角石蕊中松蘿酸的提取及生物活性研究

熱衣木·馬木提，阿地里江·阿不都拉，阿不都拉·阿巴斯*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

角石蕊中松蘿酸的提取及生物活性研究

熱衣木·馬木提，阿地里江·阿不都拉，阿不都拉·阿巴斯*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

以采自新疆天山后峽地區(qū)角石蕊為實驗材料，從角石蕊中提取松蘿酸，并對其抗氧化活性和抑菌活性進(jìn)行測定，以松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品和VC為參照物。結(jié)果表明：樣品具有較強(qiáng)的還原力和清除羥自由基、超氧陰離子自由基的能力；松蘿酸對細(xì)菌的生長均有明顯的抑制作用，其中對變形桿菌的抑制作用最強(qiáng)，對大腸桿菌的抑制作用次之，對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，對枯草芽孢桿菌的抑制作用最弱。

角石蕊；松蘿酸；抗氧化；抑菌

地衣是一類多年生獨特的生物類群，地衣類早已被人類用于醫(yī)藥方面。地衣主要成分松蘿酸已經(jīng)成為研究最廣泛的地衣物質(zhì)之一。松蘿酸在樹發(fā)屬、石蕊屬、茶漬衣屬、松蘿屬、樹花屬及扁枝衣地衣屬中較為豐富。角石蕊是地衣植物石蕊屬的一種類型，松蘿酸也是其主要成分之一。對于松蘿酸的抗菌功能、化學(xué)性質(zhì)及其在醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)控等各個領(lǐng)域的應(yīng)用研究，可見于各種外文文獻(xiàn)的報道[1-2]。美國、日本及德國的應(yīng)用研究較多；而中國、智利、南斯拉夫、印度尼西亞等國仍然在致力于松蘿酸的提取、抗菌、抗病毒等基礎(chǔ)方面的研究[3-5]。本研究從角石蕊中提取松蘿酸并對松蘿酸的抗氧化活性和抑菌活性進(jìn)行測定，旨在為松蘿酸的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

角石蕊于2009年10月采自新疆天山后峽地區(qū)英雄橋附近海拔1800～2200m之間的陰坡。

丙酮、苯、乙醇、0.2mol/L pH6.8磷酸緩沖液、鐵氰化鉀溶液(質(zhì)量濃度為0.01g/mL)、三氯乙酸溶液(質(zhì)量濃度為0.1g/mL)、三氯化鐵溶液(質(zhì)量濃度為0.001g/mL、9mmol/L FeSO4溶液、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8mmol/L H2O2溶液、50mmol/LTris-HCl緩沖液(pH8.2)、3mmol/L鄰苯三酚溶液、松蘿酸對照品、VC、蛋白胨、氯化鈉、酵母浸粉、瓊脂等均為分析純。

DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵、HH-S電熱恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Spectrumlab 53紫外-可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；超凈工作臺 蘇州自動化儀器儀表研究所有限公司；YXO-SG46-280S手提式滅菌鍋 杭州中拓儀器有限公司；MGC-400B光照培養(yǎng)箱 上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 角石蕊中松蘿酸的提取及抗氧化性能測定

1.2.1.1 角石蕊中松蘿酸的提取

稱取剪碎的角石蕊地衣10g置于500mL燒瓶中用丙酮200mL回流提取3次，每次3h，合并提取液，濃縮至原體積的1/6～1/8，自然冷卻，析出結(jié)晶，即得松蘿酸粗品。向粗品中加入60倍量苯-乙醇(體積比為1:1)混合溶劑，回流2h，趁熱過濾，將濾液濃縮至原體積的1/5，冷卻析出結(jié)晶，用丙酮重結(jié)晶一次，所得淡黃色針晶即為松蘿酸純品[6]。

1.2.1.2 松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取40mg松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮稀釋定容至100mL，然后取20mL用丙酮定容至150mL，配成質(zhì)量濃度為0.0533mg/mL松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.1.3 樣品溶液的制備

取1.2.1.1節(jié)法提取的松蘿酸純品用丙酮稀釋定容至100mL，然后取1.17mL用丙酮定容至150mL，配成質(zhì)量濃度為0.0533mg/mL樣品溶液。

1.2.1.4 VC溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.1g VC用20mL水稀釋，然后取1.60mL定容于150mL，配成質(zhì)量濃度為0.0533mg/mL VC溶液。

1.2.1.5 還原力的測定[7]

