• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    單核細(xì)胞增多性李斯特菌p60蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

    2010-03-23 05:36:30曹正茂武海濤王小紅
    食品科學(xué) 2010年23期
    關(guān)鍵詞:李斯特菌體可溶性

    呂 添,曹正茂,武海濤,王小紅*

    (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)

    單核細(xì)胞增多性李斯特菌p60蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

    呂 添,曹正茂,武海濤,王小紅*

    (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)

    在成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-p60和獲得重組宿主菌E.coli BL21(DE3)的基礎(chǔ)上,對(duì)重組宿主菌E.coli BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)p60蛋白條件的優(yōu)化研究。結(jié)果表明:將重組大腸桿菌培養(yǎng)至OD600nm達(dá)0.7~0.8左右時(shí),加入濃度為1mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),在搖床溫度為25℃,轉(zhuǎn)速為150r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)6h,可得到重組表達(dá)的p60蛋白占總蛋白的比例為42.32%,其中可溶性蛋白占總p60蛋白的比例為85.36%左右,為p60蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件。

    單核細(xì)胞增多性李斯特菌;p60蛋白;表達(dá)條件;優(yōu)化

    單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是李斯特菌屬(Listeria)中最重要的人類(lèi)食源性病原菌[1],呈世界性分布。該菌具有低溫生長(zhǎng)的特性,在冷藏食品中容易達(dá)到感染致病所需的菌量,是冷藏食品和即食食品污染的重要致病菌之一[2]。LM可導(dǎo)致人和動(dòng)物的敗血癥、腦膜炎及流產(chǎn)等,病死率高達(dá)30%~70%[3-4]。因此,建立快速而有效的LM檢測(cè)方法是目前針對(duì)冷藏食品安全的研究熱點(diǎn)之一。LM是典型的胞內(nèi)寄生菌,由其主要毒力因子iap基因編碼的p60蛋白,是LM的保護(hù)性免疫中一個(gè)重要的抗原成分,也能刺激機(jī)體B細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng),并與該菌的侵襲性密切相關(guān)[5-6]。p60蛋白分子質(zhì)量為60kD,由478個(gè)氨基酸殘基所組成,含有一個(gè)Thr-Asn的重復(fù)序列區(qū)域,具有水解酶和酰胺酶活性,其N(xiāo)端和C端區(qū)域都具有高度的保守性,是目前研究LM新型疫苗及建立快速檢測(cè)方法的首選對(duì)象[7]。為此,國(guó)內(nèi)外學(xué)者根據(jù)單增李斯特菌iap基因的序列,利用分子生物學(xué)的方法對(duì)其表達(dá)的p60蛋白進(jìn)行克隆表達(dá)方面的研究[8-9],但對(duì)表達(dá)菌株培養(yǎng)表達(dá)p60蛋白的條件研究比較少。

    本研究在成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-p60并轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coli BL21(DE3)的基礎(chǔ)上[10],進(jìn)一步研究與重組菌的高效表達(dá)相關(guān)的幾個(gè)重要培養(yǎng)條件,如誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、生長(zhǎng)環(huán)境的溫度、誘導(dǎo)時(shí)間以及誘導(dǎo)過(guò)程中氧氣含量等對(duì)p60蛋白表達(dá)的影響。旨在用最經(jīng)濟(jì)的方法大量制備p60蛋白,并在提高表達(dá)量的前提下,盡量讓目的蛋白以可溶性形式表達(dá),減少無(wú)活性

    的不可溶的包涵體的產(chǎn)生,同時(shí)也免去變性與復(fù)性的純化過(guò)程,使蛋白純化更簡(jiǎn)便、更經(jīng)濟(jì),為進(jìn)一步研究p60蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和建立李斯特菌快速免疫檢測(cè)方法提供實(shí)驗(yàn)參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 菌種

    重組表達(dá)載體pET-28a-iap和重組宿主菌E.coli BL21 (DE3)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[10]。

    1.1.2 試劑

    異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG) Sigma公司,卡那霉素(Kanamycin) 昆明杰渾生物技術(shù)有限公司;蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker Fermentas公司;其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

    1.1.3 儀器與儀器

    VD-1320超凈工作臺(tái) 哈爾濱東聯(lián)電子有限公司;722N可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;超聲波破碎儀 美國(guó)Sonics and Materials公司;迷你型垂直板電泳型凝膠電泳儀 北京六一儀器廠(chǎng)。

