生物防腐劑乳酸菌素的研究進(jìn)展

劉長建,姜 波,崔玉波,劉 秋,齊小輝

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600)

乳酸菌素是某些乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽或前體多肽,可以抑制食品中的致病菌和腐敗菌,包括蠟狀芽胞桿菌、肉毒梭狀芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌等,從而減少或避免食品化學(xué)防腐劑所帶來的安全隱患。而且與抗生素相比,乳酸菌素是由安全的食品級微生物產(chǎn)生的,而且作為蛋白或多肽類物質(zhì)可以被腸道系統(tǒng)的水解蛋白酶分解,對腸道微生物菌群沒有不利影響。正是基于這些特性,有關(guān)乳酸菌素的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究成為目前食品微生物領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題[1-4]。

1 乳酸菌素定義

1925年,Gratia發(fā)現(xiàn)1株大腸埃希菌對其他的大腸埃希菌有抑菌活性,這種活性物質(zhì)被稱為大腸埃希菌素(colicine)。1953年,Jocob等對由細(xì)菌產(chǎn)生的對同源細(xì)菌具有高度專一的抗菌蛋白物質(zhì)統(tǒng)稱為細(xì)菌素(bacteriocin)。1978年,Konisky提出細(xì)菌素是某些細(xì)菌通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的分泌釋放到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的蛋白或多肽,其抑菌范圍不僅僅局限于親緣關(guān)系較近的種。而由乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素就叫做乳酸菌素,到目前為止普遍接受的觀點(diǎn)是：乳酸菌素是一類由質(zhì)粒DNA編碼形成的,在細(xì)胞溶解時釋放并通過專一位點(diǎn)結(jié)合而對近緣相關(guān)種有致死作用的活性蛋白類物質(zhì),產(chǎn)生菌對其乳酸菌素具有自身免疫性[1,4-5]。

2 乳酸菌素分類、性質(zhì)

根據(jù)乳酸菌素的分子量、熱穩(wěn)定性和修飾氨基酸的種類,可將其分為4類：①羊毛硫細(xì)菌素：它在乳酸菌的核糖體中合成,是一類小分子的修飾肽,分子內(nèi)通常含有脫氫(不飽和)氨基酸、羊毛硫氨酸或β-甲基羊毛硫氨酸,如Nisin、Lacticin481、LacticinJ49、PlantaricinC等;②熱穩(wěn)定的小分子肽：其結(jié)構(gòu)特征為N末端信號肽序列長度為18～21個氨基酸,前導(dǎo)肽鏈由一個蛋氨酸開始,并常隨一個賴氨酸;有活性的細(xì)菌素其N-末端+1的位置上通常是賴氨酸或精氨酸,如Pediocin-PA-1、Sakacins A、SakacinsP、LeucocinA、EnterocinA、Carnobacteriocins、LactococcinsG、LactococcinsF、LactacinF、PlantararicinsEF、PlantararicinsJK等;③熱敏感大分子細(xì)菌素：分子量一般大于30 ku,如Helveticins J、Enterolysin A等[2,6];④復(fù)合型的大分子復(fù)合物：除蛋白質(zhì)外還含有碳水化合物或脂基團(tuán),如leuconocin S、lactocin 27[7-8]。目前國際上研究最深、應(yīng)用最廣的乳酸菌素是乳酸乳球菌產(chǎn)生的Nisin(乳鏈球菌肽),Nisin的抗菌譜包括抑制鏈球菌、葡萄球菌、芽胞菌屬的一些種、梭菌及其他乳桿菌,可抑制芽胞的形成,而對人未發(fā)現(xiàn)毒性[9]。

乳酸菌素除種類繁多外,性質(zhì)也有很大差別。從抑菌譜看,大量的研究表明,部分乳酸菌產(chǎn)生的乳酸菌素不僅對近緣相關(guān)的種有抑制作用,而且對革蘭陽性和部分革蘭陰性菌也有良好的抑制效果,特別是當(dāng)與各類螯合劑(如EDTA)結(jié)合后,其抑菌范圍甚至拓寬到革蘭陰性菌,抑菌活性也大大提高。從對熱、pH值和蛋白酶的敏感性來看,乳酸菌素的敏感性和耐性差異很大。因此,盡管確定了許多乳酸菌素或類細(xì)菌素物質(zhì),但發(fā)現(xiàn)這些乳酸菌素在數(shù)量、遺傳基因的位置、后翻譯修飾和抑菌模式等方面差異很大[10]。

