食源性致病菌多重分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

索 標(biāo) ,汪月霞 ,艾志錄

( 1 .河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州 450002 ; 2 .河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450002 )

食源性致病菌多重分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

索 標(biāo)1,汪月霞2,艾志錄1

( 1 .河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州 450002 ; 2 .河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450002 )

快速、可靠的食源性致病菌高通量檢測(cè)方法對(duì)于確保食品安全具有重要意義,近年基于DNA水平的多重分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)迅速發(fā)展,針對(duì)各種不同的食源性致病菌建立了多種多重分子檢測(cè)技術(shù),包括多重PCR、多重實(shí)時(shí)熒光PCR以及基因芯片等。對(duì)這些多重分子檢測(cè)技術(shù)的最新研究進(jìn)展作一綜述,并且建議在今后該技術(shù)的研究中,仍需要在食品中多種致病菌同時(shí)選擇性增菌培養(yǎng)、亞致死損傷修復(fù)以及檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的構(gòu)建等方面取得突破,從而能夠更好地實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的高通量檢測(cè)。

多重分子方法;食源性致病菌;多重PCR;基因芯片;檢測(cè)

食源性致病菌已經(jīng)被公認(rèn)是造成食品污染的重要原因之一,甚至可能會(huì)造成人類的死亡,常規(guī)的微生物學(xué)檢測(cè)方法如平板菌落計(jì)數(shù)法和最大或然數(shù)法(MPN)等耗時(shí)耗力,需要5～7 d才能完成整個(gè)檢測(cè)過程。食源性致病菌的快速檢測(cè)和鑒定方法對(duì)食品企業(yè)內(nèi)部安全衛(wèi)生監(jiān)控極為重要,政府部門也急需發(fā)展這些快速檢測(cè)技術(shù)來用于履行食品安全監(jiān)管職能。多重分子生物學(xué)檢測(cè)方法由于在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)完成多個(gè)檢測(cè)目的[1],目前已經(jīng)成功應(yīng)用于食源性致病菌的安全檢測(cè),并建立了多重PCR、多重實(shí)時(shí)熒光PCR、基因芯片等多種檢測(cè)技術(shù)。本文將對(duì)這些多重分子檢測(cè)方法的研究進(jìn)展作一綜述,并針對(duì)這些方法在食源性致病菌安全檢測(cè)應(yīng)用中的關(guān)鍵技術(shù)問題和難點(diǎn)以及未來發(fā)展趨勢(shì)提出意見。

1 食源性致病菌多重分子檢測(cè)技術(shù)

1.1 多重PCR(M ultiplex PCR)

多重PCR技術(shù)是普通PCR技術(shù)的一種延伸,該技術(shù)在一個(gè)擴(kuò)增體系中含有多對(duì)引物,可同時(shí)完成多個(gè)目的片段的擴(kuò)增,達(dá)到多種檢測(cè)的目的。現(xiàn)在該技術(shù)不僅用于多種致病菌的同時(shí)檢出,如丁久法等[2]開發(fā)出的多重PCR方法用于大腸埃希菌O157和單核細(xì)胞增生李斯特菌同時(shí)檢測(cè),也有研究將該方法用于同一致病菌毒素分泌型[3]、血清型[4]或耐藥[5]分型。影響多重PCR檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵因素之一是引物的設(shè)計(jì),要求所有設(shè)計(jì)引物的退火溫度必須非常接近,擴(kuò)增產(chǎn)物大小的差別也要足夠大以能夠在瓊脂糖凝膠電泳中有效區(qū)分開來。同時(shí),多重PCR引物的各擴(kuò)增之間也不能有干擾,否則會(huì)使得多重PCR的擴(kuò)增反應(yīng)體系難以得到優(yōu)化,這在引物對(duì)數(shù)量較多的反應(yīng)體系中尤為關(guān)鍵[6]。Rachlin等[7]開發(fā)出一種基于互聯(lián)網(wǎng)的MuPlex軟件,該軟件根據(jù)相互作用參數(shù)、引物選擇標(biāo)準(zhǔn)以及達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)所需要的多重?cái)?shù),設(shè)計(jì)DNA序列的特異性引物,并為各靶點(diǎn)可能出現(xiàn)的競(jìng)爭(zhēng)問題提供多種解決方案。此外,也有研究建議在多重PCR引物兩端加上接頭以解決各擴(kuò)增之間的競(jìng)爭(zhēng)問題[8]。Yuan等[9]開發(fā)出一種通用引物,由此設(shè)計(jì)的多重PCR檢測(cè)方法,可完成食品中沙門氏菌、大腸埃希菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌的特異性同時(shí)高效檢出。

