沙蔥多糖對S180腹水瘤小鼠抗腫瘤和免疫作用的實(shí)驗(yàn)研究

扈瑞平 張興夫 杜 玲 敖長金 巴德瑪 鄧 鳳

沙蔥(Allium mongolicum Regel)屬被子植物門(Angiospermae)百合科(LiLiaceae)蔥屬(Allium)，學(xué)名蒙古韭（包穎，2000），是蒙古族傳統(tǒng)的野生食用植物，也是內(nèi)蒙古草原生長量大且為牲畜喜食的牧草。沙蔥營養(yǎng)豐富，地上部分可入蒙藥，據(jù)蒙藥典記載，沙蔥具有降血壓、降血脂、開胃消食、健腎壯陽、治便秘等特殊功效，被譽(yù)為“菜中靈芝”（燕玲，1999）。研究表明，沙蔥能顯著提高動物的免疫能力，但由于沙蔥中含有多種有效成分,起免疫作用的究竟為何種成分及其免疫作用機(jī)理尚不清楚。近年來，植物活性多糖的研究備受關(guān)注。許多研究表明，多糖具有促進(jìn)機(jī)體免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、抗炎、降低血脂以及改善動物生產(chǎn)性能等一系列作用，但其主要作用表現(xiàn)為抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)（陳芝蕓，2003）。實(shí)驗(yàn)證明，飼料中添加活性多糖能顯著提高畜禽免疫功能，促進(jìn)免疫器官發(fā)育，抗體生成，激活淋巴細(xì)胞，促進(jìn)動物生長，降低動物死亡率,因此，植物活性多糖是一種很有前途的可以替代抗生素的天然綠色飼料添加劑。我們充分利用植物資源沙蔥，對其活性成分多糖進(jìn)行分離并研究對S180腹水瘤小鼠腫瘤的抑制作用和對免疫器官、免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，以初步探討沙蔥多糖的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，為開發(fā)新型、高效、安全的飼料添加劑或藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)材料

鮮沙蔥采自于內(nèi)蒙古鄂爾多斯鄂托克旗天然草場。

1.2 試驗(yàn)動物與瘤株

健康昆明種小鼠，體重（20±2）g，雌雄各半，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，飼喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。小鼠S180細(xì)胞瘤株購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.3 主要試劑與儀器

環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號 20080902），小鼠 IL－2、TNF－α 測定試劑盒(ADL公司生產(chǎn))，其它試劑均為分析純；電子天平(上海精儀公司生產(chǎn)，型號FA1004N)、低溫冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康公司生產(chǎn)，型號 FD－1A－50)、高速冷凍離心機(jī)(美國杜邦公司生產(chǎn)，型號ST－21)、連續(xù)波長酶標(biāo)儀(Bio－RAD 公司生產(chǎn)，型號 Bench－markPlusTM)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司生產(chǎn)，型號5410)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 沙蔥多糖的制備

將烘干后的沙蔥用98%的工業(yè)酒精按1：8(烘干沙蔥： 酒精)的比例70℃脫脂1次，65℃烘干后按25：1的水料比80℃浸提8 h，抽濾棄去殘?jiān)蟮亩嗵翘崛∫航?jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到原體積的1/3，經(jīng)8%的三氯乙酸除蛋白1次，離心除去蛋白沉淀，上清液加等體積無水乙醇于4℃過夜，7800×g離心30 min得沙蔥多糖，采用苯酚－硫酸法測定多糖含量為87.23%，冷凍干燥后稱重備用。實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配置成沙蔥多糖高劑量組（6.25 mg/ml）溶液，中、低劑量組按比例稀釋。

2.2 造模方法

抽取已接種7～8 d S180腹水瘤小鼠的腹水與生理鹽水按1：2的比例進(jìn)行稀釋,臺盼藍(lán)染色后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),活細(xì)胞率＞95%，稀釋細(xì)胞懸液使活細(xì)胞數(shù)達(dá)到（2～4）×107個(gè)/ml，無菌條件下,按常規(guī)每只鼠腹腔接種0.2 ml細(xì)胞懸液,制成腹水瘤模型（李巧蘭，2007）。

2.3 試驗(yàn)動物分組及給藥

于接種當(dāng)天將小鼠隨機(jī)分為2大組（標(biāo)記為A、B組）。

A組為觀察組，共50只，每組10只。分別標(biāo)記為模型組、CTX組（20 mg/ml）、沙蔥多糖高劑量組（6.25 mg/ml）、沙蔥多糖中劑量組（0.625 mg/ml）、沙蔥多糖低劑量組（0.0625 mg/ml）。

