RP-HPLC測(cè)定三種黃連中的生物堿含量

崔國(guó)輝,袁漢堯,周克元

(廣東醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院臨檢教研室,廣東 湛江 524023)

黃連是毛茛科植物黃連(Coptis chinensis franch)的干燥根莖,文獻(xiàn)報(bào)道,它含有小檗堿、巴馬亭、藥根堿、黃連堿等多種原小檗堿型生物堿。祖國(guó)醫(yī)學(xué)記載其具有清熱、解毒的作用,很早就用于消化系統(tǒng)的治療和研究。例如魯勁松等[1]研究發(fā)現(xiàn)黃連總生物堿(TA)通過(guò)抑制胃炎時(shí)黏膜細(xì)胞的凋亡從而對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌脂多糖(Helicobacterpylori,LPS)引起的大鼠胃部炎癥有保護(hù)作用。而黃連中的主要成分小檗堿可以誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖抑制[2]。利用高效液相色譜可以將黃連中主要的生物堿成分進(jìn)行分離,可以用于黃連的質(zhì)量控制以及主要成分含量的測(cè)定[3-4],但也存在很多問(wèn)題,諸如分離差、峰型對(duì)稱性差、色譜柱壽命短和試劑消耗大的問(wèn)題。筆者參考有關(guān)文獻(xiàn),利用反相高效液相色譜檢測(cè)黃連中生物堿含量,并對(duì)云南黃連、北美黃連以及四川黃連中三種生物堿的含量進(jìn)行分析比較。同時(shí)對(duì)其加樣回收率、樣品穩(wěn)定性、精密度進(jìn)行分析。

1 儀器和試藥

1.1 儀器和色譜條件 色譜柱為安捷倫 C18柱子(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為乙腈 -水(48∶52,每 1L含有磷酸二氫鉀 3.4 g,十二烷基硫酸鈉 1.7 g);流速為 1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為 345 nm;進(jìn)樣量為 20μl。

1.2 試藥 云南黃連、四川黃連于成都藥材市場(chǎng)購(gòu)買,北美黃連于哈佛大學(xué)康景軒教授提供,經(jīng)由天然藥物中心鄧亦峰高級(jí)研究員鑒定。鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬亭、鹽酸藥根堿對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品鑒定所購(gòu)買。水為三蒸水,乙腈為色譜純。甲醇、鹽酸為分析純。

1.3 對(duì)照品溶液的準(zhǔn)備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品 6.00 mg,鹽酸巴馬亭對(duì)照品 1.65 mg,鹽酸藥根堿對(duì)照品 10.68 mg,分別以濃鹽酸 -甲醇(1∶99,V/V)定容于 10 ml容量瓶中,作為對(duì)照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備 稱取黃連藥材分別粉碎至過(guò) 20目篩,稱取約 0.1 g,精密秤定,置于 100 ml容量瓶之中,加濃鹽酸 -甲醇(1∶99,V/V)約 95 ml,60℃水浴 15 min,超聲振蕩 30 min,靜置過(guò)夜,濃鹽酸 -甲醇(1∶99,V/V)定容至刻度,混勻,0.45 μm濾膜過(guò)濾,即得。按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,以鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬亭、鹽酸藥根堿三種生物堿的對(duì)照品確定色譜峰的歸屬。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線以及線性范圍 依次分別準(zhǔn)確量取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液 80μl、200μl、240 μl、280 μl、320 μl;鹽酸巴馬亭對(duì)照品 140 μl、200 μl、240 μl、280 μl、360 μl;鹽酸藥根堿對(duì)照品 12 μl、16 μl、24 μl、28 μl、36 μl,以濃鹽酸 -甲醇 (1∶99,V/V)定容至 2 ml容量瓶刻度。搖勻,精確吸取上述各溶液 20μl,按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X),3次測(cè)量得到的峰面積均值為縱坐標(biāo)(Y),峰面積對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣量濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算,得到鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬亭、鹽酸藥根堿的回歸方程。

2 結(jié) 果

2.1 線性關(guān)系 繪制三種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表 1、表 2、表 3。

表1 藥根堿標(biāo)準(zhǔn)品峰面積大小-濃度表(n=3)

表2 巴馬亭標(biāo)準(zhǔn)品峰面積大小-濃度表(n=3)

表3 小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品峰面積大小-濃度表(n=3)

2.2 樣品測(cè)定 取對(duì)照品溶液及不同編號(hào)的黃連藥材供試品溶液,在上述色譜條件下進(jìn)樣,每次20μl,測(cè)定峰面積值,用峰面積按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量,結(jié)果見(jiàn)圖 1、表 4、表 5。

圖1 RP-HPLC色譜圖1藥根堿(jatrorrhizine) 2巴馬亭(palmatine) 3小檗堿(berberine)A混合對(duì)照組 B云南黃連樣品 C北美黃連樣品 D四川黃連樣品

表4 三種黃連三種組分的峰面積測(cè)定值(n=3,mAUis)

表5 黃連藥材的含量測(cè)定結(jié)果(n=3,%)

