免疫酶吸附法評(píng)價(jià)納米金對(duì)抗體Fc端的吸附效果

湯俊琪, 龐廣昌, 高嘉榮, 梁新義

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津商業(yè)大學(xué),天津300134)

近年來,納米粒子以其獨(dú)特的物理、化學(xué)、光學(xué)性能被廣泛的用于生物測定分析中[1-4]。納米金溶膠又叫膠體金,因其具有很高的比表面效應(yīng)和較強(qiáng)的吸附能力,可與生物活性物質(zhì)結(jié)合作為追蹤標(biāo)記探針,早在1971年Faulk等就利用金溶膠顆粒作為標(biāo)記物用于免疫電鏡技術(shù)[5-6]。對(duì)于膠體金和抗體等生物物質(zhì)的結(jié)合,人們普遍認(rèn)為是膠體金表面負(fù)電荷和抗體等高分子的正電荷基團(tuán)因靜電作用而吸附,并形成Au-S等穩(wěn)定化學(xué)鍵而形成了牢固結(jié)合[7-9]?？贵w等生物分子具有特定的功能區(qū),如抗體Fc端不能識(shí)別其對(duì)應(yīng)抗原,只有其 Fab端才具有識(shí)別抗原并與其相結(jié)合的能力,這樣才可發(fā)揮抗體的特定作用[10]。為最大限度的保留抗體的生物活性,對(duì)抗體的固定吸附等修飾只能在Fc端進(jìn)行。所以明確納米金和抗體 Fc端的吸附情況至關(guān)重要,對(duì)于這方面的研究,目前尚未見報(bào)道。

作者利用常見的酶免疫吸附法,研究了以微波制作的納米金和抗體的吸附情況。納米金不僅能與抗體結(jié)合,而且可通過離心形成沉淀。因此,在納米金吸附IgG的溶液中加入酶標(biāo)羊抗兔 IgG的二抗,然后離心,可將納米粒子/兔IgG/酶標(biāo)羊抗兔IgG復(fù)合物從溶液中分離。則清液中的物質(zhì)為未和兔IgG結(jié)合并保留下來的酶標(biāo)抗體,加入底物顯色液,就可正常顯色。如果同時(shí)以同濃度的兔IgG溶液和酶標(biāo)羊抗兔 IgG反應(yīng),加入底物顯色液,顯色后測定其OD值,通過兩次OD值得對(duì)比,可得到納米金對(duì)兔IgG即納米金對(duì)抗體 Fc端的吸附率,實(shí)驗(yàn)過程見圖1。

圖1 簡明實(shí)驗(yàn)過程圖Fig.1 Schematic illustration of the stepwise experiment process

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-2501紫外可見分光光度計(jì):日本島津公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機(jī):SIGMA公司產(chǎn)品;超聲洗滌儀:昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品;電熱恒溫水浴器:上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀:Thermo公司產(chǎn)品。

兔IgG(10 mg/mL);HRP-羊抗兔抗體(1:500～1000);牛血清白蛋白:BSA;氯金酸:天津科密歐公司產(chǎn)品;硼酸鹽緩沖液(p H=9.0);質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的NaCl溶液;0.1 mol/L的 K2CO3;2 mol/L的H2SO4;0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液(p H=7.4);鄰苯二胺(OPD)溶液(10 mg OPD溶于 50 mL p H=5.0底物緩沖液中,再加雙蒸水至100 mL);所有試劑都為分析純,購買后未進(jìn)行再純化處理,整個(gè)過程都使用雙蒸水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 納米金溶膠的制備 納米金溶膠由質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的HAuCl4溶液和檸檬酸三鈉溶液在微波爐中還原獲得[11]。錐形瓶在酸缸浸泡過夜(濃硫酸、重鉻酸鉀混合液)、超聲洗滌后,再用雙蒸水洗滌3次。稱取0.01g氯化金溶于100 mL的雙蒸水中得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的氯金酸溶液。該溶液在微波爐中先高檔沸騰2 min。迅速加入4 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%檸檬酸三鈉水溶液,再放入微波爐中中擋保持3 min,就可得到透明的橙紅色溶液,即為15 nm左右的膠體金。改變檸檬酸三鈉的用量可得到不同粒徑的膠體金。制備好的金膠溶液在4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 納米金對(duì)兔IgG的吸附 取5 mL納米金溶液,用0.1 mol/L的 K2CO3溶液調(diào)節(jié)納米金液的p H值。由于在p H=9.0時(shí),納米金和IgG結(jié)合最牢固最穩(wěn)定。加入20μL 10 mg/mL的兔 IgG,溫和混合2 h。再加入100μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的BSA溶液反應(yīng)30 min,在4℃下15 000 r/min離心20 min。小心移取上清液,紫紅色沉淀用1 mL 1%的BSA溶液溶解,搖勻后4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫反應(yīng)和吸附效果的測定 取100μL的納米金-兔IgG混合溶液,加入1 mL酶標(biāo)羊抗兔溶液(p H=7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋),37℃水浴反應(yīng)60 min。4 ℃左右15 000 r/min離心20 min,取上清液100μL加入100μL鄰苯二胺(OPD)底物溶液避光反應(yīng)10 min,加入50μL 2 mol/L的硫酸溶液中止反應(yīng),在酶標(biāo)儀中492 nm波長下測定O.D值。

