噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)變異鏈球菌、血鏈球菌、伴放線菌嗜血菌的研究

王忠朝 范麗苑 蔣俊強(qiáng) 蔡煒 丁一

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔內(nèi)科；2.修復(fù)科，四川 瀘州 646000；3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 牙周病科，四川 成都 610041）

噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)變異鏈球菌、血鏈球菌、伴放線菌嗜血菌的研究

王忠朝1范麗苑2蔣俊強(qiáng)1蔡煒1丁一3

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔內(nèi)科；2.修復(fù)科，四川 瀘州 646000；3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 牙周病科，四川 成都 610041）

目的 探討噻唑藍(lán)（MTT）法用于口腔常見(jiàn)細(xì)菌（變異鏈球菌、血鏈球菌、伴放線菌嗜血菌）活菌計(jì)數(shù)的可行性及具體應(yīng)用過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)條件。方法 本實(shí)驗(yàn)以菌落形成單位（CFU）法為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變比色的波長(zhǎng)、反應(yīng)時(shí)間、試劑劑量、細(xì)菌菌齡等實(shí)驗(yàn)條件，獲得MTT法測(cè)量常見(jiàn)口腔細(xì)菌的一系列參數(shù)，對(duì)變異鏈球菌、血鏈球菌、伴放線菌嗜血菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并與CFU法所測(cè)的細(xì)菌數(shù)量相比較。結(jié)果 MTT法在測(cè)量變異鏈球菌時(shí)，最佳的檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm，最佳的測(cè)定細(xì)菌范圍是1.5×105～1.0×107CFU·mL-1。MTT法在測(cè)量血鏈球菌時(shí)，最佳的檢測(cè)波長(zhǎng)為545 nm，最佳的測(cè)定細(xì)菌范圍是1.5×105～2.0×107CFU·mL-1。MTT法在測(cè)量伴放線菌嗜血菌時(shí)，最佳的檢測(cè)波長(zhǎng)為557 nm，最佳的測(cè)定細(xì)菌范圍是1.0×106～5.0×107CFU·mL-1。MTT法與菌落形成單位法的測(cè)量結(jié)果是一致的，并且對(duì)于不同菌齡的變異鏈球菌、血鏈球菌、伴放線菌嗜血菌均適用。結(jié)論 MTT法可以用于檢測(cè)變異鏈球菌、血鏈球菌、伴放線菌嗜血菌等口腔常見(jiàn)細(xì)菌的活菌數(shù)量，并且具有快速、方便等優(yōu)點(diǎn)。

噻唑藍(lán)比色法； 變異鏈球菌； 血鏈球菌； 伴放線菌嗜血菌； 活菌計(jì)數(shù)

目前常用的活菌計(jì)數(shù)方法有菌落形成單位（colony formingunits，CFU）法、比濁法、顯微計(jì)數(shù)法等[1]。但上述方法都存在一些不足之處，因此，希望找到一種快速、準(zhǔn)確的活菌計(jì)數(shù)方法。四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，商品名為噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）。外源性MTT可以被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為難溶的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜，而死細(xì)胞無(wú)此作用。二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）可以溶解甲臜，該溶解液在一定波長(zhǎng)下的光密度值（A值）可以間接反映活細(xì)胞數(shù)。在一定的細(xì)胞濃度范圍內(nèi)，A值與活細(xì)胞數(shù)成正比。MTT法目前主要用于細(xì)胞的計(jì)數(shù)、生物因子的活性檢測(cè)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、抗腫瘤藥物的大規(guī)模篩選等。具有工作量小、操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[2-11]。本研究將以變異鏈球菌（Streptococcusmutans，S.mutans）、血鏈球菌（Streptococcus sanguis，S.sanguis）、伴放線菌嗜血菌（Haemophilus actinomycetemcomitans，H.actinomycetemcomitans）為例，采用MTT法測(cè)量口腔常見(jiàn)細(xì)菌的數(shù)量，探討MTT法用于口腔細(xì)菌計(jì)數(shù)的可行性和影響因素，以及其具體應(yīng)用過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)條件。

1 材料和方法

1.1 菌種

變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25175、血鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10556、伴放線菌嗜血菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC9710（四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。

