液態(tài)發(fā)酵法制備菜籽ACE 抑制肽培養(yǎng)基條件優(yōu)化

王立峰，金 晶，袁 建，何 榮，鞠興榮

液態(tài)發(fā)酵法制備菜籽ACE 抑制肽培養(yǎng)基條件優(yōu)化

王立峰1,2，金 晶1，袁 建1，何 榮1,2，鞠興榮1

(1.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210003；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

以菜籽粕為原料，通過枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽ACE抑制肽。先以肽得率、ACE抑制率為指標通過單因素試驗得到液態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基條件，再以響應面分析法，優(yōu)化枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的3種成分，確定枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的最佳培養(yǎng)基工藝條件為：磷酸二氫鉀0.45g/100mL、葡萄糖0.8g/100mL、料液比1:23、初始pH7.0。優(yōu)化后的ACE抑制率可達69.79%。

菜籽肽；液態(tài)發(fā)酵；ACE抑制肽；響應面分析法

菜籽粕是菜籽榨油之后的副產(chǎn)品，其蛋白質含量為35%～42%[1]，菜籽蛋白的氨基酸組成符合FAO/WHO推薦模式值，是一種優(yōu)質的蛋白質[2]。但是在菜籽蛋白中含有硫苷及其分解產(chǎn)物、酚類化合物和植酸等有害物質，使其應用受到了一定的限制。近年來，隨著雙低油菜的培育成功[3]和對菜籽粕脫毒技術[4]的發(fā)展，菜籽蛋白的利用得到了很大的提升，為菜籽蛋白產(chǎn)品的進一步開發(fā)利用打下了堅實的基礎。

菜籽蛋白經(jīng)水解產(chǎn)生的小肽具有多種生物活性[5-6]，其中ACE抑制肽由于安全性高、副作用少、易吸收，已經(jīng)成為了活性肽研究的熱點[7-8]。發(fā)酵法制備大豆[9-11]和牛奶[12-13]ACE抑制肽的研究在我國已有報道，而使用液態(tài)發(fā)酵制備菜籽ACE抑制肽的研究目前在國內尚未見報道，因此具有很高的研究價值。

為了進一步提高菜籽ACE抑制肽的抑制率，本研究以枯草芽孢桿菌為實驗菌株，應用單因素和響應面分析法對菜籽粕液態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基條件進行優(yōu)化，以ACE抑制率為響應值，采用多元二次回歸擬合方程，優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的配比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Bacillus.subtilis 10160產(chǎn)蛋白酶菌種 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；菜籽粕(以Canola 菜籽為原料，通過索氏抽提脫油制得，粗蛋白含量43.26%)。

牛血清白蛋白、細胞色素、鈷胺酰胺(VB12)、Gly-Gly-Tyr-Arg、血管緊張素轉化酶(ACE)(0.25U)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、Gly-Gly-Tyr-Arg Sigma 公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；PHS-3C型精密數(shù)顯pH計、722N紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器廠；GL-20B型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；全溫立式振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設備廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基礎培養(yǎng)基

將保藏的枯草芽孢菌種接入基礎培養(yǎng)基(牛肉膏0.3g/100mL，蛋白胨1g/100mL，氯化鈉0.5g/100mL，瓊脂2.5g/100mL)，在30℃條件下培養(yǎng)24h，使其轉接活化。

1.3.2 種子培養(yǎng)基

挑取2環(huán)枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基(牛肉膏0.3g/100mL，蛋白胨1g/100mL，氯化鈉0.5g/100mL)活化后菌株，接入錐形瓶，8層紗布封口，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行擴大培養(yǎng)，控制溫度30℃，轉速180r/min，培養(yǎng)24h。使其菌體濃度達到108個/mL。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

從已制備好的種子培養(yǎng)基中取出一定體積的菌懸液接入已滅菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(含有菜籽粕、磷酸二氫鉀和葡萄糖)中進行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵錐形瓶用8層紗布封口，在30℃，180r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后取樣測定。

1.3.4 發(fā)酵液處理

將培養(yǎng)一定時間的發(fā)酵產(chǎn)物取出，2～4℃條件下4000×g離心15min，測定其上清液體積，用0.45μm微孔濾膜過濾上清液，除去不溶物和細菌，備用。

1.3.5 枯草芽孢桿菌生長曲線的測定

從活化后的枯草芽孢桿菌斜面上挑取2環(huán)，接入液體種子培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度30℃，轉速180r/min，每隔2h取一次樣(5mL)，4000×g離心15min沉淀菌體，去除上清液后，菌體沉淀以無菌蒸餾水懸浮，混勻定容至10mL，于波長600nm處測定其吸光度。