對(duì)照實(shí)驗(yàn)中,將納米金表面的活性位點(diǎn)以BSA溶液完全封閉,然后加入兔 IgG溶液,從而獲得納米金-BSA,兔IgG混合溶液。同樣取100μL該混合溶液,加入酶標(biāo)抗體后以鄰苯二胺顯色,步驟同上?；蛘咧苯右酝?IgG溶液加入酶標(biāo)抗體后以鄰苯二胺顯色進(jìn)行測定,實(shí)驗(yàn)條件也完全同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米金溶液的表征

采用UV-2501紫外可見分光光度計(jì)測定雙蒸水稀釋2倍的納米金溶液,在400～700 nm波長范圍內(nèi)掃描,表征納米金溶液的特征吸收峰。圖1是該金膠溶液的吸收曲線,由圖可見,在519 nm左右有很強(qiáng)的吸收峰。光吸收性膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰,這個(gè)光吸收峰的波長(λmax)在510～550 nm范圍內(nèi),隨膠體金顆粒大小而變化。從而可知本研究制備的膠體金顆粒粒徑在15 nm左右[12]。

圖2 納米金溶液的掃描圖Fig.2 Spectral absorption curve of gold colloidal solution

2.2 納米金和兔IgG的最適反應(yīng)比例

納米金標(biāo)記 IgG的最佳p H值一般在9.0左右。將調(diào)好p H的膠體金,分裝8管(見圖3),每管1 mL。將IgG以0.005 mol/L p H=9.0硼酸鹽緩沖液稀釋為5～50μg/mL系列,分別取1 mL,加入到上述金膠溶液中(2～7號(hào)管),混勻。空白對(duì)照管(左1號(hào)管)只加1 mL緩沖液,空白對(duì)照管(右1號(hào)管)則加1 mL雙蒸水。5 min后,在上述各管中加入0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%NaCl溶液,混勻后靜置2 h,觀察結(jié)果?？梢钥闯?0～50μg/mL的抗體溶液能穩(wěn)定膠體金溶液,說明此質(zhì)量濃度下抗體膠體金比例合適。

圖3 納米金對(duì)不同濃度兔IgG的吸附Fig.3 Gold colloidal absorb rabbit IgG with different concentration

2.3 納米金吸附兔IgG的表征

分別取2 mL金標(biāo)抗體和納米金溶液,稀釋2倍后在分光光度計(jì)下以400～620 nm波長掃描,對(duì)比二者的掃描曲線(圖4),可以看出納米金溶液在518 nm處有最大的光吸收峰,而金標(biāo)抗體溶液的最大光吸收峰在526 nm,相同的稀釋倍數(shù)下,不僅金標(biāo)抗體的吸收峰值明顯降低,而且出現(xiàn)明顯的紅移現(xiàn)象。這表明抗體很好的吸附在納米金表面。

