布拉酵母菌生物量及高海藻糖含量積累條件的優(yōu)化

王子輝 楚 杰 王君高 劉可春

布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)是在印尼荔枝中分離得到的一種適溫的、非毒性酵母菌,是釀酒酵母的亞種,曾被廣泛應用于人類抗擊腹瀉的藥物中，它能很有效的治療腸道的各種炎癥，在治療腸炎和細菌引起的腹瀉方面療效十分顯著。其制劑應用于畜牧業(yè),可有效降低病原菌和其毒素的濃度,并能加強微生態(tài)平衡,刺激免疫系統(tǒng),作為飼料添加劑的應用已得到包括中國、歐盟在內(nèi)的世界上許多國家的認可。最新研究結果表明,布拉酵母菌還能抑制大腸桿菌內(nèi)毒素的毒性作用,降低腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量,有望用于防治雞大腸桿菌病;布拉酵母菌作為一種新型微生態(tài)制劑,在畜牧業(yè)中必將有廣闊的應用前景。但在布拉酵母菌的研究中，我們發(fā)現(xiàn)其抗逆性能力差，在后期制備活菌制劑過程中，死亡率較高，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖對其有神奇的保護作用。

海藻糖是一種非還原性的二糖,廣泛的存在于酵母菌、真菌、動植物體內(nèi),可以非常有效地保護生物膜和生物大分子,從而避免細胞受到干燥、冷凍和滲透壓巨變造成的傷害,具有“生命之糖”的稱號。酵母細胞內(nèi)海藻糖的含量是由合成和分解的平衡調(diào)節(jié)決定,這種平衡調(diào)節(jié)隨著生長周期、營養(yǎng)和環(huán)境條件而發(fā)生變化。本試驗通過培養(yǎng)基成分對布拉酵母菌生物量及海藻糖積累的影響，確定其最佳用量以提高布拉酵母菌生物量及海藻糖的含量，從而提高布拉酵母菌的成活率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料

布拉酵母菌（本實驗室保藏）、三氯乙酸、36%鹽酸、乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、尿素、酵母膏、蛋白胨、檸檬酸三銨、磷酸氫二銨、蛋白胨、瓊脂粉、玉米漿等。

1.1.2 主要儀器

SBA-40C型葡萄糖生物傳感器（山東省科學院生物研究所研制）、超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、水浴鍋、搖床、烘箱。

1.1.3 種子培養(yǎng)

以7%的葡萄糖為碳源，0.7%的磷酸氫二銨為氮源，1.0%的玉米漿為生長因子，0.2%的磷酸二氫鉀為無機鹽配制種子培養(yǎng)基，500 ml三角瓶裝量100 ml，滅菌后無菌條件下挑取三環(huán)布拉酵母菌種接入種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)16 h備用。

1.1.4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基同1.1.3節(jié)，將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種于發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h。

1.1.5 生物量的測定

將1.1.4節(jié)中發(fā)酵液5000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌兩遍，稱重。

1.1.6 布拉酵母菌海藻糖提取及含量測定方法

以5%的三氯乙酸做提取劑，超聲破碎10 min后100℃水浴30 min得上清液。然后將提取液用5%鹽酸在100℃下水解5 h，用生物傳感器測定葡萄糖含量，得海藻糖含量。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基成分對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

1.2.1.1 碳源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個500 ml的三角瓶，分別以7%的乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖為碳源，其余同1.1.3配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個三角瓶中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.1.2 碳源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個500 ml的三角瓶，分別以7%、10%、12%、15%的葡萄糖為碳源，其余同1.1.3節(jié)配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個三角瓶中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.1.3 氮源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個500 ml的三角瓶，分別以0.7%的檸檬酸三銨、尿素、酵母膏、磷酸氫二銨為氮源，其余同1.1.3節(jié)，配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個三角瓶中，培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.1.4 氮源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個500 ml的三角瓶，分別以0.5%、0.7%、1.0%、1.2%的檸檬酸三銨為氮源，其余同1.1.3節(jié)配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個三角瓶中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.4節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.1.5 玉米漿含量對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個500 ml的三角瓶，分別以0.7%的檸檬酸三銨為氮源，1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的玉米漿為生長因子，其余同1.1.3節(jié)配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個三角瓶中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.1.6 磷酸氫二鉀濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

取4個500 ml的三角瓶，分別以 0.1%、0.2%、0.3%、0.5%的磷酸二氫鉀為無機鹽，其余同1.1.3配制液體培養(yǎng)基150 ml，滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入4個三角瓶中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

1.2.2 正交試驗

分別以葡萄糖、檸檬酸三銨、玉米漿、磷酸二氫鉀為因素，每個因素設置3個水平，以海藻糖和菌體生物量為考察指標，進行L9(34)正交試驗（見表1），根據(jù)試驗結果優(yōu)化布拉酵母菌細胞內(nèi)海藻糖富集和菌體生長的培養(yǎng)基。

表1 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗因素與水平（%）

1.2.3 優(yōu)化前后布拉酵母菌生物量及海藻糖含量的比較試驗

取12個500 ml的三角瓶，其中6個按葡萄糖7%、磷酸氫二銨0.7%、玉米漿1.0%、磷酸二氫鉀0.2%配制液體培養(yǎng)基，每瓶150 ml；另外6個按葡萄糖10%、檸檬酸三銨0.7%、玉米漿1.5%、磷酸二氫鉀0.2%配制液體培養(yǎng)基，每瓶150 ml；滅菌后將1.1.3節(jié)中培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入各三角瓶中，30 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，分別在 14、16、18、20、22、24 h取樣，按1.1.5節(jié)及1.1.6節(jié)方法測定生物量及海藻糖含量。