1.2 主要試劑和儀器

0.22μm微孔過(guò)濾MTT[6]除菌，4℃避光保存，2周內(nèi)使用有效。DMSO（天津市博迪化工有限公司），離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），恒溫箱（常州國(guó)華電器有限公司），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Multiskan Spectrum（Thermo electron corporation公司，美國(guó)）。

1.3 細(xì)菌的培養(yǎng)

1.3.1 變異鏈球菌和血鏈球菌的培養(yǎng) 變異鏈球菌和血鏈球菌在兼性條件下（37℃、濕度75%～80%、90%N2、10%CO2）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后通過(guò)觀察培養(yǎng)皿菌落形態(tài)及在顯微鏡下鑒定細(xì)菌。由于本研究采用的是2種不同的計(jì)數(shù)方法，故在細(xì)菌培養(yǎng)基的選擇上采用不同的條件。當(dāng)變異鏈球菌和血鏈球菌采用螺旋接種時(shí)，培養(yǎng)基為TPY固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為24 h，24 h后人工計(jì)數(shù)；當(dāng)變異鏈球菌和血鏈球菌采用MTT法測(cè)量時(shí)，培養(yǎng)基為TPY液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間分別為12、18、24 h。

1.3.2 伴放線菌嗜血菌的培養(yǎng) 伴放線菌嗜血菌在厭氧條件下（37℃、濕度75%～80%、80%N2、10% CO2、10%H2）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后通過(guò)觀察培養(yǎng)皿菌落形態(tài)及在顯微鏡下鑒定細(xì)菌。與變異鏈球菌和血鏈球菌的培養(yǎng)一樣，伴放線菌嗜血菌在培養(yǎng)時(shí)采用2種不同的培養(yǎng)基。當(dāng)伴放線菌嗜血菌采用螺旋接種時(shí)，培養(yǎng)基為BHI固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，48 h后采用自動(dòng)微生物分析儀計(jì)數(shù)。當(dāng)伴放線菌嗜血菌采用MTT法測(cè)量時(shí)，培養(yǎng)基為BHI液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間分別為12、24、36、48 h。

1.4 MTT法測(cè)量細(xì)菌數(shù)

1.4.1 最適檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 MTT法中，MTT與琥珀酸脫氫酶反應(yīng)生成甲臜，甲臜溶于DMSO后，形成酒紅色的溶液。在400～600 nm范圍內(nèi)每間隔10 nm測(cè)定A值，以A值最大時(shí)的波長(zhǎng)為本實(shí)驗(yàn)的最適檢測(cè)波長(zhǎng)，在此條件下所測(cè)的數(shù)據(jù)誤差最小。

1.4.2 檢測(cè)干擾物對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響 在實(shí)驗(yàn)的操作中，由于細(xì)菌的狀態(tài)、培養(yǎng)基、菌液處理需要加入的試劑等均可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，故需要檢測(cè)干擾物對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響程度。以DMSO為參比，無(wú)菌生理鹽水、無(wú)菌培養(yǎng)基、上清液（10 000 r·min-1離心10 min后，吸取上清液）和死菌體（沸水浴30min）作為待測(cè)樣，用MTT法測(cè)得A值。

1.4.3 MTT與細(xì)菌反應(yīng)時(shí)間的確定 MTT溶液加入菌液后，在37℃恒溫的環(huán)境中發(fā)生生化反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)紫色的懸浮顆粒，隨著時(shí)間的推移，所產(chǎn)生的甲臜濃度增大，藍(lán)紫色變濃。為了確定反應(yīng)所需要的時(shí)間，分別對(duì)反應(yīng)了0.5、1.0、1.5、2.0 h的生成物即刻離心，加入DMSO充分溶解，測(cè)量其A值。

1.4.4 反應(yīng)所需MTT量的確定 為了保證細(xì)菌內(nèi)琥珀酸脫氫酶能充分反應(yīng)，加入MTT的量必須是過(guò)量的。因此，對(duì)相同量的細(xì)菌菌液分別加入0.05、0.1、0.15、0.2mL的MTT液，充分反應(yīng)后離心，加入DMSO溶解，測(cè)量其A值。