1.2 實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-time PCR)

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在核酸擴(kuò)增過程中就能看到致病菌檢測(cè)的結(jié)果,因此,與傳統(tǒng)PCR方法相比,實(shí)時(shí)熒光PCR不需要后續(xù)的分析過程,從而顯著縮短了檢測(cè)的時(shí)間,也減少了實(shí)驗(yàn)室環(huán)境對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)所帶來污染的可能,該技術(shù)目前已經(jīng)成為食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)開發(fā)的熱點(diǎn)之一。此外,實(shí)時(shí)熒光PCR是一種定量檢測(cè)方法,可以用來測(cè)定各種樣品中致病菌的數(shù)目[10-11],因此在食品安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中具有重要作用。用TaqMan探針進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光PCR方法結(jié)合標(biāo)記好的探針,根據(jù)熒光吸收波長的不同,可以在一個(gè)反應(yīng)體系完成多個(gè)序列的擴(kuò)增反應(yīng),同時(shí)檢測(cè)多個(gè)不同食源性致病菌。目前,已經(jīng)有一些研究報(bào)道用多重實(shí)時(shí)熒光PCR的方法實(shí)現(xiàn)食品中多種致病菌的同時(shí)檢測(cè)。如利用多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法完成沙門氏菌、大腸埃希菌O157和單核細(xì)胞增生李斯特菌的同時(shí)檢測(cè)[12];多重實(shí)時(shí)熒光PCR的方法檢測(cè)沙門氏菌中高致病性的血清型Choleraesuis以及Paratyphi C[13];多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)檢出不同血清型的沙門氏菌,包括Enteritidis、Gallinarum、Typhimurium、Kentucky以及Dublin等[14]。Guion等[15]利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度(Tm值)不同設(shè)計(jì)的多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,根據(jù)各種重要毒力因子對(duì)致瀉性大腸埃希菌進(jìn)行分型,可以在不需要昂貴的熒光探針的情況下完成多重檢測(cè),節(jié)約了檢測(cè)的成本。然而,由于多重實(shí)時(shí)熒光PCR容易受到熒光檢測(cè)器數(shù)量的限制[16-18],當(dāng)待測(cè)樣品中可能污染有大量多種致病性細(xì)菌時(shí),很難用該方法完成高通量同時(shí)檢測(cè)。

1.3 基因芯片檢測(cè)技術(shù)(Microarray)

生物芯片技術(shù)是通過縮微技術(shù),根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理,將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng),以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。1個(gè)基因芯片上可以含有成千上萬個(gè)探針,一次檢測(cè)可以同時(shí)檢出多種致病菌。因此,基因芯片技術(shù)大大提高了檢測(cè)工作的效率,為食源性致病微生物的高通量檢測(cè)提供了非常有用的工具[19]。近年來,單核苷酸微陣列已被成功應(yīng)用到多種致病性細(xì)菌以及病毒的檢測(cè)與基因分型中,如Cremonesi等[20]建立的基于16S rDNA基因的可用于奶制品中15種致病性細(xì)菌檢測(cè)的基因芯片檢測(cè)方法,Wang等[21]開發(fā)出可用于13個(gè)食源性致病菌同時(shí)檢測(cè)的基因芯片技術(shù),該技術(shù)的檢測(cè)靈敏度為102cfu。Suo等[22]與多重PCR擴(kuò)增相結(jié)合,開發(fā)出可用于食品中大腸埃希菌O157∶H7、空腸彎曲桿菌、沙門氏菌以及單核細(xì)胞增生李斯特菌同時(shí)檢出的低密度芯片制作及檢測(cè)方法,在這些致病菌的高通量檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前,基因芯片技術(shù)在致病菌的檢測(cè)、診斷領(lǐng)域尚未得到廣泛應(yīng)用,其中一個(gè)重要的原因在于該技術(shù)目前尚無可信的標(biāo)準(zhǔn),不同的實(shí)驗(yàn)室或試驗(yàn)平臺(tái)得到的結(jié)果可能會(huì)各不相同,因此檢測(cè)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性也沒有保障[23-24]。為此,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)專門啟動(dòng)了基因芯片質(zhì)量控制計(jì)劃(Micro Array Quality Control, MAQC)[25-26],對(duì)政府部門、學(xué)術(shù)界以及工業(yè)界各自建立的1300多個(gè)基因芯片技術(shù)體系及其標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較、驗(yàn)證。MAQC計(jì)劃的研究結(jié)果表明,影響芯片結(jié)果的關(guān)鍵因素在于生物樣品間的差別以及人為的因素,而并非該技術(shù)本身容易造成試驗(yàn)結(jié)果的多樣性[27],這也表明不同試驗(yàn)平臺(tái)所得到的基因芯片結(jié)果在理論上應(yīng)該可以達(dá)到高度的一致性。該研究結(jié)果就為基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷、病原性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供了理論上的可能。然而,該技術(shù)真正廣泛應(yīng)用到實(shí)際操作中仍需要標(biāo)準(zhǔn)的、可靠的試驗(yàn)儀器以及方法等[28-29],如在基因芯片檢測(cè)過程中,尚缺乏有效、簡便的方法以獲得足夠量的熒光標(biāo)記DNA與芯片上的探針進(jìn)行雜交,并獲得明顯的特異性陽性結(jié)果。此外,開發(fā)如此高通量的檢測(cè)方法,適宜的特異性分子檢測(cè)靶點(diǎn)也是一個(gè)亟需解決的制約因素。

