PCR方法檢測(cè)河豚魚的引物篩選及反應(yīng)體系優(yōu)化

陳文炳，趙 晨,，邵碧英，江樹勛，閆 誠，李壽崧，林河通

(1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 福州 350001；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

PCR方法檢測(cè)河豚魚的引物篩選及反應(yīng)體系優(yōu)化

陳文炳1，趙 晨1,2，邵碧英1，江樹勛1，閆 誠1，李壽崧1，林河通2

(1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 福州 350001；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

根據(jù)Genbank公布的河豚魚細(xì)胞色素b基因序列，應(yīng)用軟件Primer Premier 5.00版設(shè)計(jì)了7對(duì)引物，經(jīng)過PCR篩選，確定可以在所有8個(gè)供試河豚魚樣品中檢出目的DNA片段的引物HT-1，用于建立河豚魚的PCR檢測(cè)方法。對(duì)該P(yáng)CR方法中6個(gè)因素包括退火溫度、Mg2+終濃度、Taq DNA聚合酶用量、dNTPs終濃度、引物終濃度和模板DNA用量進(jìn)行優(yōu)化，確定優(yōu)化的PCR擴(kuò)增體系：10×PCR緩沖液2μL，MgCl2終濃度1.5mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，dNTPs終濃度300μmol/L，引物終濃度0.2μmol/L，DNA模板400ng，加純水至總體積20μL。擴(kuò)增程序定為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。據(jù)此建立河豚魚成分PCR檢測(cè)方法，并通過河豚魚與非河豚魚的PCR檢測(cè)結(jié)果比較，驗(yàn)證了該方法的河豚魚特異性。研究結(jié)果還表明，該方法的檢出限為0.1%，含量為0.1%的河豚魚樣品PCR檢出率至少在97.5%以上。

河豚魚；引物篩選；PCR檢測(cè)；優(yōu)化

我國海域廣闊，河豚魚種類繁多，魚類加工食品中因混有河豚魚，使得顧客誤食而中毒的事件時(shí)有發(fā)生，例如2007年6月，發(fā)生了由于出口美國的鮟鱇魚混有河豚魚，導(dǎo)致顧客誤食而中毒的事件，對(duì)我國海產(chǎn)加工食品出口貿(mào)易造成一定負(fù)面影響。國外食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)也有從魚類加工品中檢出河豚魚的例子，例如2007年4月日本食品檢驗(yàn)部門在我國南方某食品有限公司出口的馬面魚干中檢出河豚魚成分。為了保證水產(chǎn)加工制品的安全，保障國內(nèi)外消費(fèi)者的健康安全，急需一種能夠在食品中快速檢測(cè)出河豚魚成分的方法。

PCR檢測(cè)方法已被廣泛應(yīng)用于食品與飼料中的動(dòng)植物成分與轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)與鑒定[1-4]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟趨⒄誈enBank公布的河豚魚的線粒體細(xì)胞色素b基因DNA序列，設(shè)計(jì)7對(duì)引物，通過PCR試驗(yàn)篩選，PCR反應(yīng)體系與溫度條件的優(yōu)化，建立一種能夠快速檢測(cè)海產(chǎn)品中河豚魚源性成分的PCR方法，并測(cè)試該方法的檢出限(靈敏度)與檢出率，為此方法的實(shí)際應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

8種河豚魚供試材料，收集自福建省廈門、莆田等地水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，11種常見非河豚海洋魚類，作為陰性對(duì)照樣品，購自福州當(dāng)?shù)爻?，美國白魚粉是本實(shí)驗(yàn)室承檢留樣(表1)。

1.2 試劑與儀器

CTAB、Triton-X 100、dNTP 上海博亞生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶、10×PCR緩沖液、MgCl225mmol/L Promega公司；動(dòng)物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、蛋白酶K、λDNA/EcoRⅠ+ HindⅢ、DNA MarkerⅠ 天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖 英國進(jìn)口的Oxoid公司。