B組為屠宰組，共60只，每組10只。分別標(biāo)記為正常對照組、模型組、CTX組、沙蔥多糖高劑量組、沙蔥多糖中劑量組、沙蔥多糖低劑量組。

沙蔥多糖高、中、低劑量組于接種8 h后開始灌胃給藥治療，每天早晚各1次，每次1 ml。CTX組于接種當(dāng)天皮下肌肉注射治療環(huán)磷酰胺，給藥量為0.15ml/只小鼠，每4 d給藥1次。模型組和正常對照組不給予藥物治療。

2.4 小鼠生存質(zhì)量、腹水形成和生存時(shí)間觀察

每天定時(shí)稱量A組小鼠的體重(g)和腹圍(cm),同時(shí)觀察小鼠腹水的形成、飲食活動、精神狀況，記錄死亡時(shí)間，計(jì)算體重比、腹圍比和生命延長率（李巧蘭，2007）。

生命延長率（%）=（試驗(yàn)組生存天數(shù)－對照組生存天數(shù)）/對照組生存天數(shù)×100。

2.5 小鼠免疫臟器指數(shù)的測定

B組小鼠于試驗(yàn)7 d后，即第8 d早晨稱重后摘眼球取血 0.5～1 ml，3000 r/min離心5 min制備血清，－20℃保存后用于TNF－α和IL－2的含量測定，然后脫頸椎處死小鼠,分離胸腺、脾臟，并稱取其濕重，按下列公式計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)（沈關(guān)心，2002）。

免疫器官指數(shù)（mg/10 g）=小鼠免疫器官重量（mg）/小鼠屠體重(10 g)。

2.6 小鼠血清IL－2和TNF－α的測定

取50 μl/孔血清,每樣均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，測定采用雙抗體夾心ABC－ELISA法，操作步驟嚴(yán)格按照小鼠血清TNF－α和IL－2定量ELISA試劑盒使用說明書進(jìn)行。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中的單因素方差分析(One－wayANOVA)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X±s）表示，檢驗(yàn)水平 а=0.05,以 P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 沙蔥多糖對S180腹水瘤小鼠體重、腹圍和存活期的影響

模型組小鼠從接種第3 d起腹部便開始增大，至5 d左右腹部增大明顯，多糖治療組從接種第5 d起腹部才開始逐漸增大，且腹圍增加不顯著；與模型組相比，沙蔥多糖組小鼠在治療過程中活動、飲食及精神狀況良好，較晚（約8～9 d）出現(xiàn)貧血癥狀；CTX組小鼠厭食、脫毛、活動減少、精神狀況不佳，腹水較少或無腹水產(chǎn)生，結(jié)果見表1。

表1 沙蔥多糖對S180腹水瘤小鼠體重、腹圍和生存期的影響（X±s）

與模型組相比，CTX組和多糖治療組均能延長小鼠的存活期。除沙蔥多糖低劑量組外，S180腹水瘤小鼠經(jīng)治療后生命延長率均超過“抗癌藥體內(nèi)藥效試驗(yàn)規(guī)程”限定的30%的標(biāo)準(zhǔn)（肖洪彬，2007）。沙蔥多糖低劑量組小鼠的存活期與模型組相比差異不顯著（P＞0.05），其它各組小鼠的存活期與模型組相比均有顯著或極顯著性差異（P＜0.05、P＜0.01），其中以沙蔥多糖高劑量組作用效果最為明顯（P＜0.01），且多糖治療組對小鼠存活期的影響表現(xiàn)出在一定濃度范圍內(nèi)的劑量依賴關(guān)系。

3.2 沙蔥多糖對小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響（見表2）

表2 沙蔥多糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響（X±s）

由表2可見，與模型組相比，CTX組對S180腹水瘤小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響不顯著（P＞0.05），不同劑量沙蔥多糖組均能顯著或極顯著提高S180腹水瘤小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)（P＜0.05、P＜0.01）；與正常對照組相比，CTX組小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)均明顯降低，且有顯著性差異（P＜0.05），沙蔥多糖高劑量組促進(jìn)S180腹水瘤小鼠胸腺、脾臟指數(shù)增長的效果最為明顯，且差異極顯著（P＜0.01）。

3.3 沙蔥多糖對S180腹水瘤小鼠血清IL－2和TNF－α的影響（見表3）

表3 沙蔥多糖對S180腹水瘤小鼠血清IL－2和TNF－α 水平的影響（X±s）

表3結(jié)果表明：模型組小鼠血清的IL－2和TNF－α水平均較正常對照組下降，但差異不顯著（P＞0.05），CTX組與正常對照組和模型組相比，小鼠血清中IL－2的含量明顯下降，且有顯著性差異（P＜0.05），小鼠血清TNF－α的水平也有所降低，但差異均不顯著（P＞0.05）。這說明模型組小鼠由于患腹水瘤，其細(xì)胞免疫功能有所下降，環(huán)磷酰胺雖可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但同時(shí)會引起機(jī)體免疫抑制，這與李潔關(guān)于半枝蓮對S180腫瘤小鼠抑瘤作用中的研究結(jié)果相符（李潔，2008）。