2 食源性致病菌多重分子檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)和難點(diǎn)

2.1 食品中多種致病菌的同時(shí)選擇性增菌是多重檢測(cè)技術(shù)的瓶頸

為了能夠真正在一個(gè)檢測(cè)平臺(tái)中完成多種食源性致病菌的同時(shí)檢測(cè),必須有一種培養(yǎng)液能同時(shí)增菌培養(yǎng)多種目的致病菌。目前常用的多種致病菌非選擇性增菌液有緩沖蛋白胨水(buffered peptone water;Z3;Y3,BPW)、胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase soy broth,TSB)以及營養(yǎng)肉湯(nutrient broth,NB)等,現(xiàn)已開發(fā)出一種通用預(yù)增菌培養(yǎng)液(universal preenrichment broth,UPB)可以用于多種食源性致病菌的同時(shí)增菌培養(yǎng)[30],該培養(yǎng)液可以從Difco Lab、Sparks、MD公司購買,并被許多檢測(cè)方法所采用[31-32]。Kawasaki等[33]開發(fā)出一種No.17增菌液,可以用于食品中沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌以及大腸埃希菌O157∶H7的同時(shí)非選擇性增菌培養(yǎng),現(xiàn)在也已經(jīng)應(yīng)用于多重檢測(cè)平臺(tái)的開發(fā)[34]。然而,該類培養(yǎng)液中由于缺乏細(xì)菌生長抑制成分,不能選擇性地增菌培養(yǎng)檢測(cè)目的致病菌,因而不適用于背景菌群含量較高的食品樣品,如食品原料或未經(jīng)加工的動(dòng)植物食品樣品等。SEL培養(yǎng)液是新開發(fā)出來的應(yīng)用于食品樣品中沙門氏菌、大腸埃希菌O157∶H7以及單核細(xì)胞增生李斯特菌3種致病菌同時(shí)選擇性增菌的培養(yǎng)基[35],該培養(yǎng)基中含有相應(yīng)的細(xì)菌生長抑制物質(zhì),能有效的抑制食品中除這3種目的致病菌以外的其他背景菌群的生長,獲得盡可能多的目的致病菌,在這3種致病菌的多重檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 現(xiàn)代多重分子檢測(cè)方法不能忽視食品樣品中亞致死損傷細(xì)胞的存在

食品中致病菌存在的高度危害性需要有效的控制技術(shù)對(duì)其進(jìn)行殺滅,然而,目前常用的加熱、高壓等食品安全控制技術(shù)處理后的致病性細(xì)菌常處于3種不同的狀態(tài)[36]:①未受到損傷的細(xì)胞,能夠在選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基上正常生長;②受到損傷、但仍具有修復(fù)能力的細(xì)胞,該類損傷細(xì)胞不能在加有選擇性成分的培養(yǎng)基上生長,但能夠在非選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行自我修復(fù)并增殖;③死亡細(xì)胞,該類細(xì)胞完全不具有活性,在選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基上均不能生長。

食品樣品中亞致死損傷細(xì)胞的存在一方面可能高估活性細(xì)胞存在的數(shù)目[37],也有可能低估活性細(xì)胞存在的數(shù)目[38],特別是在當(dāng)檢測(cè)前應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基對(duì)食品樣品進(jìn)行預(yù)增菌培養(yǎng)時(shí)。只有重視食品中亞致死損傷細(xì)胞的存在,在基于DNA的分子生物學(xué)檢測(cè)之前,采用合適的方法對(duì)致病菌損傷關(guān)鍵部位進(jìn)行修復(fù),才能真正實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的安全檢測(cè)。然而,目前在多重檢測(cè)過程中所采用的損傷細(xì)胞修復(fù)方法,大多采用不含選擇性成分的營養(yǎng)培養(yǎng)基,如UPB、TSB等[31,39],無法滿足目標(biāo)檢測(cè)致病菌選擇性增菌的需要。因此,選擇合適的多重選擇性增菌培養(yǎng)液是食源性致病菌多重檢測(cè)的關(guān)鍵步驟之一。