分別準(zhǔn)確吸取2.0mL不同質(zhì)量濃度的樣品液、VC溶液、松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入0.2mol/L pH6.8磷酸緩沖液2.0mL，鐵氰化鉀溶液2.0mL，50℃水浴20min后急速冷卻，加入三氯乙酸溶液2.0mL、加蒸餾水4.0mL、三氯化鐵溶液1.0mL，混合后10min以蒸餾水作參比于700nm波長處測定吸光度，吸光度越大則還原力越強(qiáng)。

1.2.1.6 羥自由基清除率的測定[8]

反應(yīng)體系為：9mmol/L FeSO41.0mL，9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0mL，不同質(zhì)量濃度的樣品液(或VC溶液，松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液)2.0mL，最后加8.8mmol/L H2O21.0mL啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5h，以蒸餾水為參比，在510nm波長處測定各溶液的吸光度，考慮到本身的吸光度，以1.0mL 9mmol/L FeSO4、1.0mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液、不同質(zhì)量濃度的樣品液(或VC溶液，松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液)2.0mL加蒸餾1.0mL混合液，作為樣品液的本底吸收。其清除率按公式(1)計算。

式中：A0為空白對照溶液吸光度；AX為樣品反應(yīng)液吸光度；Ax0為不加H2O2樣品反應(yīng)液的本底吸光度。

1.2.1.7 超氧陰離子自由基清除率的測定[9]

采用鄰苯三酚自氧化法。取4.5mL、pH8.2、50mmol/L Tris-HCI緩沖液，4.2mL蒸餾水，混合后在25℃水浴保溫20min后急速冷卻，立即加入25℃預(yù)熱過的3mmol/L鄰苯三酚0.3mL，總體積9.0mL，作為空白對照。在加入鄰苯三酚前先加入2.0mL不同質(zhì)量濃度的樣品液(VC溶液或松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液)，蒸餾水相應(yīng)減為2.2mL，作為樣品反應(yīng)液。測定反應(yīng)啟動后10min時的A325nm值，清除率按公式(2)計算。

式中：A空為空白管吸光度；A樣為樣品反應(yīng)液吸光度。

1.2.2 角石蕊中松蘿酸抑菌活性的測定

1.2.2.1 松蘿酸抑菌活性的測定[10-14]

抑菌活性測定采用濾紙片法。將102型濾紙制成直徑為6mm的圓紙片，放入干燥的小燒杯中，121℃高壓蒸汽滅菌30min后備用，用無菌吸管吸取已制備好的菌懸液0.1mL，加入已制好的平面培養(yǎng)基中涂布均勻，然后將經(jīng)過滅菌并飽和吸入質(zhì)量濃度為6.824mg/mL松蘿酸丙酮溶液的濾紙放入含菌平皿上，對照用濾紙飽和吸入蒸餾水，放置于接種菌種的平皿中。實驗設(shè)3次重復(fù)，在恒溫培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)24h。然后用游標(biāo)卡尺測定培養(yǎng)24h的抑菌圈直徑大小，以此判斷松蘿酸的抑菌力。

1.2.2.2 松蘿酸最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)測定

最低抑制濃度的測定采用濾紙片法，用丙酮作溶劑，分別配制成質(zhì)量濃度為6.824、5.459、4.094、2.729、1.365、0.682、0.341mg/mL的松蘿酸溶液。以沒有抑菌圈的松蘿酸質(zhì)量濃度為最小抑菌質(zhì)量濃度。供試菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原力的測定結(jié)果

圖1 不同抗氧化劑的還原力Fig.1 Reducing power of different antioxidants

由圖1可知，三者都隨質(zhì)量濃度的增大還原力逐漸增大，其增加的趨勢是：VC＞松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品＞樣品。總體來看，樣品具有一定的還原力，但松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品的還原力要強(qiáng)于樣品。三者的還原力強(qiáng)弱順序為VC＞松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品＞樣品。

2.2 羥自由基清除率的測定結(jié)果

圖2 不同抗氧化劑清除·OH活性的量效關(guān)系Fig.2 Scavenging activities of different antioxidants on hydroxyl free radicals

由圖2可知，三者對清除·OH均有較好的量效關(guān)系。VC對·OH的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，標(biāo)準(zhǔn)品對·OH的清除率在0.005～0.015mg/mL范圍內(nèi)強(qiáng)于樣品，而質(zhì)量濃度0.015mg/mL時標(biāo)準(zhǔn)品和樣品對·OH的清除率很接近，質(zhì)量濃度大于0.015mg/mL樣品對·OH的清除率強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)品。