1.3.6 細菌數(shù)量測定

血球板計數(shù)法測定[14]。

1.3.7 多肽得率測定

參照文獻[15]所述方法，取2.5mL處理液，加入等體積10%的三氯乙酸(TCA)，靜置30min，2～4℃條件下5000×g離心20min，取2mL上清液，加8mL雙縮脲試劑，25℃靜置30min，測OD540nm值，通過肽含量標準曲線得到其肽含量，肽得率按公式(1)計算。

1.3.8 ACE抑制活性的測定

ACE抑制活性的測定參照Cushman等[16]的方法，做適當修改，具體步驟如下：用含有0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸鹽緩沖液(pH8.3)將HHL配制成5.0mmol/L的溶液。取100μL的HHL和40μL的水解產(chǎn)物混合，于37℃保溫3min后，加入10μL ACE(溶于蒸餾水，比活力為0.1U/mL)，混勻后37℃保溫30min，加入250μL 1mol/L的HCl溶液以終止反應，再加入1.7mL醋酸乙酯，15s振蕩混勻，5000×g離心10min，用移液管吸取1mol/L醋酸乙酯層，真空冷凍干燥2h后，加入3mL蒸餾水，在波長228nm處測定其吸光度。ACE抑制活性按公式(2)計算。

式中：A1為ACE及ACE抑制肽均參與反應時所測吸光度；A2為ACE抑制肽不參與反應時所測吸光度；A0為ACE不參與反應時所測吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差表示；用t檢驗進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌生長曲線

圖1 枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve ofBacillus subtilis

枯草芽孢桿菌生長繁殖比較快，在適宜條件下，20～30min就可以分裂一次，從圖1可以看到，在發(fā)酵的開始階段，菌體數(shù)量增加并不多(0～10h)，一定時間

后，菌體數(shù)量增長很快(12～28h)，隨后菌體增長進入穩(wěn)定期(28～34h)，在34h后，隨著菌體數(shù)量增大，培養(yǎng)基內營養(yǎng)物質的消耗和自身代謝產(chǎn)物的大量產(chǎn)生，菌體進入衰亡期。因此，12～28h是此菌株的生長對數(shù)期，由于對數(shù)期的微生物細胞生長平衡，菌體內酶系活躍，代謝旺盛，群體的形態(tài)與生理特征最一致，并且抗不良環(huán)境的能力強，所以在后續(xù)實驗中，均以培養(yǎng)24h左右的菌株為種子液。

2.2 肽含量標準曲線

用5% TCA配制不同濃度的Gly-Gly-Tyr-Arg標準溶液，按照多肽含量測定方法顯色，于波長540nm處測定OD540nm值。以多肽質量濃度為橫坐標，OD540nm值為縱坐標，制作標準曲線，得到回歸方程：y=0.0257x+ 0.0029，R2=0.9995。

2.3 培養(yǎng)基葡萄糖質量濃度對肽得率和ACE抑制率的影響

圖2 葡萄糖質量濃度對菜籽肽得率和ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on the yield and ACE inhibitory rate of rapeseed peptide

葡萄糖在碳源中最易被利用，幾乎所有的微生物都可以利用葡萄糖，因此，本實驗選用葡萄糖作為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的主要成分。由圖2可以看出，較高質量濃度的葡萄糖有利于液態(tài)發(fā)酵環(huán)境下肽得率和ACE抑制活性的提高。這是由于葡萄糖作為一種速效碳源，可以在菌種發(fā)酵初期提供大量碳源維持其生長勢頭，從而產(chǎn)生大量的蛋白水解酶。但是過高的葡萄糖質量濃度反而會降低多肽產(chǎn)量以及ACE抑制活性，這是由于發(fā)酵過程中過多的葡萄糖會加速菌體呼吸，使培養(yǎng)基中溶解氧不能滿足菌體的需要。一些酸性中間代謝物如乳酸、丙酮酸、乙酸等不能完全氧化而積累在菌體和培養(yǎng)基中，導致培養(yǎng)基pH值降低，從而抑制細菌的生長和水解酶類的合成。

當葡萄糖質量濃度為0.5g/100mL時，所得菜籽肽的ACE抑制活性最高，而當葡萄糖質量濃度為0.7g/100mL時，菜籽肽得率達到最高。ACE抑制活性沒有進一步隨著肽得率的提高而增高可能是由于在多肽產(chǎn)生的過程中，多肽自身也在被酶解，轉化為了不具有ACE抑制活性的小肽。因此，ACE抑制肽生產(chǎn)的較佳葡萄糖質量濃度為0.5g/100mL。

2.4 培養(yǎng)基KH2PO4質量濃度對肽得率和ACE抑制率的影響

圖3 KH2PO4質量濃度對菜籽肽得率和ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of KH2PO4concentration on the yield and ACE inhibitory rate of rapeseed peptide

