高速逆流色譜分離制備茶粕中茶皂素單體

陳 力，鄧澤元，胡蔣寧*，李 靜，范亞葦，劉 蓉

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

高速逆流色譜分離制備茶粕中茶皂素單體

陳 力，鄧澤元，胡蔣寧*，李 靜，范亞葦，劉 蓉

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

目的：建立一種高效、快速的分離制備茶皂素單體的高速逆流色譜方法。方法：微波輔助提取茶皂素后，用D-101大孔樹(shù)脂初步純化，所得粗品經(jīng)高速逆流色譜分離純化，乙酸乙酯-正丁醇-水(1:4:4，V/V，含體積分?jǐn)?shù)3%的乙酸)為兩相溶劑系統(tǒng)，轉(zhuǎn)速800r/min、流速1.5mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)267nm、進(jìn)樣量100mg，所得分離收集液經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)。結(jié)果：從茶皂素粗提物中分離得到純度分別為99.1%和94.5%的兩種茶皂素單體，經(jīng)干燥稱得其質(zhì)量分別為11mg和15mg。結(jié)論：該方法制備茶皂素單體簡(jiǎn)便、快速，所得產(chǎn)物的純度高，為茶皂素的分離純化提供了一種新途徑。

高速逆流色譜(HSCCC)；茶皂素單體；制備；純化

茶粕，又稱茶籽餅，呈紫褐色顆粒，是野山茶油果實(shí)榨油后所剩的渣。茶粕中含有11%～13%的茶皂素。茶皂素又名茶皂苷，是一種純天然非離子型表面活性劑。目前，茶皂素已廣泛用于各行業(yè)中。在農(nóng)藥上，茶皂素可以作為農(nóng)藥濕潤(rùn)劑、增效劑或直接用于殺蟲(chóng)劑、殺菌劑、殺螨劑；在紡織業(yè)上，茶皂素對(duì)蛋白質(zhì)纖維無(wú)損傷，其優(yōu)良的去污、起泡、穩(wěn)泡等多種功能，使其在對(duì)絲織物等的洗滌方面具有優(yōu)越性；在醫(yī)藥上，茶皂素具有其他表面活性劑所沒(méi)有的抗?jié)B、消炎、鎮(zhèn)痛、抗癌等藥理功能；在養(yǎng)殖業(yè)上，利用茶皂素的溶血和魚(yú)毒作用，可殺死有害魚(yú)類(lèi)，但對(duì)蝦無(wú)影響，用于蝦養(yǎng)殖的清池劑；在建筑上，茶皂素可以作為加氣混凝土的氣泡穩(wěn)定劑；在日用化工上，利用茶皂素的表面活性作用，可用于洗發(fā)劑和洗面劑等；在食品行業(yè)上，作為發(fā)泡劑、穩(wěn)泡劑應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)[1]。

目前，對(duì)茶皂素的提取大多采用水提法[2]、有機(jī)溶劑法[3]、超濾膜法[4]等，這些方法不同程度地存在得率低、提取時(shí)間長(zhǎng)、能耗大、純度低等不足，本研究采用微波輔助提取、高速逆流色譜(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)純化茶皂素單體。高速逆流色譜是一種新型的液-液分配色譜技術(shù)，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品在互不相溶的兩相溶劑系統(tǒng)中的高效分配，從而實(shí)現(xiàn)樣品分離。HSCCC最大的優(yōu)點(diǎn)在于每次的進(jìn)樣量比較大，可以達(dá)到毫克量級(jí)，甚至克量級(jí)；同時(shí)，由于不需要固體支撐物，因而避免了固體固定相不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等問(wèn)題，樣品回收率高[5]。目前，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)HSCCC分離制備茶皂素的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用高速逆流色譜對(duì)茶粕中的茶皂素單體進(jìn)行純化，優(yōu)化最佳的分離純化條件，為茶皂素單體的理化性質(zhì)和生物學(xué)作用研究提供純品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶餅粕 江西省宜春市青龍高科技股份有限公司；茶皂素對(duì)照品(純度>80%) 上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TBE-300A型高速逆流色譜儀 上海同田生化技術(shù)有限公司；AKTA Purifier100蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(配有UV900檢測(cè)器、UNICORN 5.10工作站) 瑞士Amersham公司；1100高效液相色譜儀(配有DAD檢測(cè)器) 美國(guó)安捷倫公司；FW135手提式高速中藥粉碎機(jī) 溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市英峪予華儀器廠；BSZ-自動(dòng)部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；格蘭仕微波爐。