Minispin臺(tái)式離心機(jī) Eppendorf公司；Ultrospec 1100 pro核酸蛋白分析儀 Amersham公司；T-Gradient梯度PCR儀 Biometra公司；Power Pac 1000電泳儀 BIORAD公司；Gel Logic 100凝膠成像儀 Kodak公司。

1.3 引物

1.3.1 魚源性成分PCR檢測(cè)用引物

[4]，由上海生工生物工程有限公司合成一對(duì)魚源性成分PCR檢測(cè)引物(表2)。

表2 魚源性成分PCR檢測(cè)用的引物序列與退火溫度Table2 A pair of primers used in this study for amplifying fish component and corresponding annealing temperature

1.3.2 河豚魚PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank公布的懷氏兔頭鲀(Lagocephalus wheeleri)和克氏兔頭鲀(Lagocephalus gloveri)線粒體細(xì)胞色素b基因(AY128531和EU274423.1)堿基序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.00版設(shè)計(jì)了7對(duì)引物，引物長度在20～25個(gè)堿基之間，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成(表3)。

表3 河豚魚源性成分PCR檢測(cè)用的引物序列與退火溫度Table3 Pairs of primers used in this study for amplifying puffer fish component and corresponding annealing temperatures

1.4 DNA提取方法

表1 8種供試河豚魚樣品與12個(gè)非河豚魚樣品及其來源Table1 Eight samples of puffer fish, 12 samples of non-puffer fish and their geographical origin

本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[5-6]的CTAB方法提取河豚魚總DNA，步驟為：稱取50mg樣品于1.5mL離心管中，加入500μL 質(zhì)量濃度為2g/100mL的CTAB Buffer，10μL蛋白酶K。渦旋30s混勻，于65℃消化3h以上(期間每隔30min應(yīng)充分振蕩一次)。加入500μL氯仿，渦旋30s混勻后，13000r/min離心10min。取上清液于2mL離心管中，加入2倍體積質(zhì)量濃度為0.5g/mL 的CTAB沉淀緩沖液，充分混勻后，13000r/min離心10min。取沉淀，加入500μL 1.0mol/L NaCl溶解沉淀。沉淀完全溶解后，加入500μL氯仿。渦旋30s混勻，13000r/min離心10min。取上清液，加入0.8倍體積的異丙醇。渦旋30s混勻，13000r/min離心10min。取沉淀，加入500μL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，渦旋30s，13000r/min離心10min。取沉淀，用DNA濃縮儀干燥。加入100μL TE(pH 8.0)溶解，備用。

1.5 PCR產(chǎn)物電泳

PCR產(chǎn)物各取10μL，于質(zhì)量濃度1.5g/100mL的瓊脂糖凝膠電泳。電壓98V，電泳60min，用溴化乙錠染色15min，最后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照。

1.6 DNA質(zhì)量濃度與質(zhì)量分析方法

1.6.1 DNA質(zhì)量濃度和純度的測(cè)試

用去離子水將DNA稀釋100倍，在核酸蛋白質(zhì)分析儀上測(cè)定其濃度和OD260/OD280值。

1.6.2 PCR擴(kuò)增效果測(cè)試

將供試樣品的DNA稀釋至100ng/μL，用表2魚源性成分PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10× PCR緩沖液2.5μL，25mmol/L MgCl22.5μL，Taq酶1U，10mmol/L dNTPs 0.5μL，模板DNA 1μL，引物終濃度為0.1μmol/L，加純水至25μL。溫度程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，94℃變性20s，55℃退火40s，72℃延伸40s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸3min。PCR產(chǎn)物電泳方法按照1.5。

1.7 用于引物篩選的PCR反應(yīng)體系和溫度循環(huán)程序

參考文獻(xiàn)[7-8]，將引物篩選的PCR擴(kuò)增體系初步確定為：10×PCR緩沖液2μL，MgCl2終濃度1.5mmol/L，Taq DNA聚合酶1U，dNTPs終濃度200μmol/L，引物終濃度0.2μmol/L，DNA模板100ng，加純水至20μL。溫度程序定為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min，4℃保存。按照這個(gè)擴(kuò)增體系與溫度循環(huán)程序，用表3的7對(duì)引物對(duì)8種河豚樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選。