1.4.5 不同菌齡細(xì)菌的數(shù)量與A值的關(guān)系 在實(shí)驗(yàn)中加入的MTT是過(guò)量的，因此，MTT與琥珀酸脫氫酶的氧化還原反應(yīng)所生成的甲臜量取決于琥珀酸脫氫酶的量與活性。對(duì)于不同生長(zhǎng)階段的細(xì)菌來(lái)說(shuō)，其琥珀酸脫氫酶的量與活性可能不同。因此，需要考察細(xì)菌處于不同生長(zhǎng)階段時(shí)對(duì)MTT法的測(cè)量結(jié)果是否有影響。由于變異鏈球菌、血鏈球菌、伴放線菌嗜血菌3種細(xì)菌的生長(zhǎng)周期不一致，因此所測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)有所不同。變異鏈球菌、血鏈球菌培養(yǎng)12、18、24 h后采用MTT法測(cè)量其A值。伴放線菌嗜血菌培養(yǎng)12、24、36、48 h后采用MTT法測(cè)量其A值。

1.4.6 最佳測(cè)量范圍的確定 在某一細(xì)菌濃度范圍內(nèi)，A值與細(xì)菌數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，通過(guò)對(duì)不同菌齡細(xì)菌的數(shù)量與A值關(guān)系的統(tǒng)計(jì)分析，確定細(xì)菌的最佳測(cè)量范圍。

1.4.7 菌液的處理 在確定最適檢測(cè)波長(zhǎng)、干擾物影響、反應(yīng)時(shí)間、試劑劑量等后，先用比濁儀初步測(cè)定菌液的濃度，稀釋至1×107CFU·mL-1備用。在確定檢測(cè)范圍時(shí)，將菌液倍比稀釋。將MTT溶液0.2mL加入到1mL稀釋菌液中，混勻后37℃分別恒溫（0.5、1.0、1.5、2.0 h）10 000 r·min-1離心10min，去上清，加0.833mL DMSO溶解，加0.1mL至96孔板中，在各個(gè)細(xì)菌的最適波長(zhǎng)下測(cè)量A值，求平均值。

1.5 CFU計(jì)數(shù)法

采用螺旋接種儀接種后計(jì)數(shù)。打開(kāi)設(shè)備電源后，抽真空，然后采用戊二醛消毒，PBS液及雙蒸水依次清洗。稀釋菌液至可測(cè)范圍內(nèi)，取5mL左右至5mL一次性燒杯中，即接種至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)一定時(shí)間后，可采用自動(dòng)微生物分析儀計(jì)數(shù)或人工計(jì)數(shù)。

1.6 MTT法與CFU法的比較

將培養(yǎng)的細(xì)菌液稀釋，通過(guò)MTT法測(cè)量A值，所測(cè)得的A值按照回歸后的方程計(jì)算出MTT法所測(cè)得的細(xì)菌數(shù)，再與通過(guò)CFU法所測(cè)得的細(xì)菌數(shù)相比較，通過(guò)作圖，分析二者測(cè)量結(jié)果的區(qū)別。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)最適波長(zhǎng)、MTT量、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述；對(duì)細(xì)菌數(shù)量與A值的關(guān)系采用回歸方程的方法進(jìn)行分析；對(duì)不同菌齡的細(xì)菌數(shù)量與A值關(guān)系之間的區(qū)別采用協(xié)方差分析方法進(jìn)行分析；對(duì)于MTT法與CFU的比較，采用回歸方程進(jìn)行再預(yù)測(cè)的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 最適檢測(cè)波長(zhǎng)的測(cè)定

變異鏈球菌在510 nm時(shí)的A值最大；血鏈球菌最大的吸收峰值在540～550 nm處，因此將545 nm定為檢測(cè)波長(zhǎng)；伴放線菌嗜血菌最大的吸收峰值在555～560 nm處，因此將557 nm定為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 干擾物對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響

以DMSO為參比，無(wú)菌生理鹽水、無(wú)菌培養(yǎng)基、上清液和死菌體作為待測(cè)樣，采用MTT法測(cè)得A值的結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，這些物質(zhì)對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的干擾很小。

表1 不同物質(zhì)以DMSO為對(duì)照時(shí)的A值Tab 1 A value of the different substances compared DMSO