1.3 方法

1.3.1 茶皂素粗提物的制備

茶粕干燥后粉碎過(guò)篩，用兩倍體積的石油醚加熱回流脫脂。稱取50g預(yù)處理后的茶粕粉末，加入一定量的傳熱介質(zhì)，以加熱功率為800W，55%微波＋45%光波輻射，時(shí)間為2min進(jìn)行微波預(yù)處理后，加入80%乙醇浸提數(shù)分鐘，過(guò)濾。重復(fù)操作3次，合并濾液，濃縮揮干乙醇后用水飽和的正丁醇萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮至干得到粗茶皂素。

1.3.2 茶皂素粗品的初步純化

采用D-101大孔樹(shù)脂初步純化。配制粗茶皂素含量為20mg/mL左右的上樣液，以1BV/h的流速動(dòng)態(tài)上樣，上樣量為3～4BV。上樣吸附后先用水洗至Molish反應(yīng)呈陰性，再用70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集流出液，旋干，用于進(jìn)一步分離實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6-9]及茶皂素極性，選取幾種溶劑系統(tǒng)，通過(guò)測(cè)定分配系數(shù)K和分層時(shí)間來(lái)進(jìn)行篩選。

將所選的溶劑系統(tǒng)在分液漏斗中充分混勻，靜置過(guò)夜使其分配平衡。再用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定分配系數(shù)K：取分配平衡的兩相溶劑系統(tǒng)的上、下相各3mL，加入茶皂素粗品，漩渦振蕩，使其在兩相溶劑中的分配達(dá)到平衡。取等體積的上、下相溶液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干；分別用甲醇溶解經(jīng)HPLC法測(cè)定分析其峰面積，計(jì)算分配系數(shù)K：

K= A1/A2

式中：K為分配系數(shù)；A1為上相峰面積/(μV·s)；A2為下相峰面積/(μV·s)。

HPLC測(cè)定條件：色譜柱：Agilent ODS C18column (250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：267nm，參考波長(zhǎng)：350nm，流動(dòng)相：乙腈-水；采用梯度洗脫，梯度為：0～20min時(shí)，乙腈體積分?jǐn)?shù)逐漸由20%變?yōu)?5%，20～25min，乙腈體積分?jǐn)?shù)再由15%變?yōu)?0%；流速：0.5mL/min。

兩相溶劑體系分層時(shí)間的測(cè)定：取分配平衡的溶劑系統(tǒng)的上相和下相2mL，漩渦振蕩后開(kāi)始計(jì)時(shí)，直至兩相完全分開(kāi)，計(jì)算時(shí)間。反復(fù)數(shù)次得平均值。

1.3.4 高速逆流色譜分離純化茶皂素

用分液漏斗配制一定比例的兩相溶劑體系，充分振搖后靜置過(guò)夜，分離上下相，兩相分別超聲脫氣30min。稱取100mg樣品，用3mL下相溶解離心，作為樣品溶液。以上相為高速逆流色譜的固定相，下相為流動(dòng)相。開(kāi)啟恒溫循環(huán)裝置使溫度保持在30℃，將固定相以15mL/min的流速泵入高速逆流色譜儀的分離柱中，待固定相充滿管道后，啟動(dòng)高速逆流色譜儀主機(jī)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)。以一定的流速泵入流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相從分離柱出口流出約30mL時(shí)，兩相體系已經(jīng)在高速逆流色譜的分離柱中達(dá)到流體動(dòng)力學(xué)平衡。此時(shí)將分離柱出口與紫外檢測(cè)器及色譜工作站連接，開(kāi)啟紫外燈，待基線平穩(wěn)后將樣品溶液注入進(jìn)樣環(huán)中，在267nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)色譜圖的出峰情況自動(dòng)收集流出組分。1.3.5分離物的鑒定