3 乳酸菌素的生物合成

乳酸菌素是通過核糖體蛋白合成機(jī)制,包括轉(zhuǎn)錄和翻譯來合成的。乳酸菌素有的是染色體編碼(如Nisin、LactacinB、LactacinF、HelveticinJ等),有的由質(zhì)粒編碼(如Diplococcin、Lacticin481、Lactococcins、Pediocins、SakacinA、Lactocins等),而CarnobacterocinB1則是染色體和rDNA都參與了乳酸菌素活性的編碼。大多數(shù)革蘭陽性菌的乳酸菌素是由質(zhì)?；蚓幋a的,與乳酸菌素合成相關(guān)的基因組通常還包括乳酸菌素合成基因,以及編碼在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯后修飾、加工轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面和菌株的自我保護(hù)性(免疫性)中發(fā)揮作用的蛋白產(chǎn)物的其他基因[8,11-12]。大部分乳酸菌素是由前體肽產(chǎn)生的,這些前體肽有一個短的N-端前導(dǎo)序列(包括18～24個氨基酸),在翻譯后的修飾中,這個部分被切除掉產(chǎn)生成熟的乳酸菌素。目前對于這個前導(dǎo)肽的作用仍未可知,它并未表現(xiàn)出信號序列的所有特征。

乳酸菌素不同于青霉素等抗生素,為多肽或蛋白質(zhì);此外,傳統(tǒng)的多肽抗生素是由細(xì)胞多酶復(fù)合體催化形成的,不存在結(jié)構(gòu)基因;而乳酸菌素由基因編碼,可以通過基因工程加以改造。例如多肽抗生素(如桿菌肽)是由一系列的多酶復(fù)合體的酶反應(yīng)所合成的,而乳酸菌素是由核糖體合成的前體肽經(jīng)過酶修飾后合成[4,13]。

4 影響乳酸菌素產(chǎn)量的因素

乳酸菌素通常在指數(shù)期向平穩(wěn)期轉(zhuǎn)換時產(chǎn)生,如Nisin就是在指數(shù)中期開始產(chǎn)生,在細(xì)胞生長進(jìn)入平穩(wěn)期時達(dá)到最大值[14]。許多研究表明,乳酸菌素的生物合成對pH有很強(qiáng)的依賴性,當(dāng)pH值小于5.0時才有大量乳酸菌素產(chǎn)生,60%以上的乳酸菌素是在這時產(chǎn)生的,這是由于只有在這一時期和酸性條件下無活性的Pediocin才向有活性的Pediocin轉(zhuǎn)化。相反,Prenisin、Preleuconocin、Presakecin轉(zhuǎn)化為有活性的Nisin、Leuconocin和Sakecin需要較高的pH值,并且是在細(xì)胞生長時期大量形成。另外決定乳酸菌素產(chǎn)量的因素還有菌株、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)時間和最適生長溫度。乳酸菌素具有作為食品生物防腐劑以控制腐敗和病原細(xì)菌的潛在用途,為了能在食品中更經(jīng)濟(jì)地使用,簡單和經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基,如含有食品級腸粉的TGE或TGE緩沖培養(yǎng)液,在合適的pH條件下培養(yǎng),可以獲得較高的產(chǎn)量[15-16]。

5 乳酸菌素活性檢測方法

乳酸菌所產(chǎn)生的乳酸菌素各不相同,其抑菌譜也不同,有的乳酸菌素具有較寬的抑菌譜,而有的抑菌譜較窄,甚至沒有抑制腐敗菌的能力。到目前為止,乳酸菌素活性的檢測主要采用固體檢測法,也稱瓊脂擴(kuò)散法,最常用的有杯碟法、濾紙片法和點(diǎn)種法。具體操作：在無菌平皿中倒入10 mL加熱融化的素瓊脂(2%),待其充分冷卻凝固后,放入數(shù)個已滅菌的牛津杯。將固體檢測培養(yǎng)基融化后冷卻至50℃左右后加入指示菌液至106個/mL,迅速混合均勻,倒平板,冷卻后取出牛津杯。分別向孔洞里加入等量的相同稀釋倍數(shù)的乳酸菌素液,培養(yǎng)后用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量抑菌圈直徑。抑菌圈大小與乳酸菌素活性強(qiáng)弱呈正相關(guān)[17-18]。

也可將待測乳酸菌素溶液進(jìn)行偶數(shù)倍稀釋,用移液器取10μL各稀釋倍數(shù)的稀釋液,按順序分別加到含有指示菌(106個/mL)的平板上,吸收后倒置培養(yǎng),記錄沒有活性時的最小稀釋倍數(shù)為n,設(shè)這時稀釋液的活性為U/10μL,則乳酸菌素活性值等于最終稀釋倍數(shù)與稀釋液的活性的積[19-21]。

6 乳酸菌素的利用方式

目前,乳酸菌素可直接投放到食品中;也可與各類螯合劑結(jié)合,提高抑菌活性譜,擴(kuò)展應(yīng)用范圍;或者直接在食品中添加產(chǎn)乳酸菌素的菌體細(xì)胞,形成的乳酸菌素不僅能夠抑制革蘭陽性菌,而且能夠抑制革蘭陰性腐敗菌和病原菌,延長食品的保藏期限;有時乳酸菌素產(chǎn)生的乳酸菌也可以作為發(fā)酵劑發(fā)酵的副產(chǎn)物存在于成熟奶酪、酸奶、臘腸、泡菜等食品中,達(dá)到保存食品的目的。目前已有60多個國家在乳制品、肉制品、蔬菜產(chǎn)品、罐頭、魚產(chǎn)品、乙醇類飲料等食品中使用Nisin作為安全、無毒、天然的食品防腐劑[1-2]。