2.3 超氧陰離子自由基清除率的測定結(jié)果

圖3 不同抗氧化劑清除O2·活性的量效關(guān)系Fig.3 Scavenging activities of different antioxidants on superoxide anion free radicals

由圖3可知，三者對O2·的清除作用都隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，質(zhì)量濃度在0.005～0.015mg/mL范圍內(nèi)三者對O2·的清除率都呈增強(qiáng)趨勢，標(biāo)準(zhǔn)品對O2·的清除率強(qiáng)于樣品。質(zhì)量濃度0.015mg/mL時三者對O2·的清除率都很接近，并標(biāo)準(zhǔn)品對O2·的清除率強(qiáng)于樣品。質(zhì)量濃度大于0.015mg/mL時樣品對O2·的清除率增強(qiáng)，并強(qiáng)于VC和標(biāo)準(zhǔn)品。這表明，樣品對O2·有較強(qiáng)的清除能力。

2.4 松蘿酸抑菌活性的測定結(jié)果

由表1可知，質(zhì)量濃度為6.824mg/mL的松蘿酸-丙酮溶液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌均有不同程度的抑制作用，其中對變形桿菌抑制作用最強(qiáng)，24h的抑菌圈直徑達(dá)到了14mm；其次為對大腸桿菌的抑制作用，2 4 h的抑菌圈直徑達(dá)到了13mm；對金黃色葡萄球菌的抑制作用，24h的抑菌圈直徑達(dá)到了12mm。對枯草芽孢桿菌的抑制作用最弱，24h的抑菌圈直徑達(dá)到了11mm，表明松蘿酸對供試細(xì)菌的抑制作用較強(qiáng)。對照蒸餾水則對上述供試菌均無明顯抑制作用。

表1 松蘿酸對供試菌種的抑制效果Table 1 Bacteriostasic activity of usnic acid (inhibitory zone diameter: mm)

2.5 松蘿酸最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)

表2 不同質(zhì)量濃度松蘿酸對各供試菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)Table 2 Minimum inhibitory concentrations of usnic acid for different bacteria

由表2可知，角石蕊松蘿酸提取液對變形桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度為10g/100mL，對大腸桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度為20g/100mL，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌質(zhì)量濃度為40g/100mL，對枯草芽孢桿菌最低抑菌質(zhì)量濃度為60g/100mL。角石蕊松蘿酸提取液對變形桿菌的MIC為最小。因此以上結(jié)果表明松蘿酸對變形桿菌抑制力最強(qiáng)，對大腸桿菌的抑制力次之，對金黃色葡萄球菌的抑制力其次，而對枯草芽孢桿菌的抑制力最弱。

3 結(jié) 論

從角石蕊中提取的松蘿酸具有較強(qiáng)的還原力，但松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品的還原力強(qiáng)于樣品。樣品清除·OH的IC50為0.023mg/mL，清除O2·的IC50為0.156mg/mL，松蘿酸清除·OH的能力強(qiáng)于O2·。抑菌實驗結(jié)果表明松蘿酸對變形桿菌抑制力最強(qiáng)，對大腸桿菌的抑制力次之，對金黃色葡萄球菌的抑制力其次，而對枯草芽孢桿菌的抑制力最弱。松蘿酸是從地衣中提取的天然防腐劑，具有用量少，安全性高等優(yōu)點。

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Extraction and Bioactivity of Usnic Acid from Cladonia cornuta (L.) Hoffm.

Reyim MAMUT，Adilijiang ABDULLA，Abdulla ABBAS*
(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

Cladonia cornuta (L.) Hoffm harvested from Xinjiang’s Tianshan No.1 glacier was used as the experimental material to extract usnic acid and determine its antioxidant activity and antibacterial activity. Results indicated that the usnic acid extracted from Cladonia cornuta (L.) had higher reducing power and antioxidant capacity. Meanwhile, usnic acid exhibited a significant inhibition on the growth of bacteria such as Proteusbacillus vulgaris, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis.

Cladonia cornuta (L.)；usnic acid；antioxidant；antibacterial

Q946.5

A

1002-6630(2010)23-0057-04

2010-09-01

國家自然科學(xué)基金項目(30960003；30750012)；新疆大學(xué)校院聯(lián)合資助項目(XY080122)

熱衣木·馬木提(1978—)，男，講師，博士研究生，研究方向為地衣資源。E-mail: reyim_mamut@xju.edu.cn

*通信作者：阿不都拉·阿巴斯(1951—)，男，教授，博士，研究方向為地衣資源。E-mail：abdulla@xju.edu.cn