堿性橙Ⅱ染料快速檢測(cè)顯色劑篩選及顯色條件的優(yōu)化

紀(jì)淑娟，張慶歡，沈昳瀟

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

堿性橙Ⅱ染料快速檢測(cè)顯色劑篩選及顯色條件的優(yōu)化

紀(jì)淑娟，張慶歡，沈昳瀟

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

利用堿性橙Ⅱ的顯色特性，考察堿性橙Ⅱ染料的快速檢測(cè)的最佳顯色條件。通過對(duì)不同顯色劑顯色效果與吸光度變化的觀察分析，篩選確定鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色體系為最佳顯色劑。在此基礎(chǔ)上對(duì)顯色反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，鐵氰化鉀和三氯化鐵的適宜體積配比為鐵氰化鉀(3g/L):三氯化鐵(4.5g/L)=1:1，在755nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度優(yōu)化最佳條件，適宜反應(yīng)條件為反應(yīng)時(shí)間20min；反應(yīng)溫度50℃；顯色劑用量0.7mL。

堿性橙Ⅱ；比色法；快速檢測(cè)

堿性橙Ⅱ(chrysoidine，basic orange Ⅱ)是一種偶氮類堿性染料，俗名“王金黃”，化學(xué)名為2,4-二胺基偶氮苯，分子式為C12H12N4·HCl，染料索引號(hào)為C.I. Basic Orange2(11270)，主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色[1]。根據(jù)美國衛(wèi)生研究所(NIH)化學(xué)品健康與安全數(shù)據(jù)庫資料，攝取、吸入以及皮膚接觸該物質(zhì)均會(huì)造成急性和慢性的中毒傷害。由于堿性橙比其他水溶性染料如檸檬黃、日落黃等更易于在豆制品以及鮮海魚上染色且不易褪色，因此一些不法商販用堿性橙Ⅱ?qū)Χ垢?、黃魚等進(jìn)行染色，以次充好，以假冒真，欺騙消費(fèi)者，嚴(yán)重危害了消費(fèi)者的身體健康。

《中華人民共和國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》及《中華人民共和國食品安全法》把堿性橙列為禁止添加到食品中的物質(zhì)。2008年12月15日，衛(wèi)生部發(fā)布了首批非法食品添加劑名單，其中包括17種非食用物質(zhì)和10種易濫用的食品添加劑，堿性橙被列為非食用物質(zhì)。目前，國內(nèi)測(cè)定食品中堿性橙Ⅱ的標(biāo)準(zhǔn)方法為GB/T 23496—2009《食品中禁用物質(zhì)的檢測(cè)：堿性橙染料：高效液相色譜法》[2]。此方法的準(zhǔn)確度和精密度高，但是需要大型儀器設(shè)備，昂貴的色譜純?cè)噭?，成本比較高，適合于實(shí)驗(yàn)室精確定量測(cè)定，無法滿足農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)利用堿性橙Ⅱ的顯色特性，篩選確定目視比較和比色測(cè)定適宜的顯色劑，并在此基礎(chǔ)上對(duì)顯色反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，為建立適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)食品中堿性橙Ⅱ染料的方法提供參考依據(jù)[3-11]。

1 材料與方法

1.1 試劑

堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品 北京百靈威科技有限公司；無水乙醇(分析純) 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；甲醇、丙酮、三氯化鐵、鐵氰化鉀、冰醋酸(均為分析純) 沈陽沈一精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU 1810 紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；101-2A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營廠。1.3方法

1.3.1 顯色劑的篩選

本實(shí)驗(yàn)選用鹽酸、硫酸、硫代硫酸鈉和鐵氰化鉀-三氯化鐵為顯色劑，其反應(yīng)原理：鹽酸和硫酸因其改變?nèi)芤旱膒H值而使堿性橙Ⅱ在溶液中的顏色發(fā)生變化；硫代硫酸鈉因?yàn)榫哂羞€原性，可以使偶氮類化合物還原成氫化偶氮化合物，繼續(xù)還原偶氮鍵生成芳胺；鐵氰化鉀-三氯化鐵體系與堿性橙Ⅱ作用生成普魯士藍(lán)[12]。

將鹽酸、硫酸、硫代硫酸鈉和鐵氰化鉀-三氯化鐵作為顯色劑，加入到堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液中(10μg/mL)，觀察其顯色效果，分別對(duì)其進(jìn)行紫外-可見光譜掃描，分析反應(yīng)前后吸收光譜的變化。綜合考慮反應(yīng)體系顏色變化、顯色反應(yīng)靈敏度、顯色反應(yīng)對(duì)條件的要求以及顯色后反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，確定適宜的顯色劑種類。

