復(fù)合酶法提取紅蘑多糖工藝

李書倩，張 博，辛 廣，于 洋，劉長(zhǎng)江*

(1.鞍山師范學(xué)院化學(xué)系，遼寧 鞍山 114007；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

復(fù)合酶法提取紅蘑多糖工藝

李書倩1,2，張 博1，辛 廣1，于 洋1，劉長(zhǎng)江2,*

(1.鞍山師范學(xué)院化學(xué)系，遼寧 鞍山 114007；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

以野生紅蘑為原料，復(fù)合酶法浸提紅蘑中真菌多糖。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得最佳多糖提取工藝，即酶解溫度60℃、纖維素酶和木瓜蛋白酶的比例為3:1(m/m)、pH5.0、酶解3h，此條件下提取多糖得率為12.0%。與傳統(tǒng)方法相比，該工藝具有提取條件溫和，提取時(shí)間較短，對(duì)多糖損傷小等特點(diǎn)。

紅蘑；多糖；提?。粡?fù)合酶

紅蘑(Gomphidius rutilus)，學(xué)名血紅鉚釘菇，具有較高的食用和藥用價(jià)值，無任何毒性，其藥用價(jià)值主要體現(xiàn)在真菌多糖的生物活性上，尚未實(shí)現(xiàn)人工培育[1]。真菌多糖在國(guó)際上被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”[2]，它能控制細(xì)胞分裂分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)衰老[3]，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒[4]、促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的生物合成、修復(fù)損傷的組織細(xì)胞等多種功效，極具醫(yī)療和食用價(jià)值[5-6]，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。因而，如何能從紅蘑中最大限度地提取多糖，且不破壞多糖的生物活性，對(duì)保持細(xì)胞健康，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，從而實(shí)現(xiàn)人體健康有重要的意義[7-8]。

食用菌多糖的提取工藝近年來研究很多，但有關(guān)紅蘑多糖的提取工藝的研究還未見報(bào)道[9]。傳統(tǒng)工藝有熱水浸提法、酸提法、堿提法等，新興工藝包括酶提法、超聲波輔助法、微波輔助浸提法等[10]。其中熱水浸提法是最為經(jīng)典的方法，以工藝簡(jiǎn)單，易于推廣等特點(diǎn)為人們所接受，但其提取率較低[11-12]；酸提和堿提都易破壞真菌多糖的生物活性[13]；超聲波輔助法和微波輔助浸提法都只是一種輔助的提取方法[14]。相對(duì)而言，酶法的提取工藝比較溫和[15]。因此，本研究通過采用復(fù)合酶法破壁，對(duì)野生紅蘑中粗多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而得出最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生紅蘑 市購，烘干、粉碎過40目篩備用。

纖維素酶(酶活力1.0×106～2.0×106U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力1.0×105～2.0×106U/g)為生化試劑 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無水乙醇、氫氧化鈉、丙酮、苯酚、石油醚、濃硫酸、濃鹽酸(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ102型微型植物粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DZF型真空干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；DELTA320pH酸度劑、PL2002電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅磨多糖提取工藝[14-15]

工藝流程：野生紅蘑→烘干至質(zhì)量恒定→粉碎→稱量→酶解→滅酶→減壓抽濾→濃縮→濾液醇析→減壓抽濾→沉淀物→洗滌→烘干→粗多糖制品。

操作要點(diǎn)：稱取2g紅蘑干粉，按1:40(g/mL)的料液比加入蒸餾水，加入體積分?jǐn)?shù)0.3%的復(fù)合酶液在一定溫度和pH值下酶解一定時(shí)間，升溫滅酶1.5h，進(jìn)行減壓抽濾，得到的濾液減壓濃縮至1/3體積，加入3倍體積的無水乙醇，靜置24h，依次用乙醇、丙酮、乙醚洗滌多糖除去部分的脂肪和蛋白質(zhì)，50℃條件下干燥多糖，稱量。

1.3.2 多糖測(cè)定

用干重法計(jì)算粗多糖的質(zhì)量，用苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量確定多糖純度[16-18]。

1.3.3 多糖提取的單因素試驗(yàn)[19]

