海蓬子提取物抑制酪氨酸合成酶活性的研究

余曉紅，申玉香，陳洪興，邵 榮*，許 偉

海蓬子提取物抑制酪氨酸合成酶活性的研究

余曉紅，申玉香，陳洪興，邵 榮*，許 偉

(鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224003)

研究海蓬子水提物、醇提物、超聲波水提物、超聲波醇提物，分別經(jīng)蒸餾濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮所得濃縮物對酪氨酸酶活性的抑制作用。結(jié)果表明，蒸餾濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮對提取物的抑制率幾乎沒有影響。這4種提取物對以酪氨酸為底物的酪氨酸酶抑制作用存在顯著性差異。抑制率分別為：水提物32.48%，醇提物62.37%，超聲波水提物43.56%，超聲波醇提物75.81%。其中海蓬子超聲波醇提物表現(xiàn)出最好的抑制作用。

海蓬子；提取物；酪氨酸酶；抑制作用`

酪氨酸合成酶抑制劑在醫(yī)藥領(lǐng)域用于治療和預(yù)防黑色素瘤、黃褐斑等色素沉著性疾病，在化妝品領(lǐng)域用于人體肌膚的美白[1]，在食品工業(yè)領(lǐng)域用于預(yù)防果蔬因褐變而失鮮變質(zhì)[2]，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域因酪氨酸合成酶是昆蟲賴以生存的關(guān)鍵酶而成為最有前景的生物殺蟲藥劑之一[3]，因而酪氨酸合成酶抑制劑的開發(fā)有著廣闊的應(yīng)用前景。

海蓬子為黎科莖肉質(zhì)化真鹽生植物，利用海水灌溉，基本無需噴灑農(nóng)藥，種植管理簡單、不生病蟲害。海蓬子營養(yǎng)價值極高，是上佳的無公害綠色保健食品。除作為蔬菜之外還具有藥用、保健價值，還可作為制造建材[4]?，F(xiàn)代研究證明海蓬子中含有黃酮類物質(zhì)[5]，黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗衰老、減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基的作用。這與抑制酪氨酸合成酶活性有一定的聯(lián)系。

實驗分別制備了海蓬子水提物、醇提物、超聲波水提物、超聲波醇提物，各提取物分別經(jīng)蒸餾濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮得到濃縮物，進一步研究其濃縮物對酪氨酸合成酶合成活性的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土豆 市售；海蓬子購于鹽城綠苑海蓬子開發(fā)有限公司，為2009年夏季采收品。

酪氨酸 鄭州興人化工產(chǎn)品有限公司；95%乙醇上海中試化工總公司；磷酸二氫鈉 宜興市第二化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉 鑫科股份合肥大學(xué)化學(xué)試劑廠；鄰苯二酚 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

XD-SM50超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng) 南京光歐生物科技有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；TDC-40B臺式離心機 上海安亭科技儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XA-1固體樣品粉碎機 江蘇金壇億通電子有限公司；7202B可見分光光度計 深圳市君達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 各種提取物的制備

海蓬子水(醇)提物的制備：取冷凍干燥研磨過60目篩后的海蓬子粉末3g，加入60mL蒸餾水(或60mL體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇)浸泡24h，50℃回流提取1h。

海蓬子超聲波水(醇)提物的制備：取研磨好的海蓬子粉末3g加入60mL蒸餾水(或60mL體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇)浸泡0.5h，煮沸30min，冷卻至室溫，用超聲波(59kHz，500W，65℃)提取1h。

1.3.2 各種濃縮物的制備

蒸餾法濃縮：提取液60mL置于6000r/min離心4min，得上清液52mL，置于沸水鍋里，直至試管內(nèi)的液體揮發(fā)至5mL。

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮：提取液60mL置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以60℃濃縮蒸發(fā)1h，混合液于6000r/min離心4min，得上清液5mL。

