甘草苷抗腦缺血再灌注炎性損傷研究

孫雅煊，劉 婷，戴雪伶，高兆蘭，魏 榮，鄭秋生

(1.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191；2. 中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所，甘肅 蘭州 730000；3. 石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832003)

甘草苷抗腦缺血再灌注炎性損傷研究

孫雅煊1,2，劉 婷3，戴雪伶1，高兆蘭1，魏 榮1，鄭秋生3

(1.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191；2. 中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所，甘肅 蘭州 730000；3. 石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832003)

目的：探討甘草苷抗小鼠腦缺血再灌注炎性損傷作用及機(jī)制。方法：將ICR小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組(依達(dá)拉奉3mg/(kg bw·d)和甘草苷高、中、低劑量(40、20、10mg/(kg bw·d))組。采用線栓法建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型，缺血2h再灌注22h后，觀察腦組織病理學(xué)變化、測定髓過氧化物酶(MPO)活性，檢測細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達(dá)。結(jié)果：與模型組相比，甘草苷可明顯減輕腦組織病理學(xué)改變，降低MPO活性及ICAM-1表達(dá)。結(jié)論：甘草苷具有抗腦缺血再灌注炎性損傷活性。

甘草苷；腦缺血再灌注；炎性損傷；髓過氧化物酶；細(xì)胞間黏附因子-1

腦缺血是一種具有發(fā)病率高、致殘率高、致死率高、復(fù)發(fā)率高等特點的腦血管疾病，而腦血管疾病與癌癥、心臟病一并構(gòu)成人類三大死亡原因[1-3]。目前，已有多種溶栓藥物被用于腦缺血治療，但伴隨著溶栓治療的進(jìn)展，強(qiáng)烈需求適合于抗腦缺血再灌注損傷藥物，以遏制再灌注所引起的腦組織的進(jìn)一步損傷[4]。研究表明腦缺血再灌注損傷與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、鈣超載、細(xì)胞凋亡等有關(guān)，其中炎癥反應(yīng)是研究熱點之一[5-6]。甘草中多種活性物質(zhì)被證實具有抗腦缺血再灌注損傷作用，但甘草中另一活性成分——甘草苷，雖已有研究表明其具有抗氧化、抗抑郁、護(hù)肝、神經(jīng)及心臟保護(hù)等活性[7-12]，然而目前尚無有關(guān)其抗腦缺血再灌注炎性損傷研究報道。

本實驗擬采用線栓法制備小鼠大腦中動脈栓塞模型，研究甘草苷對腦缺血再灌注炎性損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

雄性ICR小鼠，體質(zhì)量25～28g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2007-001。自然光照周期飼養(yǎng)，術(shù)前12h禁食，自由飲水。

甘草苷(純度≥98%) 天津尖峰天然產(chǎn)物公司；依達(dá)拉奉 南京先聲東元制藥有限公司；髓過氧化物酶(MPO)測試盒 南京建成生物工程研究所；細(xì)胞間黏附

分子-1(ICAM-1)抗體 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

IX51倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司；多功能酶標(biāo)儀 Sigma公司；TGL 16M離心機(jī)湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；渦旋混合器 金壇市醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

ICR小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、 陽性對照組(依達(dá)拉奉3mg/(kg bw·d))和甘草苷高、中、低劑量(40、20mg/(kg bw·d)和10mg/(kg bw·d)組，每組8只。其中假手術(shù)組和模型組均灌胃給予等體積的0.5%的羧甲基纖維素鈉。各組動物均于手術(shù)前連續(xù)給藥3d，每天1次，第3天給藥1h后采用線栓法制備小鼠大腦中動脈栓塞模型。