2.3 加回收率試驗(yàn) 分別取 3份已測(cè)知這三種生物堿含量的黃連藥材各約 50 mg,精密秤定,分別精密加入對(duì)照品溶液(含鹽酸小檗堿 2.8 mg、鹽酸巴馬亭 0.65 mg、鹽酸藥根堿 0.46 mg),按供試液制備和含量測(cè)定方法操作,結(jié)果該法測(cè)定黃連藥材中的小檗堿、巴馬亭、藥根堿的加回收率分別為103.8%(RSD為 1.8%,n=3)、103.8%(RSD為3.0%,n=3)、117.4%(RSD為 6.3%,n=3)。結(jié)果見(jiàn)表 6。

表6 加收率試驗(yàn)結(jié)果比較

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 小檗堿、巴馬亭、黃連堿及藥根堿等原小檗堿型生物堿的分子結(jié)構(gòu)相似,化學(xué)性質(zhì)亦相似,故選擇小檗堿考察方法學(xué)穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。取 0.096 mg/ml小檗堿溶液,分別于制備后的 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h進(jìn)樣 ,每次 20 μl,分別測(cè)定峰面積,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明供試品溶液在 10 h內(nèi)穩(wěn)定,鹽酸小檗堿峰面積 RSD為 2.4%。結(jié)果見(jiàn)表 7。

表7 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取 0.06 mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液,依法進(jìn)樣測(cè)定 5次考察儀器精密度,每次 20μl,分別測(cè)定峰面積,計(jì)算 RSD為0.8%。結(jié)果見(jiàn)表 8。

表8 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的選擇 黃連中原小檗堿型生物堿屬于季銨鹽,不易在 C18柱上保留。分離效果較好、峰型對(duì)稱性好,但是系統(tǒng)平衡時(shí)間長(zhǎng)。如果不加入離子對(duì)試劑,原小檗堿型生物堿等的保留能力下降,分離效果差,峰型托尾。故選用乙腈 -水溶液(48∶52,每 1 L含磷酸二氫鉀 3.4 g,十二烷基硫酸鈉 1.7 g)作為流動(dòng)相,峰型對(duì)稱性較好,與其他的雜質(zhì)峰完全達(dá)到基線分離,取得了滿意的效果。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 紫外光譜表明,鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬亭、鹽酸藥根堿的吸收曲線形狀相似,在 200-400 nm波長(zhǎng)范圍有兩個(gè)最大吸收波長(zhǎng)(265 nm和 345 nm),且在兩個(gè)波長(zhǎng)處的響應(yīng)值無(wú)明顯差別。從色譜圖看,以 265 nm為檢測(cè)波長(zhǎng),基線噪音較高,為 0.04 Mau,以 346 nm為檢測(cè)波長(zhǎng),基線噪音為 0.02 Mau,因此采用 345 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 進(jìn)樣量的確定 在反相色譜中原小檗堿型生物堿保留弱,流動(dòng)相中有機(jī)相比例應(yīng)較低,而樣品試劑主要是甲醇,如果進(jìn)樣量太大,會(huì)因?yàn)闃悠吩谏V柱中展寬而導(dǎo)致峰型變異。經(jīng)過(guò)方法學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證,進(jìn)樣 20μl可以滿足各項(xiàng)指標(biāo),并且峰型較好。

3.4 柱溫的影響 20℃以上測(cè)定效果較好,柱溫太低,流動(dòng)相易析出絮狀物。

3.5 云南黃連、北美黃連、四川黃連三種黃連生物堿含量的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而云南黃連含量少,北美黃連需要進(jìn)口,所以可以用國(guó)內(nèi)應(yīng)用比較廣泛的四川黃連在某些方面代替另外兩種黃連應(yīng)用。黃連中主要生物堿藥理作用相似,但還是有差別,例如小檗堿對(duì)去甲腎上腺素致大鼠胃平滑肌舒張的作用并無(wú)明顯影響;但巴馬亭可增強(qiáng)去甲腎上腺素致大鼠胃平滑肌舒張的作用;而黃連總生物堿可顯著對(duì)抗去甲腎上腺素致大鼠胃平滑肌舒張的作用,提示小檗堿和巴馬亭對(duì) α-受體的作用不顯著,而在黃連總生物堿中可能含有可拮抗 α-受體的成分[5]。至于黃連各個(gè)品種之間在藥理作用方面是不是有差別,以后的研究將進(jìn)一步闡述。

本文建立了一種簡(jiǎn)單快速的反相高效液相色譜方法,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,重現(xiàn)性好,可以用于黃連藥材中原小檗堿型生物堿的含量測(cè)定。

[1] 魯勁松,劉玉慶,李 明,等.黃連總生物堿對(duì)大鼠胃黏膜損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J].中國(guó)中藥雜志,2007,32(13)∶1 333-1 336.

[2] 陸 寧,王邦茂,黃迫俠,等.黃連素對(duì)脫氧膽酸誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖抑制作用及機(jī)制[J].中華消化雜志,2006,26(9)∶632-633.

[3] 黃小平,李隆云,瞿顯有,等.石柱黃連指紋圖譜研究[J].中藥材,2006,29(7)∶666-669.

[4] 徐 穎,周世文,湯建林,等.高效液相色譜法測(cè)定黃連生藥中鹽酸小檗堿的含量[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,29(2)∶179-180.

[5] 譚正懷,李杭翼.小檗堿、巴馬亭及黃連總生物堿對(duì)大鼠胃條的作用比較研究[J].中藥藥理與臨床,2006,22(34)∶48-50.