1.8 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

以1.7節(jié)初步確定的反應(yīng)體系與溫度循環(huán)程序?yàn)榛A(chǔ)，對(duì)影響PCR擴(kuò)增的6個(gè)因素包括退火溫度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶用量、dNTPs濃度、引物濃度和模板DNA濃度等進(jìn)行逐個(gè)優(yōu)化。各因素設(shè)置梯度見表4。

表4 影響PCR擴(kuò)增的6個(gè)因素梯度Table4 Gradients of six factors affecting PCR amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 供試樣品的DNA質(zhì)量控制

應(yīng)用CTAB法提取所有供試樣品的DNA，并對(duì)其濃度和OD260/OD280值進(jìn)行測(cè)試。20個(gè)供試樣品的DNA質(zhì)量濃度均在571～1007ng/μL范圍內(nèi)，OD260/OD280值均在1.7～1.9之間，接近純DNA的1.8。魚成分PCR測(cè)試結(jié)果表明，所有樣品的DNA均可用于PCR檢測(cè)(圖1)。

圖1 供試樣品DNA的魚成分PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of fish component amplified from genomic DNA of 10 test samples

2.2 引物篩選

圖2 7對(duì)引物(HT-1～HT-7)分別對(duì)8個(gè)河豚魚樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR results of 8 samples of puffer fishes with 7 pairs of primer HT-1 through HT-7

按照1.7節(jié)的PCR反應(yīng)體系和溫度程序，用表3中的7對(duì)引物(HT-1～HT-7)分別對(duì)8種河豚樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)。

由圖2可知，只有引物HT-1能夠擴(kuò)增出所有供試河豚魚樣品共有的細(xì)胞色素b的基因片段，其余引物(HT-2～HT-7)均無法擴(kuò)增出供試河豚魚樣品共有的DNA片段，因此選取引物HT-1用于后續(xù)的PCR檢測(cè)方法研究。

2.3 PCR退火溫度及反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.3.1 退火溫度的優(yōu)化

對(duì)1.7節(jié)初步確定的溫度程序中的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置10個(gè)溫度梯度(表4)。PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3。

圖3 退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Fig.3 Effect of annealing temperature on PCR amplification

由圖3可知，除10號(hào)泳道的65.8℃ PCR產(chǎn)物條帶亮度明顯較暗外，1～9號(hào)的條帶總體上沒有明顯的差異，僅6號(hào)泳道的61.6℃與7號(hào)的62.8℃的擴(kuò)增效果相對(duì)較佳，因此確定優(yōu)化的退火溫度為62℃。

2.3.2 Mg2+濃度的優(yōu)化

圖4 Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Fig.4 Effect of Mg2+concentration on PCR amplification

設(shè)置9個(gè)Mg2+濃度梯度，應(yīng)用2.3.1節(jié)中優(yōu)化的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，預(yù)期的DNA條帶的亮度伴隨Mg2+濃度的變化而變化。Mg2+濃度從0mmol/L到1.5mmol/L，DNA條帶逐漸變亮。Mg2+濃度從2.0mmol/L開始目的DNA片段條帶逐漸變淡，且各泳道在100～300bp之間的位置都出現(xiàn)了2條非預(yù)期的DNA雜帶。因此，第4號(hào)泳道1.5mmol/L為最佳的Mg2+濃度。

2.3.3 Taq DNA聚合酶用量的優(yōu)化

按照優(yōu)化的Mg2+濃度(其他因素按照1.7節(jié)方法)，配制PCR混合液，以優(yōu)化后的退火溫度，對(duì)Taq DNA聚合酶用量進(jìn)行優(yōu)化擴(kuò)增，結(jié)果見圖5。

圖5 Taq DNA聚合酶用量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Fig.5 Effect of Taq DNA polymerase amount on PCR amplification

