蜂花粉油脂抗氧化活性與類胡蘿卜素含量的相關(guān)性

徐 響，何 偉，孫麗萍,*，董 捷，李天驕

蜂花粉油脂抗氧化活性與類胡蘿卜素含量的相關(guān)性

徐 響1,2，何 偉3，孫麗萍1,2,*，董 捷1,2，李天驕1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.國家蜂產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心，北京 100093；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

以新鮮益母草、茶花、油菜、荷花、玫瑰、籽瓜、菊花、蕎麥8種常見的蜂花粉油脂為材料，測定其中的類胡蘿卜素含量，同時評價不同蜂花粉油脂的抗氧化活性。結(jié)果表明：8種蜂花粉油脂對DPPH自由基均具有一定的清除作用，不同蜂花粉油脂清除能力存在顯著差異(P＜0.05)，IC50值在0.212～7.110mg/mL之間。蜂花粉油脂中含有較高含量的類胡蘿卜素類物質(zhì)，其含量與油脂抗氧化活性呈正相關(guān)(R2=0.8645)，表明類胡蘿卜素可能是蜂花粉油脂抗氧化的主要活性成分之一。

蜂花粉；油脂；抗氧化活性；類胡蘿卜素

機(jī)體在其正常代謝過程中常伴隨產(chǎn)生少量自由基和活性氧，一般情況下機(jī)體擁有一套完整的由抗氧化酶和抗氧化劑組成的防御體系，可以清除自由基，防止脂質(zhì)過氧化，維持生物體內(nèi)自由基代謝平衡。但是當(dāng)機(jī)體逐漸衰老或受到環(huán)境影響時，體內(nèi)自由基代謝出現(xiàn)紊亂，自由基產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，給機(jī)體帶來損傷[1]。通過天然產(chǎn)物抗氧化性的研究為預(yù)防和治療由自由基引發(fā)的疾病已成為研究的熱點(diǎn)。

蜂花粉是蜜蜂采集的有花植物的雄性生殖細(xì)胞，其不僅含有許多營養(yǎng)成分，還含有許多抗氧化活性物質(zhì)，如VC、黃酮類化合物等，是天然營養(yǎng)保健品[2]。曹瑋等[3-5]對油菜、蕎麥、茶花蜂花粉等醇提物的還原能力、Fe2+絡(luò)合能力及自由基的清除能力進(jìn)行了深入研究，對花粉提取物中黃酮類化合物對不同自由基導(dǎo)致的2-脫氧核糖損傷和細(xì)胞膜氧化損傷的保護(hù)機(jī)理進(jìn)行了探討[4-5]。已有的研究表明，蜂花粉含有豐富的脂類物質(zhì)[6]，蜂花粉的油脂具有良好的生理功效[7]。目前，關(guān)于蜂花粉脂溶性提取物中抗氧化成分及其抗氧化性鮮見報道。本研

究主要通過DPPH自由基清除來評價各種蜂花粉油脂的抗氧化性，并對蜂花粉油脂中類胡蘿卜素含量與抗氧化性之間的關(guān)系進(jìn)行探討，以期為蜂花粉加工及其綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮益母草、茶花、油菜、荷花、玫瑰、籽瓜、菊花、蕎麥8種蜂花粉 北京君健生蜂產(chǎn)品有限公司。

異丙醇、甲醇、乙醇、氯仿(分析純) 北京化學(xué)試劑公司；DPPH [1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl]自由基、β-胡蘿卜素 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2550型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；SynergyHT型酶標(biāo)儀 BioTek基因有限公司；RW20n型高速剪切均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司。

1.3 花粉油脂的制備

稱取25g蜂花粉樣品，然后加入100mL 混合有機(jī)溶劑(氯仿-甲醇體積比 2:1)進(jìn)行提取[8]、過濾，濾渣重復(fù)提取兩次后，合并3次提取得到的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，蒸發(fā)濃縮，得濃縮液。在濃縮液中加入100mL有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，并加入20mL 0.75%氯化鈉溶液，充分混合后靜置分層。再將下層有機(jī)相過無水硫酸鈉去除水，得到的樣液轉(zhuǎn)到干燥的蒸發(fā)瓶中，繼續(xù)蒸發(fā)濃縮，干燥后稱質(zhì)量。得到的油脂－20℃冷凍，待用。