1.3.2 顯色劑與堿性橙Ⅱ顯色前后測(cè)定波長(zhǎng)的確定

配制一定質(zhì)量濃度的堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)液(10μg/mL儲(chǔ)備液)，顯色前后，分別在200～900nm，紫外吸收光譜寬度為0.5nm，進(jìn)行光譜掃描，獲得吸收光譜并確定測(cè)定波長(zhǎng)[13]。

1.3.3 顯色反應(yīng)條件的優(yōu)化[14-20]

1.3.3.1 顯色劑最佳配比的確定

通過1.3.1節(jié)確定鐵氰化鉀-三氯化鐵為最佳顯色劑，分別配制不同質(zhì)量濃度的鐵氰化鉀和三氯化鐵溶液，混合后觀察其穩(wěn)定性，并確定使用時(shí)的適宜質(zhì)量濃度和配比。

1.3.3.2 顯色反應(yīng)介質(zhì)的篩選

分別考察不同pH值的甘氨酸-鹽酸緩沖液和乙酸-乙酸鈉緩沖液作顯色反應(yīng)的介質(zhì)溶劑，觀察顯色體系的穩(wěn)定性。

1.3.3.3 顯色劑用量對(duì)顯色反應(yīng)效果的影響

取堿性橙Ⅱ(10μg/mL儲(chǔ)備液) 1mL置于比色管中，加入顯色劑的量分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，配制系列測(cè)定溶液，以0號(hào)管作參比，觀察各試管間顏色差異，并分別測(cè)定吸光度，每個(gè)處理平行做3組。

1.3.3.4 顯色時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)效果的影響

準(zhǔn)確移取一定量堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)液，在一定的溫度條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)，每隔10min 測(cè)定一次吸光度。

1.3.3.5 顯色溫度對(duì)顯色反應(yīng)效果的影響

分別在25、30、35、40、45、50、55℃的條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)，反應(yīng)一定時(shí)間后，觀察顏色的差異，并分別測(cè)定吸光度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3.6 顯色反應(yīng)正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)定如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table1 Factors and their levels in the orthogonal array L9(34)

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色劑的確定

表2 不同顯色劑顯色情況Table2 Color developing effects of different color developers

表3 不同顯色劑的靈敏性Table3 Sensitivity of different color developers

鹽酸、硫酸、硫代硫酸鈉和鐵氰化鉀-三氯化鐵作為顯色劑，與同質(zhì)量濃度(10μg/mL)的堿性橙Ⅱ發(fā)生顯色反應(yīng)，結(jié)果見表2。

由表2可得出，堿性橙Ⅱ溶液(10μg/mL)本身顏色為黃色，加入不同顯色劑后顏色變化不同，其中，以鹽酸和硫代硫酸鈉為顯色劑，反應(yīng)產(chǎn)物顏色變化不明顯，而以硫酸和鐵氰化鉀-三氯化鐵作顯色劑，反應(yīng)產(chǎn)物與堿性橙Ⅱ溶液顏色差異大，尤其是以鐵氰化鉀-三氯化鐵作顯色劑，反應(yīng)產(chǎn)物稀釋液與堿性橙Ⅱ溶液的顏色仍有較大差異；從反應(yīng)所需條件來看，4種顯色反應(yīng)均可在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物均較穩(wěn)定。

表3為不同顯色劑與堿性橙Ⅱ反應(yīng)的靈敏性結(jié)果。從顏色變化角度來看，不同種類顯色劑與堿性橙Ⅱ發(fā)生顯色反應(yīng)的靈敏性差異較大，其中，硫酸作為顯色劑時(shí)，隨著堿性橙Ⅱ質(zhì)量濃度的降低，溶液顏色由桃紅色變?yōu)榈凵辉趬A性橙Ⅱ質(zhì)量濃度為1.0μg/mL以上時(shí)，加入硫酸后溶液顏色無明顯變化。鹽酸作為顯色劑時(shí)，溶液顏色由橙黃色變?yōu)榈S色；在堿性橙Ⅱ質(zhì)量濃度為0.5μg/mL以下時(shí)，加入鹽酸后溶液顏色無明顯變化。三氯化鐵-鐵氰化鉀作為顯色劑時(shí)，溶液顏色由綠色變?yōu)闇\綠色；在質(zhì)量濃度為0.1μg/mL時(shí)，加入顯色劑后溶液呈淺綠色，略帶黃色——顯色劑顏色。從吸光度角度看，分別稀釋5倍后測(cè)定其吸光度，結(jié)果和顏色變化情況相吻合。說明三氯化鐵-鐵氰化鉀作為顯色劑時(shí)的最低檢測(cè)濃度明顯比鹽酸和硫酸低，即此顯色劑的反應(yīng)靈敏度高。