1.3.3 酪氨酸合成酶液的制備

在文獻[6]的基礎(chǔ)上稍加修改。將洗凈的土豆置4℃冰箱預(yù)冷，去皮，切碎。在預(yù)冷的研缽中放入10g馬鈴薯，加入預(yù)冷的7.5mL pH7.2磷酸緩沖液，研磨勻漿。用兩層紗布濾出提取液，立即于3000r/min離心10min。取上清液用pH7.2的磷酸緩沖液定容至100mL。2h內(nèi)用完。

1.3.4 酪氨酸合成酶的酶促反應(yīng)時間曲線的繪制

在25℃，取pH6.8磷酸緩沖液3mL，加入0.05mol/L的鄰苯二酚反應(yīng)液2mL與酪氨酸合成酶0.1mL混合，取3mL混合液立即于412nm波長處測定吸光度(A412nm)，連續(xù)記錄3min，得A412nm-時間曲線。以pH6.8磷酸緩沖液作空白對照。

1.3.5 不同濃縮方法對酪氨酸合成酶活性抑制率的影響及其測定

取上述海蓬子提取液2mL，加pH6.8的磷酸鹽緩沖液1mL與2mmol/L的酪氨酸溶液2mL，待混合均勻后在冰浴中迅速加入酪氨酸合成酶溶液1mL，混勻，37℃溫育10min，于412nm波長處測定吸光度。酪氨酸合成酶抑制率計算公式為：

式中：A0為未加提取物樣品的加酶混合液所測的吸光度；A1為未加提取物樣品亦未加酶的混合液所測的吸光度；A2為加提取物樣品和酶的混合液所測的吸光度；A3為加提取物樣品而未加酶的混合液所測的吸光度。

1.3.64 種提取物的抑制效果比較

通過繪制海蓬子水提物、醇提物、超聲波水提物、超聲波醇提物對酪氨酸合成酶的酶促反應(yīng)曲線，檢測分別添加了4種相應(yīng)海蓬子提取物前后的酪氨酸酶活性大小，并計算抑制率大小，從而比較四者的抑制效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸合成酶的酶促反應(yīng)時間曲線

圖1 酪氨酸合成酶的酶促反應(yīng)時間曲線Fig.1 Time course of tyrosinase-catalyzed enzymatic reaction

在酪氨酸合成酶的最適溫度為25℃，最大吸收波長為412nm的條件下，以鄰苯二酚為底物的酪氨酸合成酶反應(yīng)時間曲線如圖1所示。直線式陡峭上升部分為0～20s，為初速度階段，逆反應(yīng)較少；隨后上升趨緩，逆反應(yīng)速度漸大，達(dá)到反應(yīng)平衡。

2.2 不同濃縮條件對酪氨酸合成酶活性抑制率的影響

圖2 兩種濃縮方法所得抑制率的比較Fig.2 Comparison on enzyme inhibition rates of extracts obtained from two condensation methods

由圖2可知，蒸發(fā)濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮這兩種不同濃縮條件對酪氨酸合成酶活性的抑制率影響不大，說明海蓬子提取物中抑制酪氨酸合成酶活性的成分受溫度的影響不顯著。因此，下列實驗均采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對提取物進行濃縮。

2.3 乙醇的配伍作用對海蓬子醇提物的影響

由圖3可知，用水回流濃縮后的海蓬子醇提物對酪氨酸合成酶有明顯抑制效果，與未加提取物相比，酶

促反應(yīng)時間曲線下移；至于海蓬子醇提物的酶促反應(yīng)時間曲線繼續(xù)下移，說明由于乙醇的配伍作用[7]，海蓬子醇提物對酪氨酸合成酶的抑制效果更加顯著?？傊?，兩種方式處理的海蓬子醇提物對酪氨酸合成酶都有明顯的抑制效果。

圖3 海蓬子醇提物的酶促反應(yīng)時間曲線Fig.3 Time courses of tyrosinase-catalyzed enzymatic reaction with and without the presence of ethanol extract