許多研究證明,具有產(chǎn)乳酸菌素能力的發(fā)酵劑在發(fā)酵過程中可以防止和控制不良菌叢引起的污染。因此在發(fā)酵食品和活菌制劑中使用產(chǎn)乳酸菌素的乳酸菌以及在食品中添加產(chǎn)乳酸菌素的乳酸菌比直接添加乳酸菌素更可取。然而并不是所有的乳酸菌都產(chǎn)乳酸菌素,若通過生物工程技術(shù)將乳酸菌素的結(jié)構(gòu)基因克隆到生產(chǎn)中應(yīng)用的菌株中,將具有更廣的應(yīng)用價值,同時為人工合成大量的乳酸菌素提供了可能[22-23]。

7 乳酸菌素的食品安全性

乳酸菌制劑在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等與人類密切相關(guān)的重要領(lǐng)域應(yīng)用價值很高。與益生作用有關(guān)的(如乳桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、雙球菌屬等)狹義的乳酸菌屬于益生菌,尤其受到人們的重視,關(guān)于其安全性也在評估中。

由于長期以來乳酸菌一直為人們所食用,被普遍認(rèn)為是安全的微生物有機(jī)體。而且奶制品的流行病學(xué)數(shù)據(jù)和益生菌安全性的總回顧,顯示乳酸菌沒有涉及人類疾病傳染的證據(jù)。乳酸菌安全性爭議最大的是腸球菌。關(guān)于糞腸球菌制劑在人體的有效性和安全性曾經(jīng)有人進(jìn)行了2個隨機(jī)的雙盲實驗。實驗表明160例扁桃體病人服用腸球菌菌株是有效和安全的。對106例免疫缺陷所致的各種慢性呼吸道感染患者,試驗結(jié)果也表明了糞鏈球菌的有效性和安全性。內(nèi)源性乳酸菌,尤其是定植于健康人腸道的乳酸菌未發(fā)現(xiàn)任何副作用,對人是安全的。1989年美國食品藥品管理局(FDA)和美國飼料公共協(xié)會(AAFCO)批準(zhǔn)可以作為安全的益生菌菌種42株,其中包括屎腸球菌和糞腸球菌[24]。

但是由于乳酸菌在食品中的濃度變化很大,而且目前國際也沒有發(fā)酵食品中細(xì)菌水平的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。所以乳酸菌及乳酸菌素的消費(fèi)始終保留著可能導(dǎo)致疾病和個體可能對特異菌株有不同反應(yīng)的可能性。食品生產(chǎn)企業(yè)需要在添加新乳酸菌菌株之前仔細(xì)評價其安全性[25]。

8 乳酸菌素研究中存在的問題及展望

隨著研究的深入,乳酸菌素的應(yīng)用前景越來越受到人們的廣泛關(guān)注,然而在乳酸菌素的研究中仍存在許多有待解決的問題,主要體現(xiàn)在：①乳酸菌素的產(chǎn)量普遍較低,目前的研究方向主要集中在篩選高產(chǎn)菌株及構(gòu)建工程菌株上;②乳酸菌素的抑菌譜普遍較窄,目前報道的乳酸菌素一般只對革蘭陽性菌有抑制作用,而對革蘭陰性菌、霉菌和酵母菌沒有作用,而且不同種屬的抑菌機(jī)制尚不十分清楚;③乳酸菌素在不同食品介質(zhì)中的溶解性和穩(wěn)定性較差,限制了它們的廣泛應(yīng)用;④評價其應(yīng)用潛力的工作仍然是以一般性報道為主,尚有待更深入的研究[4,20]。

在今后的一段時間中,乳酸菌素的研究重點(diǎn)可能會集中在以下幾方面：①根據(jù)已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計全新的氨基酸序列,人工合成新型乳酸菌素或?qū)ΜF(xiàn)有的乳酸菌素進(jìn)行改造,提高乳酸菌素的應(yīng)用潛力;②通過修飾編碼蛋白質(zhì)的DNA序列,利用DNA重組技術(shù)產(chǎn)生滿足人們要求的活性多肽或蛋白質(zhì);③提高乳酸菌素產(chǎn)量水平,拓寬乳酸菌素抑菌譜,提高乳酸菌素的溶解性和穩(wěn)定性;④對乳酸菌素產(chǎn)生菌株的自身免疫性機(jī)制進(jìn)行深入研究。隨著人們對乳酸菌生理功能和保健功能的認(rèn)識以及分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,乳酸菌素在食品領(lǐng)域?qū)@得廣泛的應(yīng)用,集中多種有益基因的食品級乳酸菌菌株和工程菌菌株將不斷出現(xiàn),并給人類帶來巨大的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益。

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