由圖5可知，目的DNA片段條帶的亮度伴隨Taq DNA聚合酶用量的增加而逐漸增強(qiáng)。Taq DNA聚合酶在0U時(shí)，沒有任何條帶，在0.5U時(shí)出現(xiàn)了清晰的條帶。Taq DNA聚合酶用量為1.5～2.5U之間時(shí)，在100～300bp之間的位置都出現(xiàn)了2條預(yù)期外的雜帶，且雜帶亮度隨Taq DNA聚合酶用量的增加而增強(qiáng)。顯然由于Taq DNA聚合酶用量過高，導(dǎo)致DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。為了保證目的條帶的亮度，又能避免預(yù)期外雜帶的出現(xiàn)，選用1.0U作為優(yōu)化的Taq DNA聚合酶用量。

2.3.4 dNTPs濃度的優(yōu)化

按照已優(yōu)化的Mg2+濃度和Taq DNA聚合酶用量(其他因素按1.7節(jié))，配制PCR混合液，以優(yōu)化后的退火溫度，對(duì)dNTPs濃度進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖6。

圖6 dNTPs濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效果的影響Fig.6 Effect of dNTPs concentration on PCR amplification

由圖6可知，目的DNA條帶的亮度伴隨dNTPs濃度的增加而增強(qiáng)。dNTPs濃度在0μmol/L時(shí)，沒有任何條帶，在100μmol/L時(shí)就出現(xiàn)了清晰的條帶。當(dāng)dNTPs濃度達(dá)到400μmol/L以上時(shí)，在100～300bp之間的位置出現(xiàn)了2條微弱的非預(yù)期雜帶。為了保證目的條帶足夠的清晰明亮，且避免非特異擴(kuò)增雜帶的出現(xiàn)，選用300μmol/L作為優(yōu)化的dNTPs濃度。

2.3.5 引物濃度的優(yōu)化

按照已優(yōu)化的Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶用量、dNTPs濃度(其他因素按照1.7節(jié))，配制PCR混合液，以優(yōu)化的退火溫度，對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖7。

圖7 引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Fig.7 Effect of primer concentration on PCR amplification

由圖7可知，除了引物濃度在0μmol/L時(shí)沒有條帶以外，引物濃度在0.1μmol/L以上的均能在預(yù)期位置擴(kuò)增出明亮、清晰的條帶，且條帶無明顯變化。因此從0.1μmol/L到0.5μmol/L均可滿足PCR對(duì)引物濃度的要求。為了保證條帶清晰明亮并考慮到成本的因素，選用0.2μmol/L為優(yōu)化的引物濃度。

2.3.6 模板DNA用量對(duì)擴(kuò)增的優(yōu)化

按照優(yōu)化的Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶用量、dNTPs濃度和引物濃度配制PCR混合液，以優(yōu)化的退火溫度，對(duì)模板DNA用量進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖8。

圖8 DNA模板濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Fig.8 Effects of DNA template concentration on PCR amplification

由圖8可知，預(yù)期的DNA條帶的亮度伴隨模板DNA用量的減少而逐漸變淡。模板DNA用量在400ng時(shí)，條帶最亮。模板DNA用量0ng時(shí)，沒有任何條帶出現(xiàn)。選用400ng為優(yōu)化的模板DNA用量。

2.4 優(yōu)化后的PCR體系與溫度程序的建立以及優(yōu)化前后的擴(kuò)增效果比較

2.4.1 優(yōu)化后的PCR體系與溫度程序的建立

通過對(duì)PCR體系和退火溫度的優(yōu)化，確立最佳的PCR體系和溫度程序：10×PCR緩沖液2μL，MgCl2終濃度1.5mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，dNTPs終濃度300μmol/L，引物終濃度0.2μmol/L，DNA模板400ng，加純水至總體積20μL。擴(kuò)增程序定為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min，4℃保存。