2.44 種海蓬子提取物對酪酸合成酶活性的抑制效果比較

圖4 海蓬子4種提取物的抑制效果比較Fig.4 Time courses of tyrosinase-catalyzed enzymatic reaction with the separate presence of four extracts

由圖4所示，由于乙醇的配伍作用，海蓬子醇提物比水提物對酪氨酸合成酶的抑制效果更顯著；因為超聲波破碎細(xì)胞的空化作用和強化傳質(zhì)的機械作用，從而更有利于海蓬子活性物的釋出，表現(xiàn)為超聲波的醇提物比超聲波的水提物具有更強的抑制作用。對酪氨酸合成酶的抑制率分別為：水提物32.48%，醇提物62.37%，超聲波水提物43.56%，超聲波醇提物75.81%。故最適宜選取超聲波醇提方案提取海蓬子中酪氨酸合成酶抑制劑。

3 結(jié)論與討論

海蓬子提取物對酪氨酸合成酶有明顯的抑制作用，其對酪氨酸合成酶活性的抑制效果為：超聲波醇提物＞醇提物＞超聲波水提物＞水提物，抑制率分別為：超聲波醇提物75.81%，醇提物62.37%，超聲波水提物43.56%，水提物32.48%。蒸發(fā)濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮這兩種不同濃縮方法對酪氨酸合成酶的抑制效果差別不是很明顯。

研究和開發(fā)生長于廣袤海岸荒漠和海灘上的鹽生植物，已成為當(dāng)今世界農(nóng)業(yè)的重大課題，在鹽堿地上耕作是一種新的思維方式[8]。因為海蓬子生長在不毛之地的鹽堿地上，土地費用比較低。另外，海蓬子無蟲害，不需要用農(nóng)藥，也不需要鋤草，種植管理費用不高[9-10]。海蓬子第一次成為酪氨酸酶抑制劑，它應(yīng)該作為一個新的有希望的重要漂白劑材料考慮。海蓬子提取物可以作為天然美白活性物質(zhì)應(yīng)用于美白護膚品和功能食品，也可以作為預(yù)防和治療黑色素瘤等色斑疾病的藥物進行開發(fā)。

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Inhibitory Effect of Extract from Salicornia herbacea on Tyrosinase Activity

YU Xiao-hong，SHEN Yu-xiang，CHEN Hong-xing，SHAO Rong*，XU Wei
(College of Chemistry and Biological Engineering, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224003, China)

In this paper, the inhibitory effect of extract from Salicornia herbacea on tyrosinase activity was investigated. Four extracts including water extract, ethanol extract, ultrasound-assisted water extract and ultrasound-assisted ethanol extract were used as the materials to explore the inhibitory effect on tyrosinase activity. The results indicated that the extraction rate did not exhibit an obvious difference after distillation evaporation and rotary evaporation. However, the inhibition effect on tyrosinase had a significant difference among four extracts using tyrosine as the substrate. The inhibition rates on tyrosinase were 32.48% for water extract, 62.37% for ethanol extract, 43.56% for ultrasound-assisted water extract and 75.81% for ultrasound-assisted ethanol extract, respectively. Moreover, the ultrasound-assisted ethanol extract was the strongest enzyme inhibitor among them.

Salicornia herbacea；extracts；tyrosinase；inhibition effect

TS202.3

A

1002-6630(2010)21-0131-03

2010-06-27

鹽城工學(xué)院“應(yīng)用化學(xué)重點建設(shè)學(xué)科開放項目經(jīng)費”資助項目(XKY2009004)；鹽城市工業(yè)科技支撐計劃項目(Yk2009047)

余曉紅(1976—)，女，講師，博士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵和食品工藝。E-mail：yxh1127@163.com

*通信作者：邵榮(1973—)，男，教授，博士，研究方向為生物化工。E-mail：sr@ycit.edu.cn