1.4 清除DPPH自由基能力的測定

采用文獻(xiàn)[9-10]中的方法，用乙醇配制3×10-4mol/L DPPH溶液，向酶標(biāo)板中加入0.1mL DPPH溶液，分別加入異丙醇溶解的不同質(zhì)量濃度油脂樣品溶液0.1mL，空白組加入同體積的異丙醇，振蕩20s，反應(yīng)60min 后在515nm波長處測定吸光度，自由基清除率通過公式(1)計(jì)算。

式中：A0為DPPH空白對照的吸光度；At為樣品與DPPH反應(yīng)t時間時的吸光度；A樣品為樣品空白的吸光度。

以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程及樣品的半抑制質(zhì)量濃度(IC50)。

1.5 樣品中總類胡蘿卜素含量測定

稱取樣品0.10g左右，用正己烷溶解并定容至10mL，再取1mL溶液稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度，參考文獻(xiàn)[11]方法，采用紫外-可見分光光度計(jì)測定其光譜，采用酶標(biāo)儀在450nm波長處對類胡蘿卜素含量進(jìn)行測定，類胡蘿卜素含量(mg/g)以β-胡蘿卜素計(jì)。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.0791x+ 0.067(R2=0.9996)。總類胡蘿卜素質(zhì)量濃度在0.625～10.0μg/mL線性關(guān)系良好。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0進(jìn)行顯著性分析，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉油脂萃取率

圖1 不同蜂花粉油脂萃取率的比較Fig.1 Yield of oil extracted from different kinds of bee pollen

由圖1可知，8種常見的蜂花粉中油脂含量差異較大，萃取率范圍在3.6%～7.5%之間。油菜、荷花和蕎麥蜂花粉中油脂含量較高，含量在5.8%以上。該結(jié)果與涂文利等[12]報道的研究結(jié)果一致。菊花蜂花粉油脂萃取率較低，僅為3.6%。

2.2 蜂花粉油脂對DPPH自由基清除的動力學(xué)

DPPH法是一種簡單快速的自由基分析方法，穩(wěn)定的DPPH自由基溶液在515nm波長處有強(qiáng)吸收峰，自由基清除劑通過與其單電子配對使其顏色逐漸變淺，褪色程度與接收的電子數(shù)成計(jì)量關(guān)系，通過吸光度的變化可以衡量試樣清除自由基的能力。

圖2 8種蜂花粉油脂清除DPPH自由基的動力學(xué)曲線Fig.2 Dynamic curves of bee pollen oil from eight floral origins for scavenging DPPH free radicals

由圖2可知，8種樣品對DPPH自由基均有不同程度的清除作用。隨著反應(yīng)時間的延長，清除率逐漸增高，在前5min反應(yīng)迅速，之后反應(yīng)平緩，40min后清

除率基本保持不變，確定樣品和DPPH自由基的清除反應(yīng)時間為40min。不同粉源的蜂花粉經(jīng)過萃取得到的油脂中，茶花粉油脂的清除能力最強(qiáng)，在10min時清除率達(dá)到9 0%以上。而益母草和蕎麥在相同質(zhì)量濃度下60min時清除率僅為35.4%和29.5%。

2.3 不同蜂花粉油脂對DPPH自由基的清除作用

分別測定不同質(zhì)量濃度的蜂花粉油脂對DPPH自由基的清除率，計(jì)算樣品質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除率回歸方程，計(jì)算IC50值。圖3為荷花蜂花粉分別在0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL和8.0mg/mL時對DPPH自由基的清除率，經(jīng)回歸分析得到回歸方程：y=23.91lnx+50.709，R2=0.9799(表1)。結(jié)果顯示，DPPH 自由基清除率對樣品質(zhì)量濃度有良好的依賴關(guān)系，清除率隨樣品質(zhì)量濃度的增加而升高，當(dāng)質(zhì)量濃度增加到一定程度時，樣品對DPPH自由基清除率的變化趨于平緩。

圖3 不同質(zhì)量濃度荷花蜂花粉油脂對DPPH自由基清除率Fig.3 Scavenging rates of lotus bee pollen oil with various concentrations on DPPH free radicals

