MicroRNA保護(hù)線(xiàn)粒體功能延緩急性腎損傷的研究進(jìn)展

曾雅妮 綜述 成梅初 審校

急性腎損傷(AKI)是重癥患者的常見(jiàn)并發(fā)癥，可導(dǎo)致患者死亡率和慢性腎臟病(CKD)的發(fā)生率增加。AKI可伴有細(xì)胞線(xiàn)粒體功能紊亂伴隨缺血缺氧，也是CKD的常見(jiàn)的原因之一，目前尚缺乏有效的治療方法來(lái)阻止CKD的進(jìn)展。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)大量的特異性microRNA(miRNA)參與AKI的發(fā)病機(jī)制[1]。已有研究描述了不同AKI模型中線(xiàn)粒體損傷在腎臟疾病發(fā)展和進(jìn)展中的致病作用[2-3]。本文擬對(duì)miRNA與AKI的發(fā)病和治療等關(guān)系進(jìn)行綜述，重點(diǎn)探討miRNA在腎損傷中調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體功能的可能機(jī)制，并討論其在AKI治療中的潛力。

miRNA參與線(xiàn)粒體活性氧(ROS)的產(chǎn)生與自噬

在腎缺血再灌注損傷(IRI)過(guò)程中，ROS的過(guò)量產(chǎn)生主要發(fā)生在再灌注早期，并在此后持續(xù)24 h，研究證明，腎近端小管細(xì)胞對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的過(guò)量ROS引起的氧化應(yīng)激特別敏感，過(guò)量的ROS會(huì)損害線(xiàn)粒體，引發(fā)炎癥和凋亡，而線(xiàn)粒體又是細(xì)胞中ROS的主要來(lái)源[4]。Bai等[5]發(fā)現(xiàn)miR-335和miR-34a的過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制線(xiàn)粒中的超氧化物歧化酶2(SOD2)和硫氧還蛋白還原酶2(Txnrd2)誘導(dǎo)系膜細(xì)胞提前衰老，同時(shí)伴隨著ROS的增加，在該研究中，衰老腎臟固有細(xì)胞中上調(diào)的miRNA主要調(diào)控與能量代謝、細(xì)胞增殖、抗氧化防御和細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的途徑或基因，而下調(diào)的miRNA主要針對(duì)與免疫炎癥反應(yīng)和細(xì)胞周期停滯相關(guān)的途徑或基因。在這一層面對(duì)于指導(dǎo)研究者對(duì)miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行篩選時(shí)有一定的意義。生理?xiàng)l件下，抗氧化基因產(chǎn)物在ROS的解毒中起主要作用。Cao等[6]發(fā)現(xiàn)miRNA200a-3p可激活腎小管細(xì)胞(TECs)中線(xiàn)粒體自身的抗氧化Keap1-Nrf2信號(hào)通路，減少ROS的產(chǎn)生防止線(xiàn)粒體碎裂。事實(shí)上，單個(gè)miRNA可以多個(gè)mRNAs為靶標(biāo)，如 miR4270參與調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR、NOX5等表達(dá)，PI3K/AKT/mTOR與線(xiàn)粒體自噬有關(guān)[7]，NOX5是一種NAPH氧化酶，它的獨(dú)特功能與產(chǎn)生大量ROS有關(guān)[8]。而miR-145可通過(guò)調(diào)節(jié)LC3和Beclin 1及p62這三種自噬相關(guān)蛋白，從而抑制PI3K/AKT/mTOR的磷酸化，增加LC3B染色陽(yáng)性和自噬體數(shù)量來(lái)達(dá)到保護(hù)腎臟細(xì)胞的目的[9]。LC3蛋白位于自噬體前體膜表面，有A和B兩種類(lèi)型，當(dāng)自噬小體形成時(shí)，LC3A轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3B，LC3B通過(guò)與自噬小體表膜結(jié)合參與自噬溶酶體的形成。因此，LC3B染色陽(yáng)性增加被認(rèn)為是自噬增強(qiáng)[10]。

線(xiàn)粒體生物發(fā)生及代謝解偶聯(lián)

線(xiàn)粒體生物發(fā)生是增加細(xì)胞中線(xiàn)粒體質(zhì)量的過(guò)程[11]，包括兩種形式,第一種是裂變和融合形成新的線(xiàn)粒體，第二種是先前存在的線(xiàn)粒體的合成。后者主要在轉(zhuǎn)錄水平上被調(diào)節(jié),需要包括過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體r共激活因子1α(PGC-1α)、線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)和核呼吸因子(NRF)在內(nèi)的主要調(diào)節(jié)因子的協(xié)同表達(dá)。在膿毒癥性AKI患者研究中，miR-142-5p，miR-191-5p，miR-3165，miR-4270和miR-23a-3p均與PGC-1α基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)[12]，而PGC-1α的主要作用之一是激活線(xiàn)粒體生物發(fā)生和氧化磷酸化[13]。miR-23a-3p，miR-22-3p，miR-4456均參與調(diào)控PGC-1α上游基因sirt1的表達(dá)，sirt1作為線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,是一種位于線(xiàn)粒體基質(zhì)中激活PGC-1α的主要脫乙酰化酶[14]。線(xiàn)粒體是一種動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，通過(guò)分裂和融合來(lái)維持其活性和功能，有研究表明miR-30抑制動(dòng)態(tài)相關(guān)蛋白1(drp1)可以預(yù)防AKI[15]，敲除腎小管上皮細(xì)胞中的線(xiàn)粒體內(nèi)膜蛋白18(MTP18)能促進(jìn)AKI的恢復(fù)和減輕纖維化[16]，這表明線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)的控制可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)異常導(dǎo)致的線(xiàn)粒體斷裂是AKI及CKD(如糖尿病腎病)的重要原因之一[17]。Yu等[18]發(fā)現(xiàn)無(wú)論是體內(nèi)或體外的腎缺血模型都可誘導(dǎo)miRNA-214的表達(dá)，能抑制腎小管細(xì)胞表達(dá)絲裂霉素2(Mfn2，一種關(guān)鍵的線(xiàn)粒體融合蛋白)，而用miRNA-214抑制劑可以阻止腎小管近端細(xì)胞ATP耗竭后Mfn2的下調(diào),改善線(xiàn)粒體斷裂和凋亡。在缺血再灌注損傷中，缺氧誘導(dǎo)miRNA-668表達(dá)上調(diào)，它通過(guò)抑制MTP18以維持線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)和腎小管細(xì)胞的活力，并且miR-668的上調(diào)是腎小管上皮細(xì)胞在早期和亞急性階段的一種保護(hù)性反應(yīng)，這表示線(xiàn)粒體斷裂的抑制是一個(gè)早期事件，發(fā)生在再灌注15 min，并在亞急性損傷階段(12～24h)仍可檢測(cè)到且能持續(xù)到一定水平[19]。因此，miR-668是否可以進(jìn)一步促進(jìn)AKI的恢復(fù)和改善后續(xù)的纖維化值得深入研究。有研究者在順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠模型和人AKI腎組織的活檢樣本中檢測(cè)到近腎小管細(xì)胞(PTCs)中miR-709顯著上調(diào),而線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄因子(TFAM)的基因修復(fù)可減輕順鉑或miR-709過(guò)表達(dá)所致的線(xiàn)粒體功能障礙和細(xì)胞損傷[20]，可見(jiàn)調(diào)節(jié)腎臟固有細(xì)胞中的TFAM可能成為抗miR-709誘導(dǎo)腎臟修復(fù)的機(jī)制，且這種干預(yù)不僅可增強(qiáng)線(xiàn)粒體生物發(fā)生，還可以減輕巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥、改善腎功能障礙程度、腎小管細(xì)胞壞死和凋亡。

解偶聯(lián)蛋白(UCPs)是線(xiàn)粒體內(nèi)膜上表達(dá)的一類(lèi)線(xiàn)粒體陰離子載體蛋白，它將質(zhì)子從內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到基質(zhì)中，從而導(dǎo)致內(nèi)膜電位的降低，減少電子傳遞鏈上的ROS釋放。當(dāng)發(fā)生AKI時(shí)，線(xiàn)粒體內(nèi)膜通透性改變，膜電位完全喪失，導(dǎo)致ROS的爆發(fā)。有研究者通過(guò)篩查全基因表達(dá)譜的方法確定了UCP1在腎小管中廣泛表達(dá)，是參與ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子，且它的轉(zhuǎn)錄也受PGC-1α的調(diào)控[21]。Leijiang等[22]發(fā)現(xiàn)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠模型的腎小管上皮細(xì)胞中線(xiàn)粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致腎纖維化，而miR-30E可直接靶向UCP2 mRNA促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和腎臟纖維化，Klinkhammer等[23]發(fā)現(xiàn)的潛在抗纖維化治療靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎臟纖維化機(jī)制中也證實(shí)了miR-30E/UCP2軸具有重要作用(表1)。

表1 MicroRNA(miRNA)在急性腎損傷線(xiàn)粒體功能調(diào)節(jié)中的靶基因和作用

SOD:超氧化物歧化酶2；Txnrd：硫氧還蛋白還原酶；GPx：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶；Catalase：過(guò)氧化氫酶；Keap1-Nrf2：Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-核因子E2相關(guān)因子蛋白2信號(hào)通路；PGC-1α：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α ；Sirt1：蛋白去乙酰激酶活性轉(zhuǎn)錄因子； VEGFA：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A ；NOX5：尼科酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶5；WNT1：WNT 1蛋白；LC3Ⅱ：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；Beclin1：自噬Beclin 1蛋白；Mfn2：絲裂霉素2；MTP18：線(xiàn)粒體內(nèi)膜蛋白18 ；TFAM：線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄因子；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 ；UCP2：線(xiàn)粒體解偶聯(lián)蛋白2 ；Drp1：動(dòng)態(tài)相關(guān)蛋白1

線(xiàn)粒體功能紊亂與AKI

引起腎臟疾病的觸發(fā)因素很多，主要包括糖尿病、 高血壓、 缺血性損傷、外源性有毒物質(zhì)、免疫復(fù)合物沉積、感染以及遺傳等。腎臟可通過(guò)適應(yīng)性修復(fù)和再生恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能，但AKI患者的腎小管、血管、腎間質(zhì)的不完全性修復(fù)會(huì)加速腎臟的纖維化，從而導(dǎo)致CKD。AKI主要病理表型是腎小管損傷，線(xiàn)粒體作為具有各種重要功能的復(fù)雜細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，TECs由于其重吸收功能而密集了大量線(xiàn)粒體，近端小管細(xì)胞中線(xiàn)粒體密度達(dá)29.2%[24]，這需要很高的能量消耗，而AKI時(shí)處于腎小管ATP耗竭狀態(tài)[25]，因此，TECs中的線(xiàn)粒體功能障礙被認(rèn)為是AKI-CKD轉(zhuǎn)變的一種致病機(jī)制。同時(shí)，線(xiàn)粒體還具有一系列其他重要的功能，包括大分子的生物合成和細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)的調(diào)節(jié)。此外，它們可能是腎小管細(xì)胞ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源，也在激活細(xì)胞死亡途徑(凋亡和壞死)中起關(guān)鍵作用。腎損傷可能以不同的方式改變線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)和功能，同樣線(xiàn)粒體動(dòng)態(tài)平衡的改變反過(guò)來(lái)促進(jìn)腎臟損傷，引發(fā)有害的反饋循環(huán)導(dǎo)致CKD的發(fā)生[26]。腎臟中的ATP來(lái)源主要是通過(guò)FAO(線(xiàn)粒體脂肪酸β氧化)，線(xiàn)粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致ATP耗竭和脂毒性，從而引發(fā)腎小管損傷、炎癥和隨后的纖維化，最終進(jìn)展為CKD[27]。有研究表明在AKI的狀態(tài)下線(xiàn)粒體DNA(MtDNA)的釋放誘導(dǎo)了免疫反應(yīng)和腎損傷進(jìn)展，且在CKD患者的腎臟和小鼠腎纖維化模型中均發(fā)現(xiàn)TFAM顯著降低。TFAM是一種與MtDNA結(jié)合的必需蛋白，但其在AKI向CKD轉(zhuǎn)變中的作用機(jī)制尚不清楚[28]。Chung等[29]特異性地將小鼠的小管TFAM基因敲除后發(fā)現(xiàn)腎小管不僅出現(xiàn)嚴(yán)重的線(xiàn)粒體丟失，而且滲入胞質(zhì)的MtDNA作為激活環(huán)磷酸腺苷合成酶(CGAS)-干擾素基因刺激物(STINDNA)信號(hào)的關(guān)鍵機(jī)制，會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和腎臟纖維化。

miRNA調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體功能保護(hù)腎臟機(jī)制

從機(jī)制上看，大多數(shù)研究將miRNA保護(hù)腎臟線(xiàn)粒體主要?dú)w因于阻止靶基因mRNA的翻譯或誘導(dǎo)降解來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而阻止缺血缺氧誘導(dǎo)的鈣超載、ROS的產(chǎn)生，線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)破壞及代謝解偶聯(lián)等一系列連鎖反應(yīng)[30]，這一系列反應(yīng)在腎臟缺血期間啟動(dòng)，并且在再灌注后加劇累積[31]。調(diào)控細(xì)胞凋亡是腎臟自我保護(hù)的重要機(jī)制之一。最近的研究進(jìn)展逐漸揭示了參與抗凋亡作用的特異miRNA及其靶點(diǎn)和信號(hào)通路(表1)，包括前文提到的Mfn2、MTP18等信號(hào)通路。自噬是miRNA參與腎臟保護(hù)的另一機(jī)制。在順鉑誘導(dǎo)的AKI模型中間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在體內(nèi)和體外均能增加自噬標(biāo)志物和LC3II的表達(dá)，并與調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因(ATG-16L)表達(dá)有關(guān)[32]。另一組研究也表明，miRNA通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路增加了正常大鼠腎臟-52E(NRK-52E)細(xì)胞LC3B的表達(dá)以及ATG-5和ATG-7基因的表達(dá)[33]。前文也提到了針對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的miR-145增強(qiáng)了HK-2細(xì)胞LC3II和Beclin 1的表達(dá)。因此，在病理?xiàng)l件下，自噬作為細(xì)胞生存的適應(yīng)性和保護(hù)性機(jī)制也是腎臟保護(hù)的重要機(jī)制。其他機(jī)制還包括影響線(xiàn)粒體的生物發(fā)生。Drp1被認(rèn)為是線(xiàn)粒體分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，上文提到了抑制Drp1表達(dá)的miR-30可以保護(hù)線(xiàn)粒體功能以及通過(guò)miRNA-214抑制劑阻止Mfn2下調(diào)能起到保護(hù)腎臟的作用。通過(guò)miRNA改善氧化應(yīng)激也是延緩腎臟AKI進(jìn)展的一個(gè)重要機(jī)制。氧化應(yīng)激主要通過(guò)ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)AKI細(xì)胞凋亡、壞死和炎癥。在糖尿病腎病中，NADPH氧化酶(NOX5)作為ROS產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑，隨著miR-485的治療而下降[34]。而miR-195-5p可能通過(guò)靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)抑制氧化應(yīng)激及下調(diào)炎癥因子的表達(dá)來(lái)緩解AKI[35]。由此可見(jiàn)，miRNA通過(guò)各個(gè)方面參與了腎臟保護(hù)的調(diào)節(jié)機(jī)制,腎纖維化是CKD的病理過(guò)程，與腎功能障礙的進(jìn)展密切相關(guān)。但開(kāi)發(fā)miRNA療法目前最大挑戰(zhàn)之一是為每種疾病確定最佳的miRNA或miRNA靶點(diǎn)，當(dāng)然其他挑戰(zhàn)包括設(shè)計(jì)miRNA遞送載體，使候選治療藥物具有更高的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)組織特異性靶向以及如何避免潛在的毒性和靶外效應(yīng)等。其中miRNA可能在腎臟生理和病理的不同階段發(fā)揮不同的作用，在AKI中，腎臟微環(huán)境中的缺氧和炎癥等因素會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的區(qū)域異質(zhì)性，臨床上腎活檢樣本只探測(cè)一個(gè)特定的區(qū)域，不能全面檢測(cè)miRNA的表達(dá)動(dòng)態(tài)。為了克服這種障礙，需要研究者在疾病進(jìn)展過(guò)程中對(duì)各種組織(理想情況下是在不同時(shí)間進(jìn)行多次活檢)進(jìn)行活檢樣本，以確定共同的調(diào)節(jié)miRNA。

小結(jié)：在AKI背景下進(jìn)行miRNA調(diào)控是一個(gè)具有重要意義和前景的研究領(lǐng)域，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得的成果如能成功運(yùn)用到臨床上，miRNA療法有可能使患者免于腎臟替代療法及其相關(guān)并發(fā)癥，AKI危重患者也能從中受益良多，達(dá)到阻止甚至逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程的目標(biāo)。強(qiáng)大的人類(lèi)生物學(xué)基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)有助于我們識(shí)別藥物開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵miRNA靶點(diǎn)，大數(shù)據(jù)的支持加上科學(xué)地分析，miRNA療法將顯示出巨大的臨床潛力。