紅蘑中的多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合于細(xì)胞中，用纖維素酶處理可以破碎細(xì)胞的細(xì)胞壁，木瓜蛋白酶可以破壞多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合力，使多糖易于從細(xì)胞中釋放出來。選取復(fù)合酶比例按質(zhì)量比4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、酶解溫度(50、55、60、65℃)、酶解時(shí)間(1、2、3、4h)及pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)這4個(gè)因素考察各因素對(duì)紅蘑多糖得率的影響。

1.3.4 多糖提取的正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)L9(34)設(shè)計(jì)，優(yōu)化提取工藝。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用極差法進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 復(fù)合酶比例對(duì)多糖得率的影響

分別驗(yàn)證纖維素酶和木瓜蛋白酶的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其結(jié)果均為0.3%，故設(shè)定復(fù)合酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%。改變纖維素酶與木瓜蛋白酶的質(zhì)量配比，即4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，在60℃，正常pH值條件下，酶解2h，測(cè)定粗多糖含量，選出最佳區(qū)間，結(jié)果見圖1。

圖1 復(fù)合酶比例對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of cellulase/papain mass ratio on polysaccharide yield

由圖1可知，多糖的得率取決于纖維素酶的含量，纖維素酶含量下降，則粗多糖的得率也隨之下降，這可能是由于纖維素酶含量下降，酶與底物接觸機(jī)會(huì)減少，破壁效果減弱，不利于多糖從細(xì)胞中釋放出來。而木瓜蛋白酶主要使多糖與結(jié)合的蛋白分開，提高多糖的得率，但與蛋白結(jié)合的多糖未從細(xì)胞中溶出，則不利于木瓜蛋白酶作用的發(fā)揮。如果繼續(xù)增加纖維素比例(4:1)，則多糖得率增加不明顯，考慮成本等因素，選擇纖維素酶與木瓜蛋白酶比例3:1、2:1、1:1進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.2 復(fù)合酶溫度對(duì)多糖得率的影響

分別驗(yàn)證纖維素酶和木瓜蛋白酶的有效溫度，試驗(yàn)表明，纖維素酶的有效溫度為45～65℃，木瓜蛋白酶的有效溫度為50～90℃，故選取復(fù)合酶的溫度為50～65℃，即在纖維素酶與木瓜蛋白酶比例為3:1，正常pH值，復(fù)合酶溫度為50、55、60、65℃的條件下酶解2h，測(cè)定粗多糖含量，選出最佳區(qū)間，結(jié)果見圖2。

圖2 復(fù)合酶溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on polysaccharide yield

由圖2可知，隨著溫度的升高，粗多糖的得率不斷增高，當(dāng)溫度升高到60℃后，溫度的升高反而會(huì)降

低粗多糖的得率。這是因?yàn)闇囟壬?，反?yīng)物的能量增大，使反應(yīng)速率加快，超過其最適溫度后，酶活減弱，所以反應(yīng)速度會(huì)隨著溫度的升高迅速下降，故選擇作用溫度50、55、60℃進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

其他條件不變，分別采用1、2、3、4h提取紅蘑多糖，測(cè)定粗多糖含量，選出最佳區(qū)間，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on polysaccharide yield

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，粗多糖得率也不斷上升，但時(shí)間達(dá)到3h后粗多糖的得率會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，這可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致部分多糖結(jié)構(gòu)破壞，使粗多糖的得率下降。因此在3h周圍選擇作用溫度2.5、3、3.5h進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.4 復(fù)合酶最適pH值的確定

其他反應(yīng)條件不變，分別在pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)，以pH值為橫坐標(biāo)，粗多糖得率為縱坐標(biāo)作圖，選出最佳區(qū)間，結(jié)果見圖4。

圖4 復(fù)合酶pH值對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of pH on polysaccharide yield