    1.2 方法

    1.2.1 重組菌的培養(yǎng)

    無(wú)菌操作條件下,將重組菌E.coli BL21(DE3)接種于5mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h后,將培養(yǎng)物按體積比1:100接種于50mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.5左右,加入一定量的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

    1.2.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)蛋白表達(dá)量的影響

    分別在重組菌培養(yǎng)至OD600nm值為0.16、0.33、0.54、0.77、1.09、1.36時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mmol/L,37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)5h后,取培養(yǎng)液于離心管中,5000r/min 離心5min收集菌體。沉淀用0.02mol/L pH7.4 PBS緩沖液重懸,按體積比4:1加入5×上樣緩沖液,于沸水中煮5min后將樣品進(jìn)行不連續(xù)SDS-PAGE電泳(濃縮膠5%、分離膠12%)。電泳后的凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液于搖床上振蕩30min進(jìn)行染色,然后用0.5mol/L NaCl脫色液進(jìn)行多次脫色至背景色被脫去[11]。脫色后的凝膠于凝膠成像系統(tǒng)下拍照,使用Bandscan[12]和Quantity one[13]軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

    1.2.3 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響

    在重組菌培養(yǎng)至OD600nm為0.5左右時(shí),將培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)中分裝于無(wú)菌三角瓶中,加入終濃度分別為0、0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、1、2、5mmol/L的IPTG,37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)5h后,按照1.2.2節(jié)的方法收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

    1.2.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量的影響

    將重組菌培養(yǎng)至OD600nm為0.5左右時(shí),將培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)中分裝于無(wú)菌三角瓶中,加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L,分別于37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7 h后取出,按照1.2.2節(jié)的方法收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

    1.2.5 誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)量及可溶性的影響

    將重組菌培養(yǎng)至OD600nm為0.5左右時(shí),將培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)中分裝于無(wú)菌三角瓶中,加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L,分別于37、30、25℃下200r/min振蕩培養(yǎng)5h,離心收集菌體,加入10mL 0.02mol/L pH7.4 PBS緩沖液重懸,置于冰浴中用超聲探頭進(jìn)行超聲波間歇破碎15min(超聲5s,間隔5s),8000r/min離心30min分離上清和沉淀,將上清轉(zhuǎn)移至另一容器,沉淀用10mL 0.02mol/L pH7.4 PBS緩沖液進(jìn)行重懸,各取20μL加入5μL 5×上樣緩沖液后進(jìn)行不連續(xù)SDS-PAGE電泳分析。

    1.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白表達(dá)量及可溶性的影響

    將重組菌培養(yǎng)至OD600nm為0.5左右時(shí),將培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)中分裝于無(wú)菌三角瓶中,加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L,在30℃下分別于100、150、200r/min振蕩培養(yǎng)5h,離心收集菌體,按1.2.5節(jié)中的操作對(duì)菌體進(jìn)行超聲處理和SDS-PAGE電泳分析。

    1.2.7 最佳誘導(dǎo)條件下p60蛋白的表達(dá)分析

    根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳誘導(dǎo)條件,并在此條件下進(jìn)行p60蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),分析p60蛋白的表達(dá)量和可溶性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)蛋白表達(dá)量的影響

    圖1 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)p60蛋白表達(dá)量的影響SDS-PAGE分析Fig.1 Effect of time of IPTG addition on expression of p60 protein examined by SDS-PAGE

    誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果如圖1所示,當(dāng)OD600nm值小于0.77

    時(shí),p60蛋白表達(dá)量隨OD600nm值增大而增加,可達(dá)到最大值38.3%,而OD600nm值繼續(xù)增大時(shí),表達(dá)量反而下降到36.2%。表明過(guò)早加入誘導(dǎo)劑,會(huì)使菌體很早就誘導(dǎo)表達(dá)p60蛋白,增加菌體的負(fù)擔(dān),不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。而加入過(guò)遲,細(xì)菌生長(zhǎng)開(kāi)始次級(jí)代謝,且培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分不夠,不利于蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。因此在OD600nm為0.77時(shí),最適宜菌體的生長(zhǎng)與p60蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