圖1為堿性橙Ⅱ稀釋液和堿性橙Ⅱ與不同顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜圖。比較堿性橙Ⅱ與不同顯色劑反應(yīng)前后吸收光譜圖可以看出，堿性橙Ⅱ與硫酸和鹽酸反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸光波長(zhǎng)與其自身的最大吸光波長(zhǎng)無明顯差別，而與鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液反應(yīng)前后吸收光譜圖發(fā)生了明顯的變化。

圖1 堿性橙與不同顯色劑反應(yīng)后光譜圖Fig .1 Scanning spectra of reaction products of basic orange Ⅱ with different color developers

綜合考慮反應(yīng)體系顏色變化、顯色反應(yīng)靈敏度、反應(yīng)前后吸收光譜、顯色反應(yīng)對(duì)條件的要求以及顯色后反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，最終確定鐵氰化鉀-三氯化鐵混合液為適宜的顯色劑。

2.2 顯色反應(yīng)前后的最大吸光波長(zhǎng)

如圖2所示，堿性橙Ⅱ的最大吸光波長(zhǎng)為460nm左右，與鐵氰化鉀-三氯化鐵發(fā)生顯色反應(yīng)產(chǎn)物在波長(zhǎng)755nm處出現(xiàn)最大吸收峰，故確定以鐵氰化鉀-三氯化鐵作顯色劑測(cè)定堿性橙Ⅱ殘留量的波長(zhǎng)為755nm。

圖2 堿性橙Ⅱ顯色前后吸收光譜Fig.2 Comparison on scanning spectra of basic orangeⅡand reaction product between it and potassium ferricyanide /Iron (Ⅲ) system

2.3 顯色反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 顯色劑適宜質(zhì)量濃度與配比的確定

目測(cè)觀察結(jié)果表明，鐵氰化鉀和三氯化鐵以體積比1:1混合后，不論各自質(zhì)量濃度大小，隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，混合液都有不同程度的沉淀物質(zhì)產(chǎn)生；由圖3可見，體積比均為1:1的顯色劑溶液中，在835nm波長(zhǎng)下測(cè)定鐵氰化鉀和三氯化鐵混合以后的顯色劑溶液吸光度隨時(shí)間的變化。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，此顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)下吸光度逐漸增加，說明鐵氰化鉀和三氯化鐵混合以后的顯色劑不夠穩(wěn)定，需要使用前現(xiàn)混合。在所設(shè)定的5種配比范圍內(nèi)，以鐵氰化鉀(3g/L):三氯化鐵(4.5g/L) =1:1時(shí)，穩(wěn)定時(shí)間最長(zhǎng)。

圖3 顯色劑混合物質(zhì)量濃度對(duì)穩(wěn)定性的影響Fig.3 Screening for optimal composition of potassium ferricyanide / Iron (Ⅲ) system

2.3.2 顯色反應(yīng)介質(zhì)溶劑的確定

為了解決顯色產(chǎn)物的沉淀問題，對(duì)顯色反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行研究。以不同pH值的甘氨酸-鹽酸緩沖液和乙酸-乙酸鈉緩沖液作顯色反應(yīng)的介質(zhì)，結(jié)果如表4所示。用甘氨酸-鹽酸緩沖液作介質(zhì)時(shí)顯色穩(wěn)定性較差；而在pH2.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液中顯色后溶液穩(wěn)定性較好，顯色產(chǎn)物的穩(wěn)定時(shí)間足以滿足測(cè)定要求，故選用pH2.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液作為反應(yīng)的介質(zhì)溶液。

表4 不同介質(zhì)溶劑對(duì)顯色反應(yīng)的影響Table4 Effects of medium solvent type and pH on color development

2.3.3 顯色劑用量對(duì)顯色效果的影響

如表5所示，當(dāng)顯色劑用量達(dá)到0.8mL以上時(shí)，隨著顯色劑用量的變化，反應(yīng)產(chǎn)物顏色變化不明顯。不同用量顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物吸光度統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(表6)表明，顯色劑用量在0.4～0.7mL時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物吸光度差異不顯著。根據(jù)顯色劑用量選擇的原理：1)反應(yīng)液中所有的堿性橙Ⅱ都應(yīng)該反應(yīng)完；2)反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)處的最大吸光度應(yīng)該小于2.0， 最好是小于1.5。綜合考慮反應(yīng)的顯色效果、吸光度差異性和顯色劑用量選擇原理，確定顯色劑用量為0.5～0.7mL比較適宜。

表5 不同顯色劑用量的顯色效果比較Table5 Effects of color developer amount on color development

表6 不同顯色劑用量對(duì)顯色效果影響的多重比較Table6 Multiple comparison on effects of color developer amount on color development