2.4.2 優(yōu)化前后的擴(kuò)增效果比較

以優(yōu)化后的PCR體系與溫度程序?qū)┰?種河豚魚樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同樣取10μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，獲得的結(jié)果(圖9B)比優(yōu)化前的擴(kuò)增結(jié)果(圖9A)好得多。

圖9 PCR體系優(yōu)化前、后的8種河豚魚的PCR結(jié)果比較Fig.9 Comparison between PCR results of 8 puffer fish obtained with pre-optimization PCR system and with post-optimization PCR system

2.5 非河豚魚樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖10 非河豚樣品的河豚魚成分PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.10 PCR results of puffer fish component in non-puffer fish samples

圖10 顯示，除作為陽性對(duì)照樣品(1號(hào)泳道)的東方紅鰭鲀(T. rubripes)外，CK與2～13號(hào)泳道均未出現(xiàn)目的條帶。這表明，應(yīng)用引物HT-1能在供試河豚樣品中擴(kuò)增出預(yù)期的DNA條帶，而在空白對(duì)照與供試的非河豚樣品中均未能擴(kuò)增出相應(yīng)的DNA條帶?？梢?，引物HT-1對(duì)河豚魚有良好的特異性，能夠達(dá)到鑒別、區(qū)分河豚和非河豚樣品的目的。

2.6 河豚魚成分的檢出限與檢出率

2.6.1 檢出限

圖11 不同河豚魚含量的混合樣品PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.11 PCR results of mixed samples with different contents of puffer fish

從圖11可以看出，含量為100%到0.1%的棕斑腹刺鲀(G. spadiceus)混合樣(以1g河豚粉末與999g陰性美國白魚粉混合)均能擴(kuò)增出清晰明亮的目的條帶。說明該方法至少可以檢出河豚魚(棕斑腹刺鲀)含量為0.1%的混合樣品中的河豚魚成分。說明該P(yáng)CR方法的河豚魚成分檢測(cè)限(靈敏度)為0.1%。

2.6.2 檢出率

在8個(gè)河豚樣品中選取3個(gè)樣品，與美國白魚粉混合成河豚魚含量為1%和0.1%的混合樣品，進(jìn)行檢出率測(cè)試，結(jié)果見表5。

表5 3種河豚不同含量樣品的檢出率Table5 Detection rates in 3 samples with different contents of puffer fish

從表5可知，對(duì)于3個(gè)河豚魚樣品，該方法在含量為1%時(shí)檢出率均能達(dá)到達(dá)到100%。當(dāng)河豚含量下降到0.1%時(shí)，棕斑腹刺鲀和黑腮兔頭鲀的檢出率仍為100%，暗紋東方鲀檢出率為97.5%，說明該P(yáng)CR方法有足夠穩(wěn)定性。

上述PCR分析結(jié)果表明，該方法的靈敏度或檢出限為0.1%，3個(gè)含量為0.1%的河豚魚樣品經(jīng)過80次PCR測(cè)試，結(jié)果表明檢出率都在97.5%以上。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Genbank公布的兩種河豚，即懷氏兔頭鲀(Lagocephalus wheeleri)和克氏兔頭鲀(Lagocephalus gloveri)的線粒體細(xì)胞色素b基因DNA序列，設(shè)計(jì)了7條引物。參考有關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，初步設(shè)定PCR反應(yīng)體系與溫度循環(huán)程序，對(duì)7對(duì)引物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)引物HT-1在供試的8個(gè)樣品中都能擴(kuò)增出目的DNA片段。在該初步設(shè)定的PCR反應(yīng)體系與溫度循環(huán)程序基礎(chǔ)上，對(duì)影響PCR反應(yīng)的6個(gè)主要因素包括退火溫度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶用量、dNTPs濃度、引物濃度和模板DNA濃度進(jìn)行逐一優(yōu)化。確定優(yōu)化后的PCR擴(kuò)增體系：10×PCR緩沖液2μL，MgCl2終濃度1.5mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，dNTPs終濃度300μmol/L，引物終濃度0.2μmol/L，DNA模板400ng，總體積為20μL。溫度程序定為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。在PCR反應(yīng)體系(總體積20μL)與溫度循環(huán)程序的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)Mg2+終濃度超過2.0mmol/L、dNTPs終濃度超過400μmol/L時(shí)，都會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，出現(xiàn)雜帶，與文獻(xiàn)[9-10]的結(jié)果一致?？赡苁怯捎贛g2+濃度過高，導(dǎo)致DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。dNTPs是作為PCR反應(yīng)的原料參與新鏈DNA的合成，過高濃度的dNTPs會(huì)使核苷酸錯(cuò)誤摻入[11]。本研究還發(fā)現(xiàn)Taq DNA聚合酶用量太多(超過1.5U)時(shí)，因酶用量過高，導(dǎo)致擴(kuò)增特異性降低，出現(xiàn)雜帶，與文獻(xiàn)[12]的結(jié)果一致。