    2.2 不同IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響

    圖2 IPTG濃度對(duì)p60蛋白表達(dá)量影響的SDS-PAGE分析Fig.2 Effect of final IPTG concentration on expression of p60 protein examined by SDS-PAGE

    如圖2所示,IPTG濃度為0~1mmol/L時(shí),蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)劑濃度增大而增加,p60蛋白表達(dá)量可達(dá)到38.9%,但再增加IPTG濃度,表達(dá)量反而下降到36.1%。說(shuō)明當(dāng)IPTG濃度增加時(shí),促進(jìn)p60蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。但濃度過(guò)高,會(huì)使菌體負(fù)荷過(guò)大,對(duì)菌體造成了毒害作用,不利于菌體的生長(zhǎng),而使蛋白表達(dá)量減少。所以IPTG誘導(dǎo)p60蛋白表達(dá)的最佳濃度可選擇為1mmol/L。

    2.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量的影響

    如圖3所示,在加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)后,蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間在0~6h之間時(shí),蛋白表達(dá)量與菌體量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,在6h時(shí)表達(dá)量達(dá)到40.3%,菌體量達(dá)到6.49g/L,而6~7h之間,表達(dá)量略微增加到40.8%,但菌體量下降到6.41g/L??赡苁怯捎谥亟M菌在誘導(dǎo)后,大量的能量會(huì)消耗在外源蛋白的表達(dá)上,致使菌體的生長(zhǎng)提前進(jìn)入衰亡期,如果不及時(shí)收獲會(huì)造成溶菌現(xiàn)象的發(fā)生。因此選擇最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為6h。

    圖3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)p60蛋白表達(dá)量影響的分析Fig.3 Effect of induction time on expression of p60 protein examined by SDS-PAGE

    2.4 誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)量及表達(dá)形式的影響

    實(shí)驗(yàn)過(guò)程中為了比較不同培養(yǎng)溫度對(duì)p60蛋白表達(dá)的影響,將可溶性p60蛋白生產(chǎn)能力定義為上清液中p60蛋白占總蛋白含量×終濃度OD600nm值[14-15],以觀(guān)察可溶性p60蛋白表達(dá)量的變化。如表1所示,隨著溫度的升高,上清液中p60蛋白在總蛋白中的含量逐漸降低,在37℃時(shí)達(dá)13.91%,而在沉淀中的含量逐漸增加到9.24%。隨著溫度的升高,菌體濃度(OD600nm值)先增大后減小,這說(shuō)明重組菌在較高的溫度下生長(zhǎng)較快,適當(dāng)降低溫度有利于產(chǎn)物的表達(dá)和增加產(chǎn)物可溶性。而溫度過(guò)高時(shí),菌體的比生長(zhǎng)速率較高,培養(yǎng)過(guò)程中容易積累代謝副產(chǎn)物,反過(guò)來(lái)又抑制菌體的生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物的表達(dá)[16-17],綜合比較溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)速率與蛋白可溶性的影響,選擇25℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

    2.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白表達(dá)量及表達(dá)形式的影響

    表1 誘導(dǎo)溫度對(duì)p60蛋白表達(dá)量及可溶性的影響Table 1 Effect of induction temperature on production and solubility of p60 protein

    表2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)p60蛋白表達(dá)量及可溶性的影響Table 2 Effect of shaker speed on production and solubility of p60 protein

    如表2所示,隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加,上清液中p60蛋白占總蛋白的含量逐漸降低,在200r/min時(shí)達(dá)15.43%,而在沉淀中的含量逐漸增加到8.89%。培養(yǎng)時(shí)的轉(zhuǎn)速會(huì)影響培養(yǎng)基中的溶氧量、影響細(xì)菌的生長(zhǎng)速率和蛋白表達(dá)的速率,當(dāng)轉(zhuǎn)速為150r/min時(shí),供氧量適中,滿(mǎn)足了重組菌的生長(zhǎng)需求,所以重組菌的生長(zhǎng)和重組蛋白的表達(dá)情況良好,當(dāng)?shù)娃D(zhuǎn)速(100r/min)時(shí),不能保證充足的供氧,重組菌生長(zhǎng)慢,p60蛋白表達(dá)情況不佳。當(dāng)高轉(zhuǎn)速(200r/min)時(shí),供氧量過(guò)大,菌體的比生長(zhǎng)速率較高,培養(yǎng)過(guò)程中容易積累代謝副產(chǎn)物,且因生長(zhǎng)速率過(guò)快,容易使目的蛋白沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行正確折疊而形成包涵體,影響目的蛋白的可溶性。綜合比較轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)速率與蛋白可溶性的影響,選擇150r/min為誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的最佳轉(zhuǎn)速。