圖4 相同稀釋倍數(shù)的納米金和納米金-抗體溶液的光譜掃描圖Fig.4 Spectral absorption curve of gold colloidal solution and nano-gold labeledantibody solution with the same dilution times:a—Nano-Au,b—Nano-Au-IgG

如將納米金溶液稀釋4倍,則可更加明顯的看到納米金吸附抗體前后,納米金溶液的最大光吸收峰的紅移現(xiàn)象(圖4)。

圖5 納米金和納米金-抗體的光譜掃描圖Fig.5 Spectral absorption curve of gold colloidal solution and nano-gold labeledantibody solution with the different dilution times:a—Nano-Au,b—Nano-Au-IgG

2.4 納米金吸附兔IgG Fc端的效果測定

分別用 500、1 000、2 000、4 000、8 000、16 000倍的酶標(biāo)抗體稀溶液來測定膠體金對(duì)抗體的吸附效果,所測都是上清液的OD值。3種情形在不同稀釋倍數(shù)下的OD值如下表(表1)。

表1 不同稀釋倍數(shù)下的OD值Tab.1 OD of different dilution multiple HRP-labeled rabbit IgG

以O(shè)D值為縱坐標(biāo),酶標(biāo)抗體的不同稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo),結(jié)果見圖圖6。

圖6 不同稀釋倍數(shù)下對(duì)應(yīng)的OD值Fig.6 OD of different dilution multiple HRP-labeled rabbit IgG

獲得納米金對(duì)抗體的吸附效果,分別以納米金-BSA,兔IgG混合溶液和兔 IgG溶液作為對(duì)照進(jìn)行測定。研究中假定酶標(biāo)抗體對(duì)暴露的兔IgG的Fc端具有完全的吸附能力,在不同的實(shí)驗(yàn)條件下,納米金對(duì)兔IgG的 Fc端的吸附能力,就可通過對(duì)比而獲得。當(dāng)兔IgG加入到納米金溶液中后,則認(rèn)為納米金要么吸附在其Fc端,要么吸附在其Fab端。兔IgG的Fc端被納米金吸附后,就不能再和酶標(biāo)羊抗兔相結(jié)合,凡是 Fc端沒有被納米金結(jié)合的兔IgG則可以和酶標(biāo)羊抗兔抗體結(jié)合,發(fā)生這種結(jié)合后,經(jīng)過離心,必然導(dǎo)致酶標(biāo)抗體的量的減少。留在上清液中的酶標(biāo)抗體,通過加入酶的底物顯色可獲得其對(duì)應(yīng)的O.D值。如果兔 IgG的 Fc端完全被納米金結(jié)合,則經(jīng)過離心后酶標(biāo)抗體的量不會(huì)減少,那么可以用兔IgG作為對(duì)照,假定這種情況下,酶標(biāo)羊抗兔和兔 IgG的 Fc端結(jié)合率為100%。則可以推算出納米金和抗體吸附效果。兔IgG和酶標(biāo)羊抗兔反應(yīng)后,經(jīng)離心顯色后可以發(fā)現(xiàn)納米金確實(shí)對(duì)顯色存在一定的影響。為避免納米金對(duì)實(shí)驗(yàn)中顯色的影響,故以納米金-BSA,兔 IgG作為對(duì)照來推算這種效果(見表2)。

表2 納米金對(duì)抗體Fc端的吸附率Tab.2 Absorption effect of nano-gold to antibody Fc

3 結(jié) 語

作者應(yīng)用微波爐產(chǎn)生的微波來制作納米金溶膠,方法簡單而快速,并用簡單的光譜法證明了獲得的納米金的光吸收特征,且證明了該納米金粒子對(duì)抗體Fc端的吸附效果,說明納米金對(duì)抗體的吸附效果比較優(yōu)良,尤其對(duì)抗體 Fc端的吸附率非常的高,達(dá)到92%以上。該過程方法簡單,利用了離心分離和酶標(biāo)抗體的顯色能力,通過免疫酶吸附技術(shù)進(jìn)行測定,獲得了較理想的結(jié)果,盡管可能存在一定的誤差,但為以后應(yīng)用納米金對(duì)抗體進(jìn)行修飾或固定,尤其是免疫傳感器中定向固定抗體等具有一定的參考價(jià)值。

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