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響

在各個(gè)反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)A值的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，反應(yīng)在1.5 h后基本完成。

表2 不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)A值的測(cè)定結(jié)果Tab 2 A value of the different reaction time

2.4 MTT的量對(duì)結(jié)果的影響

隨著加入MTT量的增加，可以觀察到其顏色變深。對(duì)相同量的細(xì)菌菌液分別加入0.05、0.1、0.15、0.2mL的MTT液，其A值的測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，加入MTT量在0.15mL時(shí)反應(yīng)基本完成。

表3 加入不同MTT量后A值的測(cè)定結(jié)果Tab 3 A value of the different quantity of MTT

2.5 不同菌齡細(xì)菌的檢測(cè)分析及其測(cè)量范圍

2.5.1 不同菌齡變異鏈球菌細(xì)菌數(shù)與A值的關(guān)系不同培養(yǎng)時(shí)間變異鏈球菌細(xì)菌數(shù)與A值的關(guān)系間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果顯示，MTT法適用于不同生長(zhǎng)階段的變異鏈球菌，當(dāng)菌濃度在1.5× 105～1.0×107CFU·mL-1時(shí)與A值成正相關(guān)（r=0.803，P＜0.05）。

2.5.2 不同菌齡血鏈球菌細(xì)菌數(shù)與A值的關(guān)系 不同培養(yǎng)時(shí)間血鏈球菌細(xì)菌數(shù)與A值的關(guān)系間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果顯示，MTT法適用于不同生長(zhǎng)階段的血鏈球菌，并且當(dāng)菌濃度在1.5×105～2.0×107CFU·mL-1時(shí)與A值成正相關(guān)（r=0.826，P＜0.05）。

2.5.3 不同菌齡伴放線菌嗜血菌細(xì)菌數(shù)與A值的關(guān)系 不同培養(yǎng)時(shí)間伴放線菌嗜血菌細(xì)菌數(shù)與A值的關(guān)系間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果顯示，MTT法適用于不同生長(zhǎng)階段的伴放線菌嗜血菌，當(dāng)菌濃度在1.0×106～5.0×107CFU·mL-1時(shí)與A值成正相關(guān)（r=0.928，P＜0.05）。

2.6 CFU法測(cè)量細(xì)菌數(shù)量的結(jié)果

變異鏈球菌在培養(yǎng)12、18、24 h的細(xì)菌數(shù)為6.5×108、6.0×108、6.0×108CFU·mL-1。血鏈球菌在培養(yǎng)12、18、24 h的細(xì)菌數(shù)為6.0×108、6.0×108、7.0×108CFU·mL-1。伴放線菌嗜血菌在培養(yǎng)12、24、36、48 h的細(xì)菌數(shù)為2.0×108、2.2×108、2.5×108、3.0×108CFU·mL-1。

2.7 MTT法與CFU法的比較結(jié)果

用MTT法與CFU法對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程活菌濃度進(jìn)行檢測(cè)（圖1～3），其中橫坐標(biāo)表示的是MTT法所測(cè)得的細(xì)菌數(shù)，縱坐標(biāo)表示的是CFU法所測(cè)得的細(xì)菌數(shù)，直線表示的是過(guò)原點(diǎn)的，斜率為1的直線。由圖1～3可見(jiàn)，MTT法與CFU法所測(cè)得的細(xì)菌數(shù)是一致的。

圖1 MTT法與CFU法測(cè)量變異鏈球菌的比較Fig 1 Comparison of counting of S.mutans by MTT colorimetric and CFU method

圖2 MTT法與CFU法測(cè)量血鏈球菌的比較Fig 2 Comparison of counting of S.sanguis by MTT colorimetric and CFU method

圖3 MTT法與CFU法測(cè)量伴放線菌嗜血菌的比較Fig 3 Comparison of counting of H.actinomycetemcomitans by MTT colorimetric and CFU method