1.2.2 腦缺血再灌注模型制備

將小鼠用4g/100mL水合氯醛(400mg/(kg bw·d))麻醉后，仰臥固定，常規(guī)消毒，沿頸部中線切開皮膚，分離皮下筋膜及肌肉組織。手術(shù)顯微鏡下分離左側(cè)頸總動脈(CCA)及其頸內(nèi)動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)。根部結(jié)扎ECA，夾閉CCA和ICA。在CCA上開一小口，將魚線沿著CCA，穿過ICA和ECA分叉處進(jìn)入ICA。松開ICA，繼續(xù)將魚線插入到ICA顱內(nèi)段。自ICA起始部的插入長度約為1.2cm，表明線的頭端已穿過大腦中動脈起始部，結(jié)扎CCA和ICA。術(shù)中白熾燈加溫，維持小鼠肛溫約37℃。術(shù)后縫合傷口，動物回籠。缺血2h后拔出線栓至ECA和ICA分叉處，實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組小鼠僅施行手術(shù)而不插入魚線。

1.2.3 組織病理學(xué)觀察

缺血2h再灌22h后，將小鼠深度麻醉，迅速打開胸腔，暴露心臟，用鑷子捏住心臟，將針頭從心尖部位插入，向上進(jìn)針到升主動脈，用剪刀在右心房處剪一小口，灌注4g/100mL多聚甲醛，直至回流液變清后，斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，然后冠狀切4刀，共5片。第一刀在腦前極與視交叉連線中點處，第二刀在視交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄與葉尾極之間，取視交叉部位與漏斗柄部位之間腦組織。用4g/100mL多聚甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋，作連續(xù)切片，切片厚度為5μm，進(jìn)行常規(guī)HE染色，觀察病理形態(tài)學(xué)改變。

1.2.4 腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性測定

將小鼠斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，然后冠狀切4刀，共5片。第一刀在腦前極與視交叉連線中點處，第二刀在視交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄與葉尾極之間，取視交叉部位與漏斗柄部位之間腦組織，利用試劑盒提供的勻漿介質(zhì)，將腦組織制成10%的組織勻漿，按照MPO試劑盒說明書進(jìn)行操作。考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達(dá)檢測

石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，水化后，滴加ICAM-1一抗，按試劑盒說明書常規(guī)SABC法對標(biāo)本進(jìn)行染色，DAB顯色，蒸餾水沖洗、脫水、透明、封片。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。每張切片在缺血區(qū)隨機(jī)采集高倍(×400)視野，觀察ICAM-1陽性表達(dá)細(xì)胞。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0 For Windows統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)均以表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織病理學(xué)變化

圖1 腦缺血再灌注小鼠腦組織病理學(xué)觀察(×400)Fig.1 Histopathological observation on mouse brain tissue with cerebral ischemia/reperfusion inflammatory injury (×400)

由圖1可知，假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，核膜清楚，未見神經(jīng)細(xì)胞變性壞死及間質(zhì)水腫等明顯病理變化。模型組神經(jīng)細(xì)胞及血管周圍間隙增大，間質(zhì)水腫明顯，形成軟化灶，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，出現(xiàn)不同程度的核深染、核固縮、核溶解、核體不規(guī)則。甘草苷處理組與模型組相比，組織病理學(xué)變化較輕，僅有輕微水腫，軟化灶減小，核固縮、核深染程度有不同程度減輕。結(jié)果表明甘草苷能減輕腦缺血再灌注小鼠腦組織損傷。

2.2 腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性

由表1可見，小鼠在腦缺血2h再灌注22h后，腦組織MPO活性明顯升高，模型組與假手術(shù)組相比差異顯著。與模型組比較，甘草苷高、中、低劑量組MPO活性顯著下降，并呈劑量依賴性，提示甘草苷可抑制中性粒細(xì)胞的浸潤。

表1 甘草苷對小鼠腦缺血再灌注后MPO活性的影響(n=8)Table 1 Effect of liquiritin on MPO activity in mice after cerebral ischemia/reperfusion (n=8)

2.3 細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達(dá)

圖2 甘草苷對小鼠腦缺血再灌注后ICAM-1表達(dá)的影響(×400)Fig.2 Effect of liquiritin on ICAM-1 expression in mice after cerebral ischemia/reperfusion (×400)

細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)陽性表達(dá)為胞漿呈棕黃色。由圖2可知，假手術(shù)組少見細(xì)胞陽性表達(dá)且呈弱陽性表達(dá)，模型組陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量較多，表達(dá)強(qiáng)度也較強(qiáng)。與模型組相比，甘草苷各劑量組陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量減少，表達(dá)強(qiáng)度減弱。因此，甘草苷可有效抑制ICAM-1的表達(dá)。

