甘草提取物對(duì)氧化應(yīng)激損傷黑素細(xì)胞的影響

甘草提取物對(duì)氧化應(yīng)激損傷黑素細(xì)胞的影響

黎雯

(海南省皮膚性病防治中心皮膚外科，海南?？?70206)

摘要〔〕目的探討甘草提取物對(duì)體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。方法從正常人包皮分離培養(yǎng)黑素細(xì)胞，用甘草提取物處理培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，處于過氧化氫培養(yǎng)基中。結(jié)果過氧化氫組黑素細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)；甘草提取物組黑素細(xì)胞活力濃度依賴性地有所提高(P<0.05)。結(jié)論甘草提取物可抑制黑素細(xì)胞，控制氧化應(yīng)激反應(yīng)。

關(guān)鍵詞〔〕黑素細(xì)胞；甘草提取物

中圖分類號(hào)〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：黎雯(1974-)，女，主治醫(yī)師，主要從事變態(tài)反應(yīng)研究。

中醫(yī)認(rèn)為甘草，具有補(bǔ)脾益氣，祛痰止咳，緩急止痛，清熱解毒，調(diào)和諸藥的功效。西醫(yī)研究發(fā)現(xiàn)甘草具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、殺菌和美白的作用〔1〕。甘草的化學(xué)組成極為復(fù)雜，主要成分為甘草甜素和甘草次酸。近年來，研究發(fā)現(xiàn)甘草有抗氧化的作用，為進(jìn)一步研究甘草對(duì)人表皮黑素細(xì)胞的調(diào)控作用〔1〕。我們首先體外分離、培養(yǎng)人正常人表皮黑素細(xì)胞〔2〕，建立黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，并觀察黑素細(xì)胞增殖情況，以探討其可能的作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥品甘草提取物購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。使用前，先用DMSO溶解，配成母液(濃度100 g/L)，放置于-20℃冰箱低溫保存。實(shí)驗(yàn)過程中用新鮮培養(yǎng)基調(diào)至終濃度。

1.2主要試劑的配制M254培養(yǎng)基(美國(guó)Cascade公司)；MTS(美國(guó)Promega公司)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液(美國(guó)Gibco公司)；DMSO(美國(guó)Sigma公司)人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑HMGS(美國(guó)Cascade公司)；0.25% EDTA胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；Dispase分離酶(美國(guó)羅氏試劑公司)。

1.3細(xì)胞來源實(shí)驗(yàn)中所需細(xì)胞取至正常青年男性包皮術(shù)后留下的病理組織，實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)征求患者本人同意，同意后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，符合倫理學(xué)要求。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)中共設(shè)立5個(gè)分組，空白對(duì)照組為完全培養(yǎng)基，添加黑色素培養(yǎng)；過氧化氫組中為過氧化氫培養(yǎng)基，濃度保持在0.4 mmol/L；甘草提取物組中為甘草提取物培養(yǎng)基，保持濃度為10-8mol/L，每組在培養(yǎng)過程中保留復(fù)孔4個(gè)；實(shí)驗(yàn)組中再次分為3組，加入2.5 mg/L 5.0 mg/L及10.0 mg/L甘草提取液組，隨后將3個(gè)甘草提取物組分別添加至過氧化氫培養(yǎng)基，培養(yǎng)基濃度保持在0.4 mmol/L。

1.4.2分離人表皮黑素細(xì)胞首先將正常青少年男性包皮組織置于75%的酒精溶液中浸泡約10 min，然后用PBS緩沖液沖洗包皮組織6～10遍〔3〕；再使用眼科剪剔除組織皮下脂肪組織，并再次用PBS液沖洗5～6次。將組織剪1.5 mm×1.5 mm的方形組織塊，平鋪在培養(yǎng)皿中(真皮朝向培養(yǎng)皿底部)；組織中加入Dispase分離酶3～5 ml，放入4℃冰箱中16 h，后轉(zhuǎn)移入恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h；用眼科剪剔除真皮，留下表皮。使用PBS沖洗組織2～3次，室溫下0.25%胰蛋白酶消化5 min，隨后加入10% FBS終止消化，吹打組織，制成黑素細(xì)胞懸液，隨后用200目細(xì)胞篩過濾，并低速離心(1 200 r/min)3 min，隨后記錄細(xì)胞數(shù)量，在無菌培養(yǎng)瓶中，濃度保持在5×104/ml左右，培養(yǎng)瓶中均加入4 ml M254，處于二氧化碳的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)，溫度保持在37℃左右。培養(yǎng)2 d，更換培養(yǎng)液，以后每隔2～3 d換液1次，方法同文獻(xiàn)〔3〕。

1.4.3人表皮黑素細(xì)胞的鑒定(L-DOPA染色法)取第三代人表皮黑素細(xì)胞，與1 ml的胰蛋白酶充分混合，濃度為0.25%。暫停消化過程，使黑素細(xì)胞保持在1×104/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中，然后置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。隨后加入已預(yù)熱至37℃的4%多聚甲醛固定細(xì)胞25 min，然后雙蒸水洗3次。將細(xì)胞蓋玻片置于L-DOPA染色液中，嚴(yán)格檢測(cè)染色情況，每半小時(shí)檢測(cè)一次，3 h染色完成，得到棕色樣品，進(jìn)行漂洗脫水處理，封裝成片。