對(duì)茶皂素對(duì)照品、茶皂素粗品和經(jīng)HSCCC分離純化所收集的樣液進(jìn)行HPLC圖譜分析。并向茶皂素粗品中加入茶皂素對(duì)照品后進(jìn)行HPLC分析鑒定。HPLC條件同1.3.3節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑系統(tǒng)的選擇

在高速逆流色譜中，溶劑體系的選擇至關(guān)重要。主要應(yīng)考慮溶劑對(duì)分離物質(zhì)的溶解性、分配系數(shù)K、分離因子α、分層時(shí)間、分離過(guò)程中固定相保留率等。對(duì)HSCCC最合適的K值范圍是0.5～2，當(dāng)K＜＜0.5時(shí)，目標(biāo)化合物與雜質(zhì)峰重疊無(wú)法分離；當(dāng)K＞＞2時(shí)，會(huì)使分離時(shí)間延長(zhǎng)，峰展寬現(xiàn)象嚴(yán)重，目標(biāo)化合物的純度降低[10]。分離因子α應(yīng)在1.5～2之間為好。另外，溶劑系統(tǒng)的乳化會(huì)將固定相帶出，因此其分層時(shí)間應(yīng)小于30s[11]。

本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)，采用了4種不同的溶劑系統(tǒng)，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)節(jié)其配比系數(shù)比來(lái)優(yōu)化溶劑系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于茶皂素是一種很強(qiáng)的表面活性劑，會(huì)造成嚴(yán)重的乳化，因此在溶劑體系中加入少量乙酸來(lái)改善乳化現(xiàn)象。4種溶劑體系的分配系數(shù)及分離因子列于表1。

表1 不同溶劑體系的分配系數(shù)、分離因子和分層時(shí)間Table1 Partition coefficients (K values), separation factors (α) and settling time in different two-phase solvent systems

圖1 不同溶劑系統(tǒng)的茶皂素提取物HSCCC譜圖Fig.1 HSCCC profiles of teasaponin monomers obtained with different solvent systems

從表1可知，以正己烷-正丁醇-水(含3%乙酸)作溶劑系統(tǒng)時(shí)，分配系數(shù)太小，會(huì)使各色譜峰擁擠在一起；以氯仿-甲醇-正丁醇-水(含3%乙酸)作溶劑系統(tǒng)時(shí)，分配系數(shù)太大，峰展寬嚴(yán)重，會(huì)降低目標(biāo)產(chǎn)物的純度。乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水(含3%乙酸)體系的分配系數(shù)合理，但兩個(gè)分配系數(shù)較接近導(dǎo)致分離因子不符合最優(yōu)值。當(dāng)以乙酸乙酯-正丁醇-水(1:3:4、1:4:4，V/V，含3%乙酸)為溶劑系統(tǒng)時(shí)，分配系數(shù)、分離因子及沉降時(shí)間均為最優(yōu)值，有利于HSCCC的分離。

通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)際上機(jī)實(shí)驗(yàn)可知，當(dāng)以乙酸乙酯-正丁醇-水(含3%乙酸)為1:3:4(V/V)為溶劑系統(tǒng)時(shí)，HSCCC的固定相保留率為31%；而乙酸乙酯-正丁醇-水(含3%乙酸)為1:4:4(V/V)時(shí)，固定相保留率為46%。且由圖1可以看出，以乙酸乙酯-正丁醇-水(含3%乙酸)為1:4:4(V/V)為溶劑系統(tǒng)時(shí)，色譜圖的噪音值較低且分離度更好。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)選擇HSCCC溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯-正丁醇-水(含3%乙酸)，其比例為1:4:4(V/V)。