    2.6 最佳誘導(dǎo)條件下的p60蛋白的表達(dá)分析

    綜合上述各優(yōu)化條件,選擇在重組菌OD600nm為0.7~0.8時(shí),加入濃度為1mmol/L的IPTG,在溫度為25℃,搖床轉(zhuǎn)速為150r/min培養(yǎng)條件下,誘導(dǎo)表達(dá)6h,可得到重組表達(dá)的p60蛋白占總蛋白的含量為42.32%,其中可溶性蛋白占總p60蛋白含量的85.36%左右,為p60蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件。

    3 討 論

    基因工程菌株培養(yǎng)與發(fā)酵的目的是希望其外源基因能夠高水平表達(dá),以便獲得大量的外源基因產(chǎn)物。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白可占菌體總蛋白的10%~50%,其表達(dá)產(chǎn)物通常以可溶和不可溶(即包涵體)形式存在,為了提高目的蛋白的活性和質(zhì)量,就要選擇合適的條件,盡量讓目的蛋白以可溶形式表達(dá),減少無(wú)活性的不可溶的包涵體的產(chǎn)生[18],同時(shí)也免去了變性與復(fù)性的純化過(guò)程,使蛋白純化更簡(jiǎn)便、更經(jīng)濟(jì)。另外,可溶表達(dá)形式的外源蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中能正確折疊,從而獲得特定空間結(jié)構(gòu)和生物功能,最終獲得高純度、高活性的目的蛋白[19]。

    本研究在成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-p60和獲得重組宿主菌BL21(DE3)的基礎(chǔ)上[20],進(jìn)一步研究重組菌的培養(yǎng)條件,對(duì)重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)p60蛋白時(shí)的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和搖床轉(zhuǎn)速5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,獲得了p60蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件,得到的重組p60蛋白有較高的表達(dá)量和較好的可溶性。

    [1]CHI-ZHANG Y D, YAM K L, CHIKINDAS M L, et al. Effective control of Listeria monocytogenes by combination of nisin formulated and slowly released into a broth system[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 90(1): 15-22.

    [2]李小春, 陳慧燕, 李毅, 等. 速凍食品中李斯特菌檢測(cè)方法探討與結(jié)果分析[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2004, 14(1): 88-89.

    [3]余淑冰, 梁景濤, 周強(qiáng)忠, 等. 單核細(xì)胞增生李斯特菌污染調(diào)查及快速檢驗(yàn)方法的比較[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 1998, 32(4): 240-241.

    [4]ROWAN N J, CANDLISH A G, BUBERT A, et al. Virulent rough filaments of Listeria monocytogenes from clinical and food samples secreting wild-type levels of cell-free p60 protein[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2000, 38(7): 2643-2648.

    [5]BUBERT A, SCHUBERT P, KOHLER S, et al. Synthetic peptides derived from the Listeria monocytogenes p60 protein as antigens for the generation of polyclonal antibodies specific for secreted cell-free L.monocytogenes p60 proteins[J]. Appl Environ Microbiol, 1994, 60 (9): 3120-3127.

    [6]BUBERT A, HEIN I. Detection and differentiation of Listeria spp. by a single reaction based on multiplex PCR[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(10): 4688-4692.

    [7]江玲麗. 單核細(xì)胞增多性李斯特菌的主要毒力基因分析及其重組菌構(gòu)建與免疫原性[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2006.

    [8]王俊霞. 單核細(xì)胞增生性李斯特菌p60蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)及其免疫原性研究[D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2007.

    [9]YU K Y, NOH Y, CHUNG M, et al. Use of monoclonal antibodies that recognize p60 for identification of Listeria monocytogenes[J]. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2004, 11(3): 446-451.

    [10]呂添, 武海濤, 曹正茂, 等. 單核細(xì)胞增多性李斯特菌iap基因的克隆、表達(dá)與p60蛋白的純化[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(11): 157-161.