KH2PO4作為微生物培養(yǎng)基中常用的無機鹽之一，可以提供微生物生長所需的礦物元素，但是，KH2PO4質量濃度過高同時也會抑制菌種的生長和產(chǎn)酶，由圖3可以看出，較低質量濃度的KH2PO4可以顯著提高菜籽肽得率和ACE抑制率，當KH2PO4質量濃度為0.3g/100mL時，菜籽肽得率和ACE抑制率均達到最高，分別為20.49%和58.12%，因此，發(fā)酵較佳的KH2PO4質量濃度為0.3g/100mL。

2.5 培養(yǎng)基料液比對肽得率和ACE抑制率的影響

圖4 料液比對菜籽肽得率和ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on the yield and ACE inhibitory rate of rapeseed peptide

培養(yǎng)基料液比(菜籽粕質量與加水量之比)決定了液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的菜籽粕量以及含水量，菜籽粕作為本實驗中唯一的氮源，一方面可以提供微生物生長所需的氮，另一方面菜籽粕中的菜籽蛋白可被水解酶類作用而生成菜籽多肽。而培養(yǎng)基含水量的變化，對微生物的生長及代謝能力產(chǎn)生重要影響。因此，料液比對肽得率和ACE抑制活性都有較大的影響。從圖4可以看出，當

培養(yǎng)基料液比在1:15～1:25時，肽得率達到較大值，它們之間的差異不是很大，但是料液比過高或者過低，都不利于ACE抑制肽的產(chǎn)生，因此，選擇料液比1:20作為較佳的液態(tài)發(fā)酵指標。

2.6 培養(yǎng)基pH值對肽得率和ACE抑制率的影響

圖5 pH值對菜籽肽得率和ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of pH on the yield and ACE inhibitory rate of rapeseed peptide

由圖5可知，枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)ACE抑制肽的較佳pH值為7.0，在此條件下，肽得率達到最大，同時，ACE抑制活性也達到最高，隨著pH值的改變，肽得率和ACE抑制活性較其他因素相比，變化都不是很明顯，其中ACE抑制率極差為0.85%，因此，選擇pH7.0最為液態(tài)發(fā)酵的較佳pH值。

2.6 響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件結果分析

2.6.1 試驗因素選擇及結果

在單因素試驗結果基礎上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設計原理，以菜籽肽ACE抑制率為響應值，對液態(tài)發(fā)酵影響較大的3個因素設計響應曲面試驗以確定最優(yōu)培養(yǎng)基條件。因素編碼及各自變量水平見表1。

表1 Box-Behnken中心組合試驗設計因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in Box-Behnken central composite design

為了最優(yōu)擬合多元二次模型方程各項系數(shù)，依據(jù)統(tǒng)計學實驗設計要求，對影響菜籽肽得率的發(fā)酵培養(yǎng)基關鍵內在因素進行了15組試驗，15組試驗分為析因點和零點。試驗號1～12是析因試驗，13～15是中心試驗。其中析因點為自變量取值在x1，x2，x3所構成的三維定點，零點區(qū)域為中心點，零點試驗重復3次，以估計試驗誤差，結果見表2～4。

表2 Box-Behnken試驗設計及菜籽肽得率實測值與預測值Table 2 Box-Behnken central composite design arrangement and actual and predicted values of rapeseed peptide yield

表3 菜籽肽得率二次多項式模型方差分析Table 3 Analysis of variances for rapeseed peptide with various fermentation conditions

表4 菜籽肽得率回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Significance of regression coefficients of fitted regression equation for rapeseed peptide yield

利用Designexpert軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)ACE抑制肽培養(yǎng)基組成編碼自變量的二次多項回歸方程為：

Y=67.04+3.03X1+2.98X2+1.96X3+0.60X1X2+0.81X1X3+ 1.37X2X3－2.26X12－4.51X22－4.06X32(3)

方程中X1、X2的系數(shù)均較大，表明KH2PO4質量濃度、葡萄糖質量濃度對ACE抑制率最具有顯著意義。

一次項和交互項系數(shù)均為正值，可以認為一次項和交互項方程主要對ACE抑制率起正作用，而二次項則對其起負作用。

由表3可見，本試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(P=0.0003)，失擬項在α=0.05水平上不顯著(P=0.759＞0.05)，其校正決定系數(shù)為0.9663，表明此模型擬合優(yōu)度好，ACE抑制率僅有3.37%的總變異不能由此模型進行解釋。

