. Nat Med, 2007, 61: 307-312.

[12]LI Dianpeng, IKEDA T, MATSUOKA N, et al. Cucurbitane glycosides from unripe fruits of Lo Han Kuo (Siraitia grosvenori)[J]. Chem Pharm Bull, 2006, 54(10): 1425-1428.

[13]LI Dianpeng, IKEDA T, NOHARA T, et al. Cucurbitane glycosides from unripe fruits of Siraitia grosvenori[J]. Chem Pharm Bull, 2007, 55 (7): 1082-1086.

[14]CHEN Chu, ZHANG Hao, XIAO Wei, et al. High-performance liquid chromatographic fingerprint analysis for different origins of sea buckthorn berries[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1154: 250-259.

[15]LIU Aihua, LIN Yanhua, YANG Min, et al. Development of the fingerprints for the quality of the roots of Salvia miltiorrhiza and its related preparations by HPLC-DAD and LC-MSN[J]. Journal of Chromatography B, 2007, 846: 32-41.

[16]陳全斌, 沈鐘蘇, 韋正波, 等. 羅漢果黃酮的活血化瘀藥理作用研究[J]. 廣西科學(xué), 2005, 12(4): 316-319.

HPLC Fingerprints of Siraitia grosvenorii at Different Growth Stages

LU Feng-lai，LIU Jin-lei，HUANG Yong-lin，LI Dian-peng*
(Guangxi Institute of Botany, Chinese Academy of Science, Guilin 541006, China)

In order to explore quality change of Siraitia grosvenorii, confirm the crucial growth stage and the best harvesting season, guide the production of Siraitia grosvenorii according to GAP, and establish a method of quality control, high performance liquid chromatography (HPLC) was used to analyze the fingerprints of characteristic chemical components in Siraitia grosvenorii at different growth stages. Meanwhile, quality change of Siraitia grosvenorii at different growth stages was investigated through hierarchical cluster analysis and identification of characteristic peaks. Results showed that characteristic chemical components in Siraitia grosvenorii exhibited an obvious difference at various growth stages and different cultivated varieties. Therefore, fingerprinting of characteristic chemical components was an effective and all-directional quality control strategy for traditional Chinese herbal materials and promising application values for the guidance of herbal cultivation.

Siraitia grosvenorii；chromatogram fingerprint；HPLC；hierarchical cluster analysis

O621.1

A

1002-6630(2010)18-0283-05

2010-01-14

桂林市科技經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(20070304-2)；廣西植物研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(桂植業(yè)09010)

盧鳳來(1979—)，女，助理研究員，碩士，主要從事植物資源開發(fā)與利用研究。 E-mail：lufenglai@gxib.cn

*通信作者：李典鵬(1968—)，男，研究員，博士，主要從事植物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：ldp@gxib.cn