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)效果的影響

從圖4可以看出，在一定溫度條件下，顯色劑加入后，吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在反應(yīng)的前20min內(nèi)，吸光度增加幅度大，20min后，吸光度趨于平穩(wěn)，故確定堿性橙Ⅱ檢測(cè)的適宜顯色反應(yīng)時(shí)間為20min。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的影響Fig.4 Effect of reaction time on color development

2.3.5 反應(yīng)溫度對(duì)顯色效果的影響

表7 顯色反應(yīng)溫度對(duì)顯色效果的影響Table7 Effect of reaction temperature on color development

表8 顯色溫度對(duì)顯色效果的多重比較Table8 Multiple comparison on effect of reaction temperature on color development

由表7可以看出，反應(yīng)溫度對(duì)顯色效果有明顯的影響，隨著反應(yīng)溫度的升高，顯色后溶液的吸光度隨之增加，但在35～50℃肉眼觀察顏色變化不明顯。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(表8)表明，反應(yīng)溫度為50、55℃兩個(gè)處理顯色反應(yīng)產(chǎn)物吸光度顯著高于其他處理，二者之間差異不顯著；顯色溫度為40、45℃和50℃處理之間差異顯著。故初步確定適宜反應(yīng)溫度為50℃。

2.3.6 顯色反應(yīng)正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)，初步確定顯色反應(yīng)的適宜條件，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)顯色劑用量、顯色時(shí)間和顯色溫度進(jìn)行了三因素三水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表9所示。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)锽(顯色溫度) ＞C(顯色劑用量)＞AB＞A(顯色時(shí)間)，鐵氰化鉀-三氯化鐵測(cè)定堿性橙Ⅱ的最佳條件為顯色時(shí)間20min；顯色溫度50℃；顯色劑用量0.7mL。

表9 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table9 Orthogonal array design layout and experimental results

3 結(jié) 論

利用堿性橙Ⅱ與某些試劑發(fā)生顯色反應(yīng)的特點(diǎn)可以快速檢測(cè)其在食品中殘留量。本實(shí)驗(yàn)綜合分析堿性橙Ⅱ與不同種類顯色劑發(fā)生反應(yīng)前后顏色的變化、顯色反應(yīng)靈敏度、反應(yīng)前后吸收光譜、顯色反應(yīng)對(duì)條件的要求以及顯色后反應(yīng)體系的穩(wěn)定性等，確定鐵氰化鉀-三氯化鐵混合液為適宜的顯色劑。該顯色劑與堿性橙Ⅱ反應(yīng)可生成普魯士藍(lán)[12]，且生成物質(zhì)的量與反應(yīng)物濃度成線性關(guān)系，該物質(zhì)在酸性溶液中易溶解。介質(zhì)的pH值對(duì)顯色反應(yīng)的穩(wěn)定性有較大影響，實(shí)驗(yàn)確定用pH2.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液作反應(yīng)介質(zhì)溶液，反應(yīng)20min時(shí)顯色效果最佳。溫度對(duì)顯色反應(yīng)有一定影響，隨著反應(yīng)溫度的升高，達(dá)到反應(yīng)平衡所需時(shí)間有所縮短，實(shí)驗(yàn)確定反應(yīng)最佳溫度為50℃。鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑的用量對(duì)顯色的效果影響較大，實(shí)驗(yàn)表明0.7mL 為最佳使用量?；旌虾箫@色劑放置時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生沉淀，可分別配制鐵氰化鉀和三氯化鐵溶液，臨用前現(xiàn)混合。

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Screening for Colour Developer and Optimization of Reaction Conditions for Fast Determination of Basic Orange Ⅱ in Foods

JI Shu-juan，ZHANG Qing-huan，SHEN Yi-xiao
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)

Using the ability of basic orange Ⅱ to develop color, a fast method was presented for the determination of this dye. The optimal conditions for color development were investigated. A reagent system composed of potassium ferricyanide and Iron (Ⅲ) was found to the best color developer through comparative analysis of color developing effects of different color developers and observation of absorbance change, and the optimal ratio of potassium ferricyanide solution (3 g/L) to ferric chloride solution (4.5 g/L) was 1:1. The optimal reaction conditions were determined based on absorbance at 755 nm wavelength as follows: color developer amount, 0.7 mL; and reaction temperature, 50 ℃ for a reaction duration of 20 min.

basic orange Ⅱ；colorimetry；ast determination

TS207.3

A

1002-6630(2010)20-0394-05

2010-06-23

遼寧省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2009A633)

紀(jì)淑娟(1960—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量控制。E-mail：jsjsyau@sina.com