1.4.4建立人表皮黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型在黑素細(xì)胞停留在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期，取出樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用PBS液進(jìn)行清洗，待清洗干凈后，與1 ml胰蛋白酶均勻混合，胰蛋白酶濃度為0.25%為宜，將混合液置于常溫中3 min，取混合液中懸液，使?jié)舛缺３衷?.5×105/ml，取96孔培養(yǎng)板，于上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)，37℃恒溫狀態(tài)。在5%CO2的環(huán)境中進(jìn)行24 h的培養(yǎng)，觀察細(xì)胞均附于細(xì)胞壁上后，將其與培養(yǎng)基分離，從復(fù)孔中對(duì)甘草提取物組中添加不同濃度的甘草提取物(2.5、5.0、10.0 mg/L)100 μl。其余組僅予以完全培養(yǎng)基環(huán)境，在恒溫二氧化碳的條件下進(jìn)行培養(yǎng)24 h，對(duì)黑素細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變做出記錄比較，進(jìn)行染色，原環(huán)境下延續(xù)4 h培養(yǎng)結(jié)束。MTS法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1人表皮黑素細(xì)胞鑒定結(jié)果(L-DOPA染色法)染色后，可見樣本呈黑色或棕褐色，說明反應(yīng)呈陽(yáng)性，驗(yàn)證為黑素細(xì)胞。見圖1。

2.2甘草提取物對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)下人表皮黑素細(xì)胞活力的影響(MTS法)過氧化氫組的黑素細(xì)胞活力降低顯著較空白對(duì)照組明顯降低〔(44.348±1.052)% vs (97.775±0.445)%，P<0.05〕，2.5、5.0、10、0 mg/L甘草提取物分別提高一定程度的黑素細(xì)胞活力〔(45.079±1.380)%、(47.891±1.466)%、(57.496±2.419)%，P<0.05〕，但仍低于空白對(duì)照組(P<0.05)。

圖1　L-DOPA染色陽(yáng)性人表皮黑素細(xì)胞(×200)

3討論

甘草的化學(xué)組成極為復(fù)雜，目前為止從甘草中分離出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、異甘草甙、新甘草甙等數(shù)十種化合物，但其中的主要成分為甘草甜素和甘草次酸。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，甘草味甘，性平，具有解毒清熱，補(bǔ)氣健脾的功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，甘草可對(duì)咳嗽、口腔潰瘍和胃潰瘍有明顯的治療作用。近來有研究發(fā)現(xiàn)甘草有抑制黑素細(xì)胞酪氨酸酶和黑素瘤細(xì)胞黑素合成的作用。黑素細(xì)胞由神經(jīng)嵴發(fā)出，共經(jīng)過3發(fā)育階段成型。胚胎發(fā)育期，在家族整合素的影響下，所有細(xì)胞均處在遷徙過程中，胚胎細(xì)胞在次過程中可直接發(fā)育成黑素細(xì)胞，并自動(dòng)找尋生長(zhǎng)位置〔4〕。生活中，一些皮膚炎癥可造成黑素細(xì)胞大量沉積，從而導(dǎo)致曬傷和雀斑等〔5〕。黑素細(xì)胞的集聚和遷徙，與炎癥的消退、切口的愈合和腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散有直接聯(lián)系，對(duì)患者病情的發(fā)展產(chǎn)生直接的影響〔6〕。

氧化應(yīng)激反應(yīng)在適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度下可對(duì)機(jī)體有促進(jìn)作用，若超過適當(dāng)?shù)姆秶l(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，則可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞大量死亡，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的額損傷?；钚匝?ROS)可評(píng)定機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激程度。過氧化氫可提高ROS，當(dāng)機(jī)體內(nèi)的ROS量較高時(shí)，則認(rèn)為大量細(xì)胞與蛋白質(zhì)超負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)而死亡。本研究發(fā)現(xiàn)甘草提取物一定程度上劑量依賴性提高黑素細(xì)胞的活力，我們將在今后的試驗(yàn)中擴(kuò)大甘草提取物濃度范圍，以全面、系統(tǒng)地分析其對(duì)黑素細(xì)胞調(diào)控作用。Liu等〔7〕通過實(shí)驗(yàn)探究保護(hù)黑素細(xì)胞的過程中發(fā)現(xiàn)，若使用黃芩黃素對(duì)黑素細(xì)胞處理后，進(jìn)行過氧化氫處理，隨后觀察ROS，發(fā)現(xiàn)ROS水平普遍升高，且黃芩黃素的濃度越高，ROS水平越低，對(duì)我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行了充分驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)說明，甘草提取物可提高機(jī)體內(nèi)的ROS，對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞的死亡情況。由此可猜測(cè)甘草提取物是一種機(jī)體自身產(chǎn)生的保護(hù)氧化應(yīng)激反應(yīng)的物質(zhì)。但目前對(duì)反應(yīng)機(jī)制以及過程未能了解清楚，希望以后可進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，探究甘草提取物的作用機(jī)制以及調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)的原理，為化妝品及藥物的研發(fā)提供更多的理論依據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-12-18修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)