2.2 HSCCC條件優(yōu)化

圖2 流動(dòng)相不同流速和轉(zhuǎn)速條件HSCCC譜圖Fig.2 HSCCC profiles of teasaponin monomers obtained under different mobile phase flow rates and rotary speeds

確定了HSCCC溶劑系統(tǒng)的成分和比例后，對(duì)設(shè)備參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化以使分離效果達(dá)到最好。影響HSCCC分離效果的因素主要有流動(dòng)相流速、轉(zhuǎn)速及進(jìn)樣量等，而柱溫對(duì)分離時(shí)間及分離度的影響均不顯著。通過(guò)選擇實(shí)驗(yàn)，由圖2a、2b所示，當(dāng)流速為1.8mL/min時(shí)，峰沒(méi)有完全分開(kāi)，且轉(zhuǎn)速為800r/min時(shí)的固定相保留率為23%，而600r/min時(shí)為17%，表明低轉(zhuǎn)速會(huì)導(dǎo)致固定相的損失，降低固定相保留率，不利于目標(biāo)物的分離。圖2c所示，當(dāng)流速為1.5mL/min、轉(zhuǎn)速為800r/min時(shí)，兩個(gè)峰完全分開(kāi)，固定相保留率為46%。通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到HSCCC最佳操作條件：流動(dòng)相流速1.5mL/min、固體轉(zhuǎn)速800r/min、進(jìn)樣量100mg、進(jìn)樣液3mL。

2.3 HSCCC分離結(jié)果

在上述優(yōu)化的條件下，茶皂素經(jīng)高速逆流分離得到2個(gè)較明顯的峰(圖1A)，分離時(shí)間為350min。分別收集這2個(gè)峰，進(jìn)一步采用HPLC對(duì)其純度進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 分離物的鑒定

茶皂素對(duì)照品、粗品、HSCCC分離所收集的峰樣液以及茶皂素粗品加對(duì)照品的HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。經(jīng)HPLC檢測(cè)，在波長(zhǎng)267nm條件下，通過(guò)和茶皂素對(duì)照品對(duì)照，粗品中有2個(gè)主要的峰，加入對(duì)照品后，2個(gè)峰的峰面積有所增加且出峰時(shí)間與對(duì)照品一致，而且起泡性很強(qiáng)，說(shuō)明這兩個(gè)峰為茶皂素單體。

圖3 茶皂素HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of teasaponin standard, crude extract, crude extract with teasaponin standard from tea seed cake and two separated teasaponin monomers

根據(jù)面積歸一化法，粗品中2個(gè)單體的純度分別為37.4%、47.5%，經(jīng)HSCCC分離后，單體1的純度為99.1%，單體2的純度為94.5%，取得了很好的分離效果。

對(duì)收集的峰樣液蒸去溶劑后干燥稱量，得茶皂素單體1的質(zhì)量為11mg，單體2為15mg。

3 討 論

3.1 微波預(yù)處理能提高茶皂素得率

目前，茶皂素的提取方法很多。伍曉春等[3]通過(guò)有機(jī)溶劑浸提法提取茶皂素；曹萬(wàn)新等[4]在0.1～0.14MPa的壓力使精濾后溶液進(jìn)入膜設(shè)備來(lái)分離提取茶皂素。本研究采用微波輔助提取法，通過(guò)微波透射到生物組織內(nèi)部，使物體內(nèi)部分子產(chǎn)生振動(dòng)和摩擦，對(duì)物體進(jìn)行由內(nèi)向外加熱。微波輔助提取只要幾分鐘，大大縮短了提取時(shí)間，提高了提取率。此方法今后也可用于其他植物提取物的提取工藝中。

