桃紅四物湯中6種指標(biāo)性成分的含量測(cè)定

王繼陳，韓 嵐，張艷艷，彭代銀

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；3.安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，安徽 合肥 230601)

桃紅四物湯是活血化瘀、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)的經(jīng)典名方，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、熟地黃和白芍組成。現(xiàn)代藥理研究表明，桃紅四物湯中阿魏酸、羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、藁本內(nèi)酯等成分具有抗炎、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗血小板活化等藥理作用[1-3]，臨床上可用于治療腦缺血、骨折、痛經(jīng)、產(chǎn)后病等疾病[4-7]。對(duì)此，建立桃紅四物湯質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)十分必要，現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)中無(wú)桃紅四物湯的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，且目前關(guān)于桃紅四物湯質(zhì)量控制的研究較少，對(duì)成分的考察較為片面，只選擇某一部位或者某一類成分進(jìn)行考察[8-11]，且忽視中藥復(fù)方整體性、復(fù)雜性的特點(diǎn)，仍然需要進(jìn)一步研究。本研究采用超高效液相色譜法建立同時(shí)測(cè)定羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯6種成分含量的方法，為桃紅四物湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 1290 Infinity超高效液相色譜儀[包括G4220A 1290 Bin Pump(系列號(hào)DEBAA05426)四元泵、G1316C 1290TCC(系列號(hào)DEBAC10714)柱溫箱、G4226A 1290Samper(系列號(hào)DEBAP06788)自動(dòng)進(jìn)樣器、G4212A 1290DAD(系列號(hào)DEBAF04086)檢測(cè)器]：美國(guó)安捷倫公司；CascadaⅠ超純水儀：美國(guó)頗爾公司；5417R型離心機(jī)：德國(guó)艾本德公司；AB135-S型十萬(wàn)分之一電子天平：德國(guó)梅特勒-托利多公司；真空干燥箱：中國(guó)南通金石實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；恒溫水浴鍋：江蘇省常州普天儀器制造有限公司；超聲儀：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 羥基紅花黃色素A(批號(hào) wkq16070605)、苦杏仁苷(批號(hào) 160210)、芍藥苷(批號(hào) 150920)、阿魏酸(批號(hào) 150526)、毛蕊花糖苷(批號(hào) wkq16062004)、藁本內(nèi)酯(批號(hào) wkq16051404)：四川省維克奇生物科技有限公司；甲醇、乙腈：瑞典歐森巴克化學(xué)公司；超純水：自制；乙醇：上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；醋酸銨：上海麥克林生化科技有限公司；醋酸：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.3 飲片 熟地黃(批號(hào) 1705312、170906、170618)：河南；當(dāng)歸(批號(hào) 161108、161223、170514)：甘肅；川芎(批號(hào) 1701033、170712、170902)：四川；白芍(批號(hào) 1711011、1711025、180116)：安徽；桃仁(批號(hào) 1702181、1708011、1711003)：河北；紅花(批號(hào) 1707213、17090121、1712014)：新疆。以上各批次6味藥材均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室俞年軍教授鑒定。

2 方法和結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯適量，甲醇定容，制成分別含羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯0.50、0.51、0.86、0.47、0.51、0.50 mg/mL的混合溶液。

2.2 供試品溶液的制備 依據(jù)《方劑學(xué)》(第7版)[12]，按熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎、桃仁、紅花質(zhì)量比為4∶3∶3∶2∶3∶2的比例共稱取17 g藥物，煎煮制備供試品溶液。按同樣方法，共稱取3批，各加入10倍量(容積與質(zhì)量之比)75%乙醇回流提取2 h，濾過(guò)，濾渣用8倍量75%乙醇繼續(xù)回流提取2 h，合并兩次濾液，濃縮，75%乙醇定容至50 mL量瓶中，精密吸取1 mL轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，超純水稀釋至刻度，精密吸取2 mL于離心管內(nèi)，15 000 r/min高速離心15 min，取上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，共制備3批供試品溶液。

2.3 色譜條件 采用美國(guó)安捷倫公司1290 Infinity超高效液相色譜儀，G4212A 1290DAD(Serial No. DEBAF04086)檢測(cè)器，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相：含7.84 mmol/L乙酸銨的0.05%乙酸水(A)和甲醇溶液(B)。流速：0.2 μL/min。進(jìn)樣量：2 μL。柱溫：25 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)：0～4.5 min，403 nm；4.5～9 min，403 nm(用于檢測(cè)羥基紅花黃色素A)和210 nm(用于檢測(cè)苦杏仁苷)；9～13 min，230 nm；13～18 min，283nm；18～30 min，328 nm。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液，依次向下稀釋2.5、5、12.5、25、62.5倍，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，分別以濃度(x)對(duì)峰面積(y)進(jìn)行線性回歸，回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2，結(jié)果表明進(jìn)樣量與峰面積有良好的線性關(guān)系。