由圖4可知，復(fù)合酶的最適pH區(qū)間為4.0～6.0，以5.0為最好，這是因?yàn)閜H值可改變能影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離。在最適pH值時(shí)，酶分子上活性基團(tuán)的解離狀態(tài)最適于與底物結(jié)合。pH值高于或低于最適pH值時(shí)，活性基團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生改變，酶和底物的結(jié)合力降低，因而酶反應(yīng)速度降低。因此，在pH5.0周圍選擇pH4.5、5.0、5.5進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝。選擇酶解時(shí)間、酶解溫度、纖維素酶與木瓜蛋白酶的比例和pH值4個(gè)對(duì)多糖提取影響較大的因素，設(shè)計(jì)L9(34)的正交試驗(yàn)，因素水平編碼如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

2.2.2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果如表2如示，通過極差分析，復(fù)合酶法提取紅蘑中的粗多糖最優(yōu)條件預(yù)測(cè)為A2B3C1D2，即酶解3h、酶解溫度60℃、纖維素酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為3:1、pH5.0。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表3 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 3 Verification of optimal extraction conditions

采用優(yōu)化工藝提取紅蘑多糖，即酶解3h、酶解溫度60℃、纖維素酶和木瓜蛋白酶的比例為3:1、pH5.0

的條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3，粗多糖得率為12.0%，比正交試驗(yàn)中各處理的結(jié)果都高，證明正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果有效。采用苯酚-硫酸法測(cè)定粗多糖中多糖含量，得其純度為78.17%。

3 討論與結(jié)論

為了保證多糖提取率，同時(shí)避免樣品處理間的環(huán)境誤差，采用1:40(g/mL)的料液比提取紅蘑中的多糖，但對(duì)于提取液進(jìn)行濃縮時(shí)會(huì)耗時(shí)耗能，所以在進(jìn)行后續(xù)的中試時(shí)還需進(jìn)一步優(yōu)化料液比，以期提高工業(yè)生產(chǎn)效率。采用纖維素酶與蛋白酶提取紅蘑多糖，在提取過程中不可避免的增加紅蘑中蛋白質(zhì)的總含量，但在后續(xù)的多糖分離與純化的過程中將采用Sevag法去除粗多糖中的總蛋白，因此酶對(duì)于蛋白總量的影響可以忽略不計(jì)。

本研究采用單因素與正交試驗(yàn)相結(jié)合，優(yōu)化復(fù)合酶法提取紅蘑中的粗多糖工藝，其最優(yōu)提取條件為A2B3C1D2，即酶解3h、酶解溫度60℃、纖維素酶和木瓜蛋白酶的比例3:1(m/m)、pH5.0，粗多糖得率可達(dá)12.0%。與此前進(jìn)行的經(jīng)典水提法相比(熱水浸提紅蘑多糖得率為8%)，得率有了較大的提高，且具備提取條件溫和，提取時(shí)間有所縮短，對(duì)多糖損傷小等特點(diǎn)，為紅蘑人工培育成功后的多糖利用及工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

[1]上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所. 中國(guó)食用菌志[M]. 北京: 中國(guó)林業(yè)出版社, 1991: 97-98.

Double-enzyme Method for Polysaccharides Extraction from Gomphidius rutilus Fruitbodies

LI Shu-qian1,2，ZHANG Bo1，XIN Guang1，YU Yang1，LIU Chang-jiang2,*
(1. Department of Chemistry, Anshan Normal University, Anshan 114007, China；2. College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)

For polysaccharide extraction, wild Gomphidius rutilus fruit bodies were hydrolyzed with cellulase and papain together. Based on single factor investigations, orthogonal array design was employed to optimize the hydrolysis process, and the optimum hydrolysis conditions were found as follows: hydrolysis temperature 60 ℃; cellulase/papain mass ratio 3:1; pH 5.0; and hydrolysis duration 3 h and the polysaccharide yield obtained under such conditions was 12.0%. This method has many advantages over conventional methods, such as gentle reaction conditions, time saving and less destructive effect on polysaccharide structure.

Gomphidius rutilus；polysaccharide；extraction；compound enzymes

TS201.22

A

1002-6630(2010)18-0143-04

2010-06-07

鞍山科技計(jì)劃項(xiàng)目(08SF24)

李書倩(1975—)，女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：susanli52@163.com

*通信作者：劉長(zhǎng)江(1955—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：liucj597@sohu.com