經(jīng)不同劑量沙蔥多糖治療后的S180腹水瘤小鼠血清IL－2和TNF－α水平上升，與模型組比較，均有顯著性差異（P＜0.05、P＜0.01）；與正常對照組相比較，除沙蔥多糖低劑量組對血清IL－2的含量影響無顯著差異外（P＞0.05），其余各多糖組均能顯著提高S180腹水瘤小鼠血清 IL－2和 TNF－α 的含量（P＜0.05、P＜0.01），以沙蔥多糖高劑量組促進(jìn)S180腹水瘤小鼠免疫細(xì)胞分泌同時(shí)兩種細(xì)胞因子的效果最為明顯（P＜0.01），另外，不同劑量沙蔥多糖組與模型組、正常對照組相比，小鼠血清TNF－α的含量均有極顯著差異（P＜0.01）。

4 討論

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),沙蔥多糖組S180腹水瘤小鼠的生活狀況明顯好于與模型組和CTX組，表明沙蔥多糖組可以改善S180腹水瘤小鼠的生存狀態(tài)，提高生存質(zhì)量，抑制腹水的形成，提高腫瘤小鼠的存活率。尤其以沙蔥多糖高濃度組效果最為顯著;此外在解剖剝離瘤塊時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的瘤塊明顯增大,界限不清、質(zhì)地柔軟,不易剝離，有的浸潤到肝臟和脾臟，但沙蔥多糖組和環(huán)磷酰胺組瘤塊體積較小,界限清晰,質(zhì)地較硬易剝離;小鼠腹水瘤形成后出現(xiàn)免疫器官指數(shù)的異常,表現(xiàn)為脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)均降低。胸腺和脾臟分別是機(jī)體主要的中樞免疫器官和外周免疫器官,它們能從一定程度上表達(dá)免疫功能的狀況。胸腺、脾臟指數(shù)的大小直接反映機(jī)體免疫水平的高低。環(huán)磷酰胺組小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)明顯降低,表明小鼠免疫功能受到抑制，尤其是細(xì)胞免疫嚴(yán)重抑制,導(dǎo)致環(huán)磷酰胺組小鼠生存狀況下降;然而沙蔥多糖組小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)比環(huán)磷酰胺組和模型組小鼠明顯提高,表明沙蔥多糖能通過促進(jìn)腹水瘤小鼠免疫器官的生長發(fā)育而增強(qiáng)其免疫功能。

機(jī)體的免疫功能包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩方面，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，尤其是細(xì)胞免疫在腫瘤清除中起主導(dǎo)作用。已知腫瘤能誘發(fā)產(chǎn)生抑制性T細(xì)胞和抑制性巨噬細(xì)胞,它們能抑制淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL－2，促進(jìn)腫瘤生長。IL－2活性在一定程度上反映了機(jī)體的免疫監(jiān)視功能。其主要生物活性是促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖，促進(jìn)B細(xì)胞分化和增殖,促進(jìn)抗體生成等。因此IL－2在抗腫瘤免疫中具有重要作用。IL－2也是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)因子,對多種免疫活性細(xì)胞均具有陽性促進(jìn)作用,如IL－2誘導(dǎo)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)的分化,誘生淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK細(xì)胞)，CTL和LAK細(xì)胞皆是重要的殺瘤細(xì)胞。TNF－α是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子,主要來源于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞在一定條件下也能產(chǎn)生。TNF－α能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,可以參與抵抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲的感染,可以誘導(dǎo)細(xì)胞分化和促進(jìn)單核細(xì)胞或T細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子。我們的整體實(shí)驗(yàn)也證明了沙蔥多糖在抑制小鼠腹水瘤形成的同時(shí)可以提高小鼠血清中IL－2和TNF－α水平，結(jié)果顯示，沙蔥多糖的抑瘤效應(yīng)與恢復(fù)和增強(qiáng)腹水瘤小鼠機(jī)體細(xì)胞的免疫功能及分泌IL－2和TNF－α有關(guān)。由于腫瘤目前最常用的治療方法——放射治療和化學(xué)治療都存在著抑制機(jī)體免疫功能等嚴(yán)重的副作用,而沙蔥多糖所具有的增強(qiáng)免疫活性的作用,將使其在腫瘤的治療中顯現(xiàn)好的前景。

5 結(jié)論

沙蔥多糖能有效地抑制S180腹水瘤小鼠腹水的形成，延長其存活期，并通過促進(jìn)免疫器官的生長發(fā)育和小鼠免疫細(xì)胞分泌IL－2、TNF－α而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能和抗腫瘤作用。