    [11]郭堯君. 蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1999: 54-105.

    [12]劉照惠, 邵麗君, 李猛, 等. HBV PreS2-MBP融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)條件的優(yōu)化[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2007, 20(6): 435-438.

    [13]王妍, 林青, 謝金梅, 等. 薄層色譜結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定小鼠表皮神經(jīng)酰胺含量[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2008, 19(4): 281-282.

    [14]楊梅, 程安春, 汪銘書(shū), 等. 重組鴨α-干擾素基因工程菌表達(dá)條件的研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 25(3): 337-342.

    [15]張怡潔. 重組大腸桿菌DH5α生產(chǎn)rNGR-Thm-5工藝的研究[D]. 西安: 西北大學(xué), 2009.

    [16]葉姣, 陳長(zhǎng)華, 夏杰, 等. 溫度對(duì)重組大腸桿菌生長(zhǎng)及外源蛋白表達(dá)的影響[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 28(2): 364-367.

    [17]任增亮, 堵國(guó)成, 陳堅(jiān), 等. 大腸桿菌高效表達(dá)重組蛋白策略[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2007, 27(9): 103-109.

    [18]董燕, 王捷, 譚劉欣, 等. 重組人骨唾液酸蛋白的純化及生物學(xué)活性研究[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2006, 27(2): 71-74.

    [19]李澤鴻, 岳玉環(huán), 吳廣謀, 等. 白喉毒素DAB389-(Gly4Ser)2-α-促黑激素工程菌發(fā)酵條件的初步研究[J]. 生物技術(shù)通訊, 2008, 19(1): 55-58.

    Optimization of Expression Conditions for Listeria monocytogenes p60 Protein

    LU Tian,CAO Zheng-mao,WU Hai-tao,WANG Xiao-hong*
    (College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

    In this study, the optimal conditions for the expression of Listeria monocytogenes p60 protein, for which the recombinant expression vector pET-28a-p60 and the recombinant E. coli BL21(DE3) host strain were available, were investigated. The results showed that the optimal expression process determined was that the host strain was enriched to a OD600nmvalue between 0.7 and 0.8, and IPTG was then added to a final concentration of 1 mmol/L, followed by 6 h expression on a shake table with a shaking speed of 150 r/min at 25 ℃, and that after the expression, the content of p60 protein as a percentage of total protein content was 42.32%, and soluble protein occupied around 85.36% of the total p60 protein.

    Listeria monocytogenes;p60 protein;expression condition;optimization

    Q815

    A

    1002-6630(2010)23-0160-04

    2010-01-24

    華中農(nóng)業(yè)大學(xué)“國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃”資助項(xiàng)目(200837)

    呂添(1989-),男,本科生,研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail:lvtian@webmail.hzau.edu.cn