3 討論

本研究采用MTT法測(cè)量口腔常見(jiàn)細(xì)菌的活菌數(shù)，并與CFU法相比較，探討MTT法用于口腔細(xì)菌活菌計(jì)數(shù)的可行性。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：1）不同的細(xì)菌有其特有的測(cè)量波長(zhǎng)；2）實(shí)驗(yàn)中各種有可能對(duì)測(cè)量結(jié)果有影響的試劑、成分等對(duì)測(cè)量結(jié)果無(wú)影響或影響很小；3）在充足的反應(yīng)試劑和反應(yīng)時(shí)間的條件下，可以準(zhǔn)確測(cè)量細(xì)菌的活菌數(shù)量；4）在一定的細(xì)菌濃度范圍內(nèi)，A值與活菌數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，可以通過(guò)測(cè)量A值推算活菌數(shù)；5）對(duì)于處于不同生長(zhǎng)階段的細(xì)菌，MTT法均適用；6）采用MTT法測(cè)量細(xì)菌活菌數(shù)量的結(jié)果與CFU法一致。因此，可以認(rèn)為，MTT法是一種可行的測(cè)量口腔細(xì)菌活菌數(shù)量的方法。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用螺旋接種儀進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。螺旋接種儀具有自動(dòng)化、可重復(fù)性、靈活性好、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于食品醫(yī)藥、水、臨床等領(lǐng)域?qū)ξ⑸锖枯^高的樣品的定量分析，可以對(duì)菌含量從4～30×105CFU·mL-1的樣品進(jìn)行定量分析。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)使用酶標(biāo)儀測(cè)定口腔細(xì)菌活菌數(shù)量的MTT法進(jìn)行了探討，與文獻(xiàn)中已有的用于動(dòng)物細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)以及少數(shù)測(cè)定其他細(xì)菌活菌計(jì)數(shù)測(cè)定方法[6，8-13]相比，用于口腔細(xì)菌測(cè)量的MTT法的改進(jìn)之處以及測(cè)量口腔細(xì)菌時(shí)的適用條件有以下幾點(diǎn)：1）琥珀酸脫氫酶與MTT反應(yīng)溫度為37℃，這是變異鏈球菌、血鏈球菌、伴放線菌嗜血菌生長(zhǎng)的最適溫度，對(duì)于口腔內(nèi)的細(xì)菌來(lái)說(shuō)，溫度基本上都為37℃，在此溫度下，酶的活性最大，有利于反應(yīng)的進(jìn)行。2）MTT法用于口腔細(xì)菌變異鏈球菌、血鏈球菌、伴放線菌嗜血菌測(cè)定時(shí)的最佳比色波長(zhǎng)分別為為510、545、557 nm，不同于動(dòng)物細(xì)胞活細(xì)胞檢測(cè)所采用的波長(zhǎng)（490、570、630 nm），以及植物青枯病高效生防菌株P(guān)BW1采用的波長(zhǎng)（525 nm）。這可能與MTT反應(yīng)后生成的甲臜顆粒沉積于細(xì)菌內(nèi)或細(xì)菌周圍、細(xì)菌的大小或其他因素影響有關(guān)。本研究采用在最適波長(zhǎng)時(shí)測(cè)量A值，在同等條件下，其誤差最小，結(jié)果更準(zhǔn)確。3）口腔細(xì)菌活菌數(shù)測(cè)定中的反應(yīng)時(shí)間為1.5 h，比動(dòng)物細(xì)胞測(cè)定的4 h、PBW1測(cè)定的2 h均較少，而比大腸桿菌的反應(yīng)時(shí)間20min多。這可能與各種細(xì)胞/細(xì)菌中所包含的琥珀酸脫氫酶的量、活性不同有關(guān)。4）MTT法測(cè)量口腔細(xì)菌活菌菌數(shù)，當(dāng)變異鏈球菌活菌濃度在1.5×105～1.0×107CFU·mL-1，血鏈球菌活菌濃度在1.5×105～2.0×107CFU·mL-1；伴放線菌嗜血菌活菌濃度在1.0×106～5.0×107CFU·mL-1時(shí)，A值與活菌數(shù)呈良好的正相關(guān)，在此測(cè)定范圍內(nèi)完全可以滿足一般的檢測(cè)需要。5）在實(shí)驗(yàn)中，MTT的量必須足夠，在菌液為1mL時(shí)，MTT量應(yīng)該不小于0.15mL。這區(qū)別于動(dòng)物細(xì)胞所需量即MTT使用說(shuō)明上要求MTT量為0.1mL。6）MTT與琥珀酸脫氫酶反應(yīng)后生成藍(lán)紫色的難溶物，實(shí)驗(yàn)期間觀察，隨著時(shí)間的推移，甲臜逐漸沉淀，上清液變得透明，整個(gè)反應(yīng)體系不均勻，與王栩等[13]的觀察不一致，可能與他們是直接采用96孔板有關(guān)。此外，為了排除上清液的干擾，使結(jié)果更準(zhǔn)確，本研究離心去除上清液，加入DMSO溶解后再測(cè)量其A值。