表1 蜂花粉油脂清除DPPH自由基的IC50值Table 1 IC50of bee pollen oil for scavenging DPPH free radicals

由表1可知，不同樣品的IC50值差異顯著(P＜0.05)。茶花蜂花粉油脂的IC50值最小，為(0.212±0.008)mg/mL，表明其抗氧化活性最高。蕎麥蜂花粉油脂IC50值是茶花蜂花粉的30余倍，抗氧化活性最弱。不同蜂花粉的抗氧化活性大小關(guān)系為：茶花＞油菜＞荷花＞菊花＞玫瑰＞籽瓜＞益母草＞蕎麥。

2.4 蜂花粉油脂抗氧化活性與類胡蘿卜素含量相關(guān)性

蜂花粉醇提物對DPPH自由基清除作用的IC50值為149.07μg/mL[13]，與茶花蜂花粉油脂的清除作用相當(dāng)(表1)。蜂花粉提取物抗氧化活性的高低與其功效成分組成和含量有密切的關(guān)系，蜂花粉醇提物中主要的抗氧化成分是黃酮類化合物[14]。已有研究表明，蜂花粉中含有較高含量的多不飽和脂肪酸，包括亞油酸、α-亞麻酸等[6]，作為不可缺少的必需脂肪酸，在體內(nèi)起著極為重要的作用。除多不飽和脂肪酸外，蜂花粉油脂中還含有發(fā)揮抗氧化活性的其他活性物質(zhì)。由圖4可知，油脂樣品呈現(xiàn)典型的類胡蘿卜素的紫外可見吸收光譜。類胡蘿卜素在近紫外光區(qū)無吸收峰，而在可見吸收光譜有3個最大峰[15]，最大吸收峰波長分別為400、421nm和446nm。類胡蘿卜素是一種重要的抗氧化劑，具有很好的清除自由基作用，在體內(nèi)外具有良好的抗氧化活性[16]。不同蜂花粉油脂中含有豐富的胡蘿卜素，其含量與油脂清除自由基IC50值倒數(shù)的關(guān)系如圖5所示，不同油脂中功效成分組成和含量存在的差異造成清除自由基能力大小不同。

圖4 荷花蜂花粉油脂可見光譜圖Fig.4 Visible spectrum of lotus bee pollen oil

圖5 類胡蘿卜素含量和樣品清除DPPH自由基1/IC50值的相關(guān)性Fig.5 Correlation between the content of carotenoids and 1/IC50for scavenging DPPH free radicals

8種樣品中，茶花粉油脂的類胡蘿卜素含量最高，為46.335mg/g油脂，其對應(yīng)的1/IC50值最高。由圖5可知，蜂花粉油脂中類胡蘿卜素含量與清除DPPH自由基IC50值的倒數(shù)呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.8645。類胡蘿卜素含量越高，樣品的1/IC50值越高，其抗氧化性越強(qiáng)，兩者呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，蜂花粉油脂中的類胡蘿卜素類物質(zhì)可能是其抗氧化活性的主要成分之一。

然而，類胡蘿卜素的種類及蜂花粉油脂中其他抗氧

化物質(zhì)對其抗氧化活性有一定的影響。因此，有必要進(jìn)一步研究不同蜂花粉油脂抗氧化活性與其所含抗氧化物質(zhì)的內(nèi)在關(guān)系，以深入了解蜂花粉油脂抗氧化的機(jī)理。

3 結(jié) 論

蜂花粉油脂對DPPH自由基均具有一定的清除作用，不同蜂花粉油脂清除能力存在顯著差異(P＜0.05)，不同蜂花粉油脂的抗氧化活性大小關(guān)系為：茶花＞油菜＞荷花＞菊花＞玫瑰＞籽瓜＞益母草＞蕎麥。蜂花粉油脂的抗氧化活性與類胡蘿卜素含量之間呈正相關(guān)，表明，類胡蘿卜素可能是蜂花粉油脂中的主要抗氧化成分之一。

[1]HALLIWEL B. Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence[J]. Lancet, 1994, 311(8924): 721-772.

[2]劉建濤, 趙利, 王杉, 等. 蜂花粉生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(12): 909-911.