    *通信作者:王小紅(1970-),女,副教授,博士,研究方向?yàn)槭称肺⑸锖褪称钒踩?。E-mail:wxh@mail.hzau.edu.cn

    猜你喜歡
    李斯特菌體可溶性
    菌體蛋白精養(yǎng)花鰱高產(chǎn)技術(shù)探析
    東北酸菜發(fā)酵過(guò)程中菌體的分離與鑒定
    我請(qǐng)鴿子來(lái)吃飯
    幼兒園(2019年7期)2019-09-05 17:49:18
    鮮地龍可溶性蛋白不同提取方法的比較
    中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:34
    菌體蛋白水解液應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵的研究
    黃芩苷對(duì)一株產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌體內(nèi)外抗菌作用的研究
    可溶性Jagged1對(duì)大鼠靜脈橋狹窄的抑制作用
    可溶性ST2及NT-proBNP在心力衰竭中的變化和臨床意義
    保持肅靜
    瑪咖可溶性膳食纖維的制備及其表征
    无限看片的www在线观看| 91字幕亚洲| 淫妇啪啪啪对白视频 | 欧美精品一区二区大全| avwww免费| 久久久久久人人人人人| 99久久99久久久精品蜜桃| 夜夜夜夜夜久久久久| 中亚洲国语对白在线视频| 日本黄色日本黄色录像| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美亚洲日本最大视频资源| 午夜激情av网站| av在线播放精品| 中文字幕色久视频| 亚洲人成电影观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 热99久久久久精品小说推荐| www.自偷自拍.com| 下体分泌物呈黄色| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩大片免费观看网站| 视频在线观看一区二区三区| 91av网站免费观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 韩国精品一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 多毛熟女@视频| 国产黄色免费在线视频| 黄频高清免费视频| 午夜福利一区二区在线看| 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 十八禁网站免费在线| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日韩大码丰满熟妇| av有码第一页| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 超碰97精品在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 精品少妇久久久久久888优播| 美女扒开内裤让男人捅视频| av片东京热男人的天堂| 欧美成狂野欧美在线观看| 91av网站免费观看| 高清视频免费观看一区二区| 午夜福利乱码中文字幕| 男人舔女人的私密视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲国产av影院在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 日本黄色日本黄色录像| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 一区二区三区乱码不卡18| 久久99热这里只频精品6学生| 国产日韩一区二区三区精品不卡| av一本久久久久| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久香蕉激情| 国产欧美日韩一区二区精品| 美女大奶头黄色视频| 女性生殖器流出的白浆| 1024香蕉在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 老司机靠b影院| 99热全是精品| 国产精品一二三区在线看| 亚洲av成人一区二区三| 9色porny在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 免费不卡黄色视频| 波多野结衣一区麻豆| 精品福利永久在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 国产在线免费精品| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 999久久久国产精品视频| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲欧美一区二区三区久久| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产精品一区二区免费欧美 | 老司机靠b影院| 午夜两性在线视频| 老司机影院成人| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美另类一区| 国产男女内射视频| av网站在线播放免费| 一本色道久久久久久精品综合| 国产精品成人在线| 18在线观看网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 永久免费av网站大全| videosex国产| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产一卡二卡三卡精品| 国产av一区二区精品久久| 免费少妇av软件| 欧美97在线视频| 国产成人系列免费观看| 日本91视频免费播放| 国产精品影院久久| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 秋霞在线观看毛片| 亚洲五月色婷婷综合| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产99久久九九免费精品| 国产激情久久老熟女| 婷婷丁香在线五月| 亚洲成国产人片在线观看| e午夜精品久久久久久久| 女警被强在线播放| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 电影成人av| 99国产精品一区二区蜜桃av | 美女扒开内裤让男人捅视频| 99热国产这里只有精品6| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精品av久久久久免费| 亚洲人成77777在线视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 黄片小视频在线播放| 日韩精品免费视频一区二区三区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲少妇的诱惑av| 自线自在国产av| 水蜜桃什么品种好| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 精品高清国产在线一区| 精品国产国语对白av| 黄色怎么调成土黄色| av又黄又爽大尺度在线免费看| 成人国语在线视频| 午夜老司机福利片| 一区在线观看完整版| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 99久久国产精品久久久| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 在线观看免费午夜福利视频| 中文欧美无线码| 大香蕉久久成人网| 一区在线观看完整版| 操出白浆在线播放| 国产精品1区2区在线观看. | 免费在线观看影片大全网站| 丝袜在线中文字幕| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 999久久久国产精品视频| h视频一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 国产在线免费精品| 黄色视频不卡| 91精品三级在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美在线黄色| 久久亚洲精品不卡| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 成年人免费黄色播放视频| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜福利视频在线观看免费| 美女午夜性视频免费| av线在线观看网站| 老熟女久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 美女中出高潮动态图| 