[1] 馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢測(cè)手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社,2000：70-74.

MA Xu-rong,SU De-mo.Microbiological testing drugs handbook[M].Beijing：Science Press,2000：70-74.

[2] Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：Application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods,1983,65（1/2）：55-63.

[3] Carmichael J,DeGraff WG,Gazdar AF,et al.Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay：Assessment of chemosensitivity testing[J].Cancer Res,1987,47（4）：936-942.

[4] 李影林.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)全書（下卷）[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社,1997：2212.

LI Ying-lin.Medical examination（II）[M].2nd ed.Beijing：People′s Medical Publishing House,1997：2212.

[5] Freimoser FM,Jakob CA,Aebi M,et al.The MTT[3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide]assay is a fast and reliable method for colorimetric determination of fungal cell densities[J].Appl Environ Microbiol,1999,65（8）：3727-3729.

[6] 司徒鎮(zhèn)強(qiáng).細(xì)胞培養(yǎng)[M].北京：世界圖書出版社,1996：186-187.

SITU Zhen-qiang.Cell culture[M].Beijing：World Publishing Corporation,1996：186-187.

[7] 薛彬,Edeman A,Thorbecke GJ.介紹一種用顏色顯示法測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖[J].北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1987,19（2）：125-127.

XUE Bin,Edeman A,Thorbecke GJ.Introducing a method by color to detect the living and the proliferation of cell[J].J Peking University,1987,19（2）：125-127.

[8] Arseculeratne SN,Atapattu DN.The assessment of the viability of the endospores of Rhinosporidium seeberi with MTT（3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）[J]. Mycol Res,2004,108（Pt12）：1423-1430.

[9] Cetin Y,Bullerman LB.Cytotoxicity of Fusarium mycotoxins to mammalian cell cultures as determined by the MTT bioassay[J]. Food Chem Toxicol,2005,43（5）：755-764.

[10]林忠寧,董勝璋,董書蕓,等.MTT法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖功能的方法學(xué)探討與應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2002,10（1）：8-10.

LIN Zhong-ning,DONG Sheng-zhang,DONG Shu-yun,et al. Approaching of the methodology and application of the T lymphocyte proliferation by MTT[J].Chin J Health Laboratory Technology,2002,10（1）：8-10.

[11]錢江潮,魏東芝,陳笑嵐,等.MTT法測(cè)定人表皮癌細(xì)胞的抗藥性[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào),2000,26（1）：103-106.

QIAN Jiang-chao,WEI Dong-zhi,CHEN Xiao-lan,et al.Determination of multidrug resistance of human KB carcinoma cells by MTT colorimetric assay[J].J East China University Science Technology,2000,26（1）：103-106.

[12] 魏鴻剛,李元廣,劉建,等.一種快速的活菌計(jì)數(shù)新方法研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2002,29（2）：89-93.

WEI Hong-gang,LI Yuan-guang,LIU Jian,et al.Studies on a new method for counting living bacterial cell number[J].Microbiology,2002,29（2）：89-93.

[13]王栩,鄔于川,夏世平,等.MTT法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的方法學(xué)探討[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,25（4）：291-292.

WANG Xu,WU Yu-chuan,XIA Shi-ping,et al.Inquiring into the method of counting live germ with MTT[J].J Luzhou Medical College,2002,25（4）：291-292.

（本文編輯 王晴）

Study on the counting of Streptococcus mutans,Streptococcus sanguis,Haemophilus actinomycetemcomitans by methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric method

WANG Zhong-chao