3 討 論

目前，早期溶栓是治療腦缺血最有效的措施之一，但溶栓后再灌注所引起的并發(fā)癥限制著溶栓治療的推廣。研究表明，炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中起著關(guān)鍵作用，包括白細(xì)胞的激活浸潤和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)等，因此阻斷炎癥反應(yīng)是減輕腦缺血再灌注損傷的理想方法[13-15]。

中性粒細(xì)胞嗜天青顆?；騿魏思?xì)胞中的髓過氧化物酶(MPO)可作為中性粒細(xì)胞的標(biāo)記物，利用其還原過氧化氫能力分析其活力，可反映中性粒細(xì)胞在組織中浸潤程度和分布，以定量反映炎性損傷程度。相關(guān)文獻(xiàn)報道腦缺血再灌注6h后，出現(xiàn)白細(xì)胞浸潤，浸潤高峰出現(xiàn)在24～36h，6d后恢復(fù)正常[16-17]。本實驗結(jié)果表明缺血2h再灌注22h后，模型組MPO活性顯著升高，進(jìn)一步證實腦缺血再灌注后存在炎癥反應(yīng)。灌胃給予甘草苷治療，可明顯降低缺血再灌注后腦組織MPO活性，減輕中性粒細(xì)胞浸潤，抑制炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)是參與腦缺血炎癥反應(yīng)的重要因子，存在于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞，在缺血再灌注時表達(dá)增多。ICAM-1與白細(xì)胞受體作用接到白細(xì)胞的黏附及遷移，促進(jìn)白細(xì)胞缺血區(qū)浸潤。白細(xì)胞又能增加ICAM-1表達(dá)，兩者相互作用，從而加重缺血再灌注后腦組織炎性損傷，形成惡性循環(huán)[18-19]。在本實驗中，與假手術(shù)組比較，模型組ICAM-1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量增加，表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，再次驗證了腦缺血再灌注可促進(jìn)炎癥反應(yīng)。結(jié)果顯示，甘草苷能有效地抑制腦組織中ICAM-1的表達(dá)，減輕腦缺血再灌注所引起的炎性損傷。

總而言之，甘草苷可通過降低MPO活性及ICAM-1表達(dá)減輕腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮其抗腦缺血再灌注損傷作用。

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Protective Effect of Liquiritin against Cerebral Ischemia/Reperfusion Inflammatory Injury in Mice

SUN Ya-xuan1,2，LIU Ting3，DAI Xue-ling1，GAO Zhao-lan1，WEI Rong1，ZHENG Qiu-sheng3
(1. College of Appllied Sciences and Humanities, Beijing Union University, Beijing 100191, China；2. Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China；3. Department of Pharmacy, Shihezi University, Shihezi 832003, China)

Objective: To investigate the protective effect and mechanism of liquiritin against cerebral ischemia/reperfusion inflammatory injury in mice. Methods: ICR mice were randomly divided into sham group, model group, positive control group (intraperitoneally administered edaravone, 3 mg/(kg bw·d)), and liquiritin groups (intragastrically administered, 40, 20 mg/(kg bw·d) and 10 mg/(kg bw·d)). Focal cerebral ischemia/reperfusion models were set up by using intraluminal filament method. After cerebral ischemia for 2 h and subsequent reperfusion for 22 h, histopathology changes were monitored, and the activity of MPO and the expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) in brain tissue were measured. Results: Compared with the model group, liquiritin noticeably decreased the activity of MPO and the expression of ICAM-1. Conclusion: Liquiritin has protective effects against cerebral ischemic/reperfusion inflammatory injury.

liquiritin；cerebral ischemia/reperfusion；inflammatory injury；MPO；intercellular adhesion molecule-1

R931.71

A

1002-6630(2010)23-0353-03

2010-03-22

北京聯(lián)合大學(xué)校級課題資助項目(zk200905x)

孫雅煊(1970—)，女，副教授，博士，研究方向為神經(jīng)生物學(xué)。E-mail：sunxx@ygi.edu.cn