美女中出高潮动态图| 国产欧美日韩一区二区三 | 在线看a的网站| 人成视频在线观看免费观看| 69av精品久久久久久 | 老司机影院毛片| 精品免费久久久久久久清纯 | 精品少妇内射三级| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产视频一区二区在线看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 超碰成人久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 黄色 视频免费看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费少妇av软件| 国产淫语在线视频| av视频免费观看在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 女性生殖器流出的白浆| 黄频高清免费视频| 亚洲精品自拍成人| 国产国语露脸激情在线看| 免费不卡黄色视频| 欧美中文综合在线视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品高清国产在线一区| 女性被躁到高潮视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品久久久av美女十八| 精品一品国产午夜福利视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 一个人免费在线观看的高清视频 | 国产av又大| 麻豆国产av国片精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 69精品国产乱码久久久| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 母亲3免费完整高清在线观看| 电影成人av| 最近最新中文字幕大全免费视频| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 人妻一区二区av| 久久亚洲国产成人精品v| a级片在线免费高清观看视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品少妇黑人巨大在线播放| 90打野战视频偷拍视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 午夜福利在线免费观看网站| 最近最新中文字幕大全免费视频| a在线观看视频网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 中文字幕色久视频| 欧美久久黑人一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 老司机影院成人| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 深夜精品福利| 18禁国产床啪视频网站| 人妻 亚洲 视频| 亚洲av美国av| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久久水蜜桃国产精品网| 黄色视频,在线免费观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产免费福利视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 精品少妇久久久久久888优播| 真人做人爱边吃奶动态| 97人妻天天添夜夜摸| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 动漫黄色视频在线观看| av线在线观看网站| 日韩电影二区| 99re6热这里在线精品视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品免费大片| 日本av手机在线免费观看| 一本大道久久a久久精品| 久热爱精品视频在线9| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 午夜福利视频在线观看免费| 搡老岳熟女国产| 国产三级黄色录像| 国产有黄有色有爽视频| 最近最新免费中文字幕在线| 中文字幕人妻熟女乱码| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久久久久精品精品| 精品久久久精品久久久| 99热全是精品| 十八禁高潮呻吟视频| 97在线人人人人妻| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 蜜桃在线观看..| 欧美日本中文国产一区发布| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲情色 制服丝袜| 高清欧美精品videossex| 黄色 视频免费看| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品九九99| 大香蕉久久成人网| 人妻久久中文字幕网| 国产av国产精品国产| 一级a爱视频在线免费观看| 国产深夜福利视频在线观看| 青春草视频在线免费观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 免费观看a级毛片全部| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品卡一卡二卡四卡免费| 老司机亚洲免费影院| 一区二区三区激情视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99re6热这里在线精品视频| 精品福利永久在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 两个人看的免费小视频| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 69精品国产乱码久久久| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | www.av在线官网国产| 国产黄色免费在线视频| 久久久久视频综合| 黄色毛片三级朝国网站| 不卡一级毛片| 国产免费av片在线观看野外av| 大型av网站在线播放| 午夜老司机福利片| 欧美精品av麻豆av| 不卡av一区二区三区| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲,欧美精品.| 美女大奶头黄色视频| 老司机福利观看| 91精品国产国语对白视频| 午夜福利影视在线免费观看| 国产一区二区 视频在线| 国产在线视频一区二区| 我的亚洲天堂| 亚洲国产av新网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 午夜老司机福利片| 亚洲情色 制服丝袜| a 毛片基地| 在线观看人妻少妇| 亚洲精品美女久久av网站| 国产成人精品久久二区二区91| 国产一区二区在线观看av| 欧美久久黑人一区二区| 97人妻天天添夜夜摸| 好男人电影高清在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美在线一区亚洲| 黄色片一级片一级黄色片| 久久久久久久精品精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲七黄色美女视频| 午夜免费鲁丝| 中文字幕制服av| 91成年电影在线观看| bbb黄色大片| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲精品美女久久av网站| 最新的欧美精品一区二区| 日日夜夜操网爽| 男人舔女人的私密视频| 午夜福利,免费看| 国产一区二区三区av在线| 中国国产av一级| 亚洲精品国产区一区二| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 香蕉国产在线看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 美女国产高潮福利片在线看| avwww免费| a在线观看视频网站| 91麻豆av在线| 精品福利观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 国产激情久久老熟女| 久久人人爽人人片av| 1024香蕉在线观看| 男人操女人黄网站| 啦啦啦在线免费观看视频4| 成年av动漫网址| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 成在线人永久免费视频| 亚洲国产av新网站| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 大香蕉久久成人网| 