3.2 HSCCC能高效快速地分離茶皂素

近年來(lái)，茶皂素單體不斷被分離純化出來(lái)。李靜等[12]用硅膠柱層析法使非極性雜質(zhì)和茶皂素得到有效分離，經(jīng)薄層檢測(cè)得到單一皂苷點(diǎn)；Lu等[13]通過(guò)葡聚糖凝膠柱及制備型HPLC從茶根中分離出3種茶皂素單體；Kobayashi等[14]用硅膠柱和反相HPLC從山茶樹(shù)葉的乙醇提取物里分離純化出3種新皂苷。目前大多采用柱層析的方法分離純化茶皂素，此法所需時(shí)間周期長(zhǎng)，且固定相對(duì)樣品有不可逆吸附。本實(shí)驗(yàn)中HSCCC只需350min即可分離茶皂素，操作簡(jiǎn)單，所得單體純度高，實(shí)現(xiàn)了快速高效地分離茶皂素單體。

溶劑體系的選擇和優(yōu)化是HSCCC中一項(xiàng)關(guān)鍵的步驟，文獻(xiàn)報(bào)道兩相溶劑系統(tǒng)的選定約占整個(gè)HSCCC工作量的90%以上[15]。目前，溶劑體系的選擇還沒(méi)有充分的理論依據(jù)，大多是參考已知溶劑體系或根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)而進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)，分別采用4種不同的溶劑系統(tǒng)，對(duì)目標(biāo)化合物峰1、峰2的分配系數(shù)進(jìn)行了比較分析。根據(jù)分析結(jié)果得知，采取乙酸乙酯-正丁醇-水(含3%乙酸)(1:4:4，V/V)體系可將2種茶皂素單體成功分開(kāi)，并與其他雜質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)分離。實(shí)際上，目標(biāo)化合物的極性差別是影響HSCCC色譜分離條件的一個(gè)重要因素。在已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)中，研究者們還可以通過(guò)改變HSCCC的色譜分離條件(流速或轉(zhuǎn)速)來(lái)提高色譜峰的分辨率，并獲得純度更高的目標(biāo)化合物[16]。

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Isolation and Preparation of Teasaponin Monomers from Tea Seed Cake by High-Speed Counter-current Chromatography

CHEN Li，DENG Ze-yuan，HU Jiang-ning*，LI Jing，F(xiàn)AN Ya-wei，LIU Rong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To develop a rapid and efficient method for preparing teasaponin monomers from tea seed cake using preparative high-speed counter-current chromatography (HSCCC). Methods: A crude extract rich in teasaponin monomers was obtained from tea seed cake by microwave-assisted extraction, and preliminarily purified by D-101 macroporous resin chromatography, followed by further HSCCC purification/fractionation with a binary phase system made up of ethyl acetate, n-butanol and 3% acetate (1:4:4, V/V) at a flow rate of 1.5 mL/min with rotation at 800 r/min under the conditions of 267 nm detection wavelength and 100 mg sample load. The final purification product was analyzed by HPLC. Results: Two teasaponin monomers with 99.1% and 94.5% purities were obtained after the HSCCC separation, and their dry weights were 11 mg and 15 mg, respectively. Conclusion: The proposed HSCCC method has the characteristics of simplicity, rapidity and high product purity, thereby providing a novel strategy for the separation of teasaponin monomers.

high-speed counter-current chromatography (HSCCC)；teasaponin monomers；preparation；purification

TS209

A

1002-6630(2010)20-0127-05

2010-06-27

2010年江西省重大科技專(zhuān)項(xiàng)

陳力(1987—)，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物活性成分研究。E-mail：327477891@163.com

*通信作者：胡蔣寧(1981—)，男，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分研究。E-mail：hujiangning2005@hotmail.com