2.3 可靠的分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果需要有效的內(nèi)標(biāo)作為假性結(jié)果的指示物

擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)是加入到PCR反應(yīng)體系中的非靶點(diǎn)特異性DNA序列,可以與目標(biāo)DNA一起擴(kuò)增,用以將PCR檢測(cè)過程中的可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果與真實(shí)的陰性結(jié)果區(qū)別開來。當(dāng)用分子生物學(xué)的方法檢測(cè)食品或環(huán)境中的致病性細(xì)菌時(shí),由于食品基質(zhì)、DNA提取過程中殘留的有機(jī)酸以及其他多種因素均可抑制PCR擴(kuò)增反應(yīng),影響分子生物學(xué)檢測(cè)的結(jié)果,因此,擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)現(xiàn)在已經(jīng)被認(rèn)為是分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)所必須具有的[40]。用于PCR擴(kuò)增的內(nèi)標(biāo)通常為加入反應(yīng)體系的一段外源DNA序列,如果擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)所用的引物與檢測(cè)所用的引物相同,稱為競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo),如果2種引物不同,則為非競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)[41]。在傳統(tǒng)PCR反應(yīng)中,擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)與檢測(cè)目標(biāo)通過產(chǎn)物的大小相區(qū)分;在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中,兩者通過探針信號(hào)的不同吸收波長相區(qū)分;在基因芯片檢測(cè)體系中,則一般用芯片上單獨(dú)的樣點(diǎn)和雜交結(jié)果來指示檢測(cè)結(jié)果的可靠性[42]。

目前已經(jīng)開發(fā)出多種構(gòu)建擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的方法,包括雙鏈DNA、單鏈DNA、質(zhì)粒、攜帶外源質(zhì)粒的別種菌株、來源于其他菌株的基因組DNA等。Long等[11]首次采用DNA隨機(jī)排序的方法設(shè)計(jì)出一段獨(dú)特的I AC序列,該序列與檢測(cè)目標(biāo)DNA序列具有相同的長度和GC含量,采用基因工程的手段將該I AC序列導(dǎo)入單核細(xì)胞增生李斯特菌中構(gòu)建突變菌株后,將該突變菌株加入熒光定量PCR反應(yīng)體系中,由此構(gòu)建了一個(gè)新型的食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)方法,該方法不僅可以用來指示檢測(cè)過程中可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果,也可以用于食品樣品中致病菌數(shù)目的定量檢測(cè)。

3 結(jié) 論

現(xiàn)在已經(jīng)建立多種基于DNA水平的食源性致病菌多重分子檢測(cè)技術(shù),由于這些技術(shù)所具有的高通量、快速、靈敏、高效以及特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),在食源性致病菌的快速檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。然而,未來該技術(shù)的研究仍需要在食品中多種致病菌同時(shí)選擇性增菌培養(yǎng)、亞致死損傷修復(fù)以及檢測(cè)內(nèi)標(biāo)等方面取得突破,以使得該類技術(shù)能夠更好地為食源性致病菌高通量檢測(cè)服務(wù)。

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Research Development on Multiplex Molecular Detection Methods of Foodborne Pathogens

SUO Biao1,WANG Yue-xia2,AI Zhi-lu1
(1.Coll.of Food Sci.&Technol.,2.Coll.of Life Sci.,Henan Agric.Uni.,Zhengzhou,450002)

Abstract:Rapid,dependable and high throughput methods to detect and characterize food borne pathogens is of great significance for food safety.Recently multiplex molecular methods based on molecular biology atDNA level have been developed rapidly,and established various multiplex molecular testing techniques including multiplex PCR, multiplex real-ti me fluorescence PCR and gene chip etc.The newest research progress was reviewed in this article, suggested that a breakthrough on the aspects of simultaneous selective enrichment,recovery of sublethal injured cells and construction of internal control in foods are still needed accordingly to serve for a better realization of high throughput detection of food borne pathogens.

multiplex molecular methods;food borne pathogens;multiplex PCR;gene chip;detection

Q93-33;R15

A

1005-7021(2010)06-0071-05

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(082102320006)

索標(biāo) 男,講師。研究方向?yàn)槭称肺⑸锓肿由鷳B(tài)與食品質(zhì)量安全。Tel:0371-63558150,E-mail:suobiao@gmail.com

2010-11-13;

2010-11-21