亚洲国产精品一区三区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久久精品免费免费高清| 丝袜人妻中文字幕| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产1区2区3区精品| 国产深夜福利视频在线观看| 大陆偷拍与自拍| 成年女人毛片免费观看观看9 | 999久久久国产精品视频| 在线天堂中文资源库| 性少妇av在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 国产福利在线免费观看视频| 午夜成年电影在线免费观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 18禁国产床啪视频网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 精品第一国产精品| 亚洲精品国产区一区二| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产av一区二区精品久久| 成人手机av| 男男h啪啪无遮挡| 久久久国产欧美日韩av| a级毛片在线看网站| 黄色a级毛片大全视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品福利永久在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 久久国产精品影院| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 十八禁人妻一区二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 飞空精品影院首页| 日韩欧美免费精品| svipshipincom国产片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产欧美亚洲国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久热爱精品视频在线9| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品久久久久久电影网| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 成年人免费黄色播放视频| 婷婷丁香在线五月| 国产亚洲一区二区精品| 成人免费观看视频高清| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲一区中文字幕在线| 高清视频免费观看一区二区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 男女边摸边吃奶| 亚洲成人手机| 午夜免费观看性视频| 久久香蕉激情| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品一二三区在线看| 大陆偷拍与自拍| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美日韩视频精品一区| 一级毛片电影观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 黄片大片在线免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久欧美国产精品| 国产一区二区在线观看av| 欧美日韩av久久| 欧美激情极品国产一区二区三区| 一级片'在线观看视频| 黄色 视频免费看| 久久人妻熟女aⅴ| av天堂久久9| 精品人妻1区二区| 午夜福利在线观看吧| 国产av国产精品国产| 精品国产一区二区三区四区第35| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 一区福利在线观看| 视频区图区小说| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一二三四社区在线视频社区8| 国产区一区二久久| 欧美成人午夜精品| 亚洲人成77777在线视频| 伦理电影免费视频| 亚洲伊人色综图| a在线观看视频网站| 大片免费播放器 马上看| 考比视频在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 97人妻天天添夜夜摸| 久久精品人人爽人人爽视色| 免费av中文字幕在线| 日本五十路高清| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲国产精品999| 亚洲精品乱久久久久久| 超碰97精品在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 色视频在线一区二区三区| 男人添女人高潮全过程视频| 国产av又大| 色老头精品视频在线观看| 国产免费现黄频在线看| 中文字幕最新亚洲高清| 极品少妇高潮喷水抽搐| 制服诱惑二区| 丝袜脚勾引网站| 天天添夜夜摸| 淫妇啪啪啪对白视频 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 最近最新免费中文字幕在线| 一区二区三区乱码不卡18| 国产一卡二卡三卡精品| 国产区一区二久久| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品一区在线观看国产| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 中国国产av一级| 男人添女人高潮全过程视频| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲欧美激情在线| 69av精品久久久久久 | 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲国产看品久久| 桃花免费在线播放| 飞空精品影院首页| 又大又爽又粗| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲国产欧美网| 欧美黄色片欧美黄色片| 高清av免费在线| 精品亚洲成国产av| 亚洲人成电影免费在线| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 天堂8中文在线网| 成年动漫av网址| av片东京热男人的天堂| 少妇粗大呻吟视频| 中文欧美无线码| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产有黄有色有爽视频| 美女福利国产在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| www.精华液| 国产真人三级小视频在线观看| 久久久久视频综合| 丁香六月天网| 免费在线观看黄色视频的| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久99一区二区三区| 咕卡用的链子| 视频区欧美日本亚洲| 日本av手机在线免费观看| 亚洲第一青青草原| 高清在线国产一区| 日本欧美视频一区| 亚洲免费av在线视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 在线观看免费日韩欧美大片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 高清黄色对白视频在线免费看| 一区二区三区乱码不卡18| 五月开心婷婷网| 国产免费视频播放在线视频| 国产在线视频一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 精品亚洲成国产av| 精品久久久久久电影网| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一进一出抽搐动态| 欧美日韩亚洲高清精品| 波多野结衣一区麻豆| 婷婷色av中文字幕| 久久性视频一级片| 亚洲三区欧美一区| 男女边摸边吃奶| 国产精品1区2区在线观看. | 一本色道久久久久久精品综合| 国产野战对白在线观看| 午夜老司机福利片| 国产精品影院久久| 一区二区av电影网| av线在线观看网站| 国产成人av教育| 18禁观看日本| 免费在线观看黄色视频的| 欧美日韩亚洲高清精品| 人人妻人人澡人人看| 国产成人欧美| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久久久久久大尺度免费视频| 午夜福利在线观看吧| 日韩 亚洲 欧美在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美日本中文国产一区发布| 午夜日韩欧美国产| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 老司机深夜福利视频在线观看 | 咕卡用的链子| cao死你这个sao货| 99热全是精品| 成人手机av|