表2 線性回歸方程

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，取濾液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.432%、1.265%、0.658%、0.718%、0.970%、0.734%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液6份，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果顯示羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為0.765%、1.132%、0.633%、0.496%、1.267%、0.379%，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在0、2、4、6、8、12、24 h供試品溶液進(jìn)樣2 μL，分別計(jì)算羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD，結(jié)果分別為1.172%、1.538%、0.845%、0.790%、1.872%、0.699%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取桃紅四物湯藥材9份，分別向其中加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液(分別相當(dāng)于藥材原有含量的50%、100%、150%)，每一質(zhì)量濃度取3份，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表3 6種成分的加樣回收率

續(xù)表3

2.5 桃紅四物湯有效成分含量測(cè)定 采用相同的桃紅四物湯藥液提取方法，3批次桃紅四物湯藥液應(yīng)用所建立的方法每批重復(fù)進(jìn)樣6次，并同時(shí)測(cè)定桃紅四物湯中的6種指標(biāo)性成分，結(jié)果見(jiàn)表4。樣品和混標(biāo)的超高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

表4 3批次樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=6)

3 討論

阿魏酸具有明顯的抗氧化、抗炎等藥理活性[13-14]，可用于動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病的治療[15-16]。桃仁是常用的活血化瘀藥物，苦杏仁苷作為其主要的活性成分，具有心血管保護(hù)、抗腫瘤、抗纖維化等廣泛的藥理作用。藁本內(nèi)酯能明顯減少腦缺血再灌注引起的腦梗死體積，改善腦神經(jīng)功能，并且能減輕大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞和海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷[17]，能夠舒張血管[18]，改善微循環(huán)[19]，具有很強(qiáng)的活血化瘀作用。羥基紅花黃色素A是發(fā)揮活血化瘀功效的主要有效成分，同時(shí)也是藥用紅花中最有效的水溶性成分[20]，對(duì)腦缺血、心肌缺血具有明顯的功效，同時(shí)也有抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等廣泛的藥理活性。芍藥苷是中醫(yī)傳統(tǒng)補(bǔ)血藥白芍的主要藥理成分，國(guó)內(nèi)外研究已證明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗氧化、抗驚厥等多種生物學(xué)效應(yīng)，并且毒性和不良反應(yīng)較小[21]。毛蕊花糖苷為地黃中代表性苷類化合物，具有保肝、保護(hù)心腦血管、延緩衰老、改善記憶力等作用[22]。同時(shí)根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)規(guī)定，阿魏酸、苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、毛蕊花糖苷分別為當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、白芍、熟地黃的質(zhì)量考察指標(biāo)性成分[23]。因此，本研究選擇上述優(yōu)化的條件進(jìn)行桃紅四物湯中6種發(fā)揮主要藥效的成分進(jìn)行含量測(cè)定。

注：A1、B1、C1在4.5～9 min時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)為403 nm，A2、B2、C2在4.5～9 min時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；1.羥基紅花黃色素A；2.苦杏仁苷；3.芍藥苷；4.阿魏酸；5.毛蕊花糖苷；6.藁本內(nèi)酯

圖1空白甲醇(A)、混合對(duì)照品(B)和桃紅四物湯樣品(C)的高效液相色譜圖

單一中藥的分析通常使用單波長(zhǎng)的檢測(cè)方法，因?yàn)橹饕獦?biāo)志成分通常只有一種或幾種化學(xué)成分，并且一般具有相似的紫外吸收波長(zhǎng)。然而，對(duì)于由幾種甚至多達(dá)十幾種中藥組成的傳統(tǒng)復(fù)方，單波長(zhǎng)定量分析可能是不夠的。以前對(duì)中藥復(fù)方的有效成分研究主要使用單一波長(zhǎng)檢測(cè)或者定量樣品中少數(shù)化合物。采用多波長(zhǎng)融合的方法更加適合對(duì)中藥傳統(tǒng)復(fù)方的質(zhì)量控制。參考《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)，羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷的最大吸收波長(zhǎng)分別是403、210、230、316、334 nm[23]。藁本內(nèi)酯的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm和328 nm[24-25]?；诙O管陣列檢測(cè)器的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，根據(jù)檢測(cè)成分的保留時(shí)間和吸收曲線，最終確定了283、403、210、230、328 nm共5種波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，并選用乙酸銨-乙酸緩沖溶液作為離子調(diào)節(jié)劑，改善峰形，提高分離度。

本研究采用UPLC-DAD建立同時(shí)測(cè)定桃紅四物湯中6種指標(biāo)成分含量的方法，具有重復(fù)性好、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果表明該方法適用于控制桃紅四物湯復(fù)方的整體質(zhì)量，為完善和豐富桃紅四物湯復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。