通過優(yōu)化前、后PCR擴(kuò)增效果的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的擴(kuò)增效果明顯比優(yōu)化前的好。以優(yōu)化后的PCR體系與溫度程序?qū)与圄~陽性樣品與非河豚魚陰性樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得預(yù)期的理想結(jié)果，表明本實(shí)驗(yàn)建立的PCR方法對(duì)供試的河豚魚樣品具有特異性。根據(jù)棕斑腹刺鲀河豚魚樣品不同含量梯度的PCR分析表明，該方法的靈敏度或檢出限為小于等于0.1%，3個(gè)含量為0.1%的河豚魚樣品經(jīng)過80次PCR測(cè)試，結(jié)果表明2個(gè)樣品檢出率為100%，1個(gè)檢出率為97.5%，這些結(jié)果說明了該P(yáng)CR方法的穩(wěn)定性?？梢娭灰O(shè)置一定的重復(fù)次數(shù)，該方法可應(yīng)用于食品中河豚魚成分的檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐。這些結(jié)果為該方法應(yīng)用于食品中河豚魚成分的檢測(cè)實(shí)踐提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

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Primer Screening and Optimization of PCR System for the Detection of Puffer Fish

CHEN Wen-bing1，ZHAO Chen1,2，SHAO Bi-ying1，JIANG Shu-xun1，YAN Cheng1，LI Shou-song1，LIN He-tong2
(1. Fujian Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China；2. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

According to the sequence of cytochrome b gene of puffer fish published in GenBank, seven pairs of puffer fishspecific primers were designed with Primer Premier 5.00 version. After PCR screening, the primer HT-1, which could detect the target DNA fragment in eight samples of puffer fish from different aquatic breeding farm in Fujian province, was selected to establish a PCR method for the detection of puffer fish in this work. Furthermore, six key factors affecting PCR including Taq enzyme and template DNA amounts as well as final magnesiumion (Mg2+), dNTPs and primer concentrations were optimized in order to establish optimal PCR system. And the optimal composition of a 20μL PCR system in water consisted of 2μL of 10 × PCR buffer, 1.5 mmol/L MgCl2, 1.0 U Taq DNA polymerase, 300μmol/L dNTPs, 0.2μmol/L primer and 400 ng of template DNA. The thermal program for PCR was as follows: predenaturation at 94 ℃ for 5 min, denaturation at 94 ℃ for 30 sec, annealing at 62 ℃ for 30 s, polymerization at 72 ℃ for 30 s, and after 40 cycles, final polymerization at 72 ℃ for 5 min. The proposed PCR method was found to be specific through the comparison of PCR results amplified from puffer fish DNA and non-puffer fish DNA. The detection limit was 0.1%, and PCR detection rate for 0.1% content of puffer fish samples was 97.5% or more.

puffer fish；primer screening；PCR detection；optimization

S917.4；Q78

A

1002-6630(2010)20-0376-06

2010-06-08

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技項(xiàng)目(2008IK175)

陳文炳(1962—)，男，研究員，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品、食品分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究。E-mail：621213wbc@163.com