[3]曹煒, 宋紀(jì)蓉, 尉亞輝. 蕎麥花粉黃酮對氧自由基致鼠紅細(xì)胞膜氧化損傷的保護(hù)作用[J]. 中國食品學(xué)報, 2003, 3(2): 47-52.

[4]吳素芳, 曹煒, 姚亞萍, 等. 油菜蜂花粉提取物對羥基自由基介導(dǎo)2-脫氧核糖損傷的抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(10): 544-548.

[5]曹煒, 尉亞輝, 郭斌, 等. 用熒光探針法研究茶葉花粉黃酮對氧自由基致鼠紅細(xì)胞膜氧化損傷的保護(hù)作用[J]. 光子學(xué)報, 2002, 31(4): 94-397.

[6]XU Xiang, SUN Liping, DONG Jie, et al. Breaking the cells of rape bee pollen and consecutive extraction of functional oil with supercritical carbon dioxide[J]. Innovative Food Science Emerging Technology, 2009, 10: 42-46.

[7]涂文利, 孫宇飛, 耿越. 多不飽和脂肪酸對基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2007, 24(3): 713-716.

[8]HIROMI Y, YUKA T, MEGUMI T, et al. Distribution of fatty acids in triacylglycerols and phospholipids from peas (Pisum sativum L.)[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2007, 87(14): 2709-2714.

[9]LIU Donghong, SHI J, IBARRA A C, et al. The scavenging capacity and synergistic effects of lycopene, vitamin E, vitamin C, and β-carotene mixtures on the DPPH free radical[J]. LWT-Food Science and Technology, 2008, 41: 1344-1349.

[10]LESLEY K M, LISA G W, MANOHAR L G. Methodology for the determination of biological antioxidant capacity in vitro: a review[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2006, 86: 2046-2056.

[11]RANJITH A, SARIN K K, VENUGOPALAN V V, et al. Fatty acids, tocols, and carotenoids in pulp oil of three sea buckthorn species (Hippophae rhamnoides, H. salicifolia, and H. tibetana) grown in the Indian Himalayas[J]. Journal of the American Oil Chemists Society, 2006, 83: 359-364.

[12]涂文利, 耿越, 張靜靜, 等. 八種花粉中脂肪酸組分分析[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2005, 27(4): 351-352.

[13]楊佳林, 孫麗萍, 徐響, 等. 油菜蜂花粉黃酮醇的測定及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(3): 79-81.

[14]MARGHITAS L A, STANCIU O G, OLTICA G S, et al. in vitro Antioxidant capacity of honeybee-collected pollen of selected floral origin harvested from Romania[J]. Food Chemistry, 2009, 115(3): 878-883.

[15]王海濱. 類胡蘿卜素的紫外可見光譜特性及其應(yīng)用[J]. 武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 2004, 23(4): 10-13.

[16]劉翔, 惠伯棣. 類胡蘿卜素在體內(nèi)外的抗氧化活性[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(10): 279-282.

Correlation between Antioxidant Activity and Carotenoid Content in Bee Pollen Oil

XU Xiang1,2，HE Wei3，SUN Li-ping1,2,*，DONG Jie1,2，LI Tian-jiao1
(1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. National R&D Center for Bee Product Processing, Beijing 100093, China；3. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

The contents of carotenoids and antioxidant activity of the oils extracted from eight kinds of common bee pollen were determined to analyze the correlation between the two parameters. Results indicated that all the eight bee pollen oils had scavenging effect on DPPH free radicals, but displayed a significant difference (P＜0.05) and their IC50values for scavenging DPPH free radicals ranged from 0.212 to 7.110 mg/mL. Carotenoids was abundantly contained in bee pollen oil and the content of carotenoids was linearly correlated (R2= 0.8645) with antioxidant activity. These results indicate that carotenoids might be one kind of the predominant antioxidants in bee pollen oil.

bee pollen；oil；antioxidant activity；carotenoid

TS201.2

A

1002-6630(2010)21-0155-04

2010-08-27

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院院本級基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(0032010012)；科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2009GB23260456)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(NYCYTX-43)

徐響(1983—)，男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品化學(xué)。E-mail：caasxx@163.com

*通信作者：孫麗萍(1963—)，女，研究員，碩士，研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品化學(xué)。E-mail：caasun@126.com