2 結果與討論

2.1 培養(yǎng)基成分對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

2.1.1 碳源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖1）

圖1 碳源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

由圖1可以看出，乳糖和麥芽糖為碳源時，布拉酵母菌的生物量不高，雖然測定所得的海藻糖含量比較高，但因發(fā)酵過程中乳糖和麥芽糖先通過滲透作用進入布拉酵母細胞內(nèi)，有部分還沒有被菌體利用，而乳糖和麥芽糖都含有一分子的葡萄糖，測定過程中不能排除是酵母細胞中未洗凈的殘留糖類干攏；而蔗糖和葡萄糖為碳源時比較利于布拉酵母菌生物量的增長，但蔗糖所培養(yǎng)的酵母中海藻糖含量較低，且成本較高，研究表明，海藻糖是由UDP-葡萄糖和6－P-葡萄糖兩步反應形成，因此，葡萄糖是海藻糖合成的最初底物，且葡萄糖價格低廉，故后續(xù)試驗中選擇葡萄糖做碳源。

2.1.2 碳源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖2）

由圖2可以看出，布拉酵母菌體內(nèi)的海藻糖含量隨著葡萄糖濃度的增加而升高，生物量及海藻糖含量在葡萄糖濃度為10%時達到最大，并隨濃度的增加而趨平緩，仔細觀察圖的走向可以看出葡萄糖濃度由10%增加為15%時，生物量及海藻糖含量基本維持在相對平衡的水平，故培養(yǎng)基中葡萄糖濃度選定在10%。

圖2 碳源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

2.1.3 氮源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖3）

圖3 氮源對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

由圖3可以看出，檸檬酸三銨和酵母膏為氮源時，比較適合布拉酵母菌生物量的增長，二者生物量相差無幾，但檸檬酸三銨為氮源時所得酵母中海藻糖含量明顯高于酵母膏為氮源時的含量，并且檸檬酸三銨價格便宜，比較有益于工業(yè)生產(chǎn)，故后續(xù)試驗中選檸檬酸三銨作為氮源。

2.1.4 氮源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖4）

圖4 氮源濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

由圖4可以看出，檸檬酸三銨濃度為0.70%時所得布拉酵母菌的生物量最大，且海藻糖含量較高，故后續(xù)試驗中，培養(yǎng)基中氮源濃度選擇在0.70%。

2.1.5 玉米漿濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖5）

圖5 玉米漿濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

由圖5可以看出，在玉米漿濃度為1.5%時比較適合布拉酵母菌海藻糖的積累，生物量雖不是最高，但也和最大值相差甚微，故在后續(xù)試驗中玉米漿的濃度選擇在1.5%～2.0%。

2.1.6 磷酸氫二鉀濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響（見圖6）

圖6 磷酸氫二鉀濃度對布拉酵母菌生物量及海藻糖含量積累的影響

由圖6可以看出，在磷酸二氫鉀濃度為0.20%時,既比較適合布拉酵母菌生物量的增長，同時酵母中海藻糖含量相比其它幾個濃度也達到最高，故本試驗無機鹽磷酸二氫鉀的濃度選擇在0.20%。

2.2 正交試驗

由表2可以看出,葡萄糖、檸檬酸三銨、玉米漿、磷酸二氫鉀對菌體生物量積累的影響主次為：葡萄糖＞檸檬酸三銨＞磷酸二氫鉀＞玉米漿；對海藻糖積累的影響主次為：葡萄糖＞玉米漿＞磷酸二氫鉀＞檸檬酸三銨,綜合兩個指標可得出最佳的條件組合為A2B2C1D2,即10%的葡萄糖、0.7%的檸檬酸三銨、1.5%的玉米漿、0.2%的磷酸氫二鉀。

表2 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗結果

2.3 優(yōu)化前后布拉酵母菌生物量及海藻糖含量的比較試驗（見圖 7、圖 8）

圖7 培養(yǎng)基優(yōu)化前后菌體質量對比

圖8 培養(yǎng)基優(yōu)化前后海藻糖含量對比

由圖7、8可以看出，優(yōu)化后的培養(yǎng)基無論在生物量增長，還是海藻糖含量的積累都明顯優(yōu)于優(yōu)化之前培養(yǎng)基，分別提高 34%（優(yōu)化前：6.2 g；優(yōu)化后：8.3 g）和 30%（優(yōu)化前：43.5 mg/dl；優(yōu)化后：56.6 mg/dl）。并且18 h是布拉酵母菌生物量及海藻糖含量的最佳積累點。

3 結論

3.1 本試驗通過培養(yǎng)基成分對布拉酵母菌菌體中海藻糖積累和布拉酵母菌生物量的影響，摸索出既利于菌體生長，又利于菌體中海藻糖積累的培養(yǎng)基配方：10%的葡萄糖、0.70%的檸檬酸三銨、1.5%的玉米漿、0.20%的磷酸氫二鉀。優(yōu)化后的培養(yǎng)基布拉酵母菌的生物量比優(yōu)化前提高了約34%，菌體中海藻糖含量比優(yōu)化前提高了約30%。

3.2 由于布拉酵母菌制劑應用于畜牧業(yè),可有效降低病原菌含量和其毒素的濃度，并能加強微生態(tài)平衡,刺激免疫系統(tǒng)，故其菌體作為飼料添加劑，必將有廣闊的應用前景，且優(yōu)化后培養(yǎng)基配方中的碳源、氮源等價格都比較低廉，故此培養(yǎng)基用于工業(yè)生產(chǎn)布拉酵母菌活菌制劑，不僅能節(jié)約成本，而且能提高產(chǎn)品產(chǎn)量。優(yōu)化后的培養(yǎng)基在布拉酵母菌海藻糖積累方面有一定增加，對布拉酵母菌后期制備過程中有一定的保護作用。

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