由表4可見，試驗各因素對ACE抑制率的線性效應和曲面效應皆顯著，表明在發(fā)酵培養(yǎng)基中，KH2PO4質量濃度、葡萄糖質量濃度、料液比的組成均對ACE抑制率有顯著影響；X2X3交互作用影響也顯著，說明在培養(yǎng)基中，葡萄糖質量濃度和料液比之間的交互作用亦能對ACE抑制率造成顯著影響。X1X2、X1X3之間的交互影響不顯著，P值分別為0.2360和0.1276，均大于0.05，說明在液態(tài)發(fā)酵中KH2PO4質量濃度和葡萄糖質量濃度，以及KH2PO4質量濃度和料液比之間的交互影響不明顯。

2.6.2 ACE抑制率的響應面分析與優(yōu)化

圖6 培養(yǎng)基葡萄糖質量濃度和料液比交互影響ACE抑制率的曲面圖及其等高線圖Fig.6 Response surface and coutour plots showing the interactive effects of glucose concentration and solid-liquid ratio on the ACE inhibitory rate

如圖6所示，葡萄糖質量濃度和料液比對ACE抑制率影響的交互作用顯著。當葡萄糖質量濃度在0.7～0.8g/100mL，料液比在1:20～1:22.5時，ACE抑制率高于67%。發(fā)酵培養(yǎng)基必須維持一個適當?shù)奶嫉?，碳源過多，容易使有機酸積累，導致培養(yǎng)液pH值偏低，從而抑制菌體生長；碳源不足則引起菌體生長緩慢。氮源過多，會使菌體生長過于旺盛，易導致pH值偏高，溶氧不足，不利于水解酶類的積累；氮源不足，影響菌體生長繁殖，易引起菌體衰老、自溶，從而影響產(chǎn)量。這與圖6得出的結論相同。

2.6.3 液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)ACE抑制肽最優(yōu)條件的確立

為了進一步驗證最佳點的值，對回歸方程(3)取一階偏導等于零并整理得：

解得X1=0.8、X2=0.45、X3=0.4。

代入回歸方程(3)，解得預測的最高ACE抑制率為69.3%。轉換后得到最佳培養(yǎng)基配比為：KH2PO4質量濃度0.46g/100mL、葡萄糖質量濃度0.79g/100mL、料液比1:22.7。為了方便培養(yǎng)基的配制，確定培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為：KH2PO4質量濃度0.45g/100mL、葡萄糖質量濃度0.8g/100mL、料液比1:23。

2.6.3 模型驗證實驗

根據(jù)Box-Behilken實驗所得的結果和二次多項回歸方程，利用Designexpert軟件獲得了ACE抑制率最高時的最佳工藝條件。為了驗證其優(yōu)化結果的可靠性，在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基中進行5組平行實驗，所得ACE抑制活性分別68.26%、71.35%、70.14%、69.27%、69.95%，平均值為69.79%，回歸方程所得到的ACE抑制活性預測值與驗證實驗的平均值相接近，說明該模型能夠較好地預測ACE抑制活性值。

3 結 論

以ACE抑制率為考察指標，經(jīng)單因素試驗確定KH2PO4質量濃度、葡萄糖質量濃度和料液比對ACE抑制率有顯著影響，在此基礎上，采用響應面分析法，根據(jù)Box-Behnken 中心組合原理設計三因素三水平試驗，用Design-Expert 軟件處理試驗數(shù)據(jù)，得到ACE抑制率回歸模型，并求取模型最優(yōu)值時各因素水平。結果表明：枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)ACE抑制肽培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為：KH2PO4質量濃度0.45g/100mL、葡萄糖質量濃度0.8g/100mL、料液比1:23(m/V)，在該最佳條件下，ACE抑制率理論上可達69.3%。在所得最佳條件下進行模型驗證實驗，所得ACE抑制率平均值為69.79%，與回歸方程所得最佳ACE抑制率相接近。

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Optimization of Liquid-state Fermentation Conditions for Preparing Rapeseed Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Peptides

WANG Li-feng1,2，JIN Jing1，YUAN Jian1，HE Rong1,2，JU Xing-rong1
(1. Jiangsu Province Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Rapeseed meal was used to prepare angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide through liquidstate fermentation by Bacillus subtilis. The optimal fermentation conditions were explored by single factor and response surface experiments through evaluating the yield of peptide and ACE inhibitory rate. The optimal fermentation conditions were 0.45 g/100mL potassium dihydrogen phosphate, 0.8 g/100mL glucose, material/liquid ratio of 1: 23 and initial pH 7.0. The ACE inhibitory rate reached up to 69.79% under these optimal fermentation conditions.

rapeseed peptide；liquid-state fermentation；ACE inhibitory peptide；response surface methodology

TQ936.16

A

1002-6630(2010)21-0226-06

2010-01-10

江蘇省自然科學基金項目(BK2010573)；江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(cx(10)444)；

國家農業(yè)成果轉化基金項目(2009C10045)

王立峰(1977—)，男，講師，博士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)及功能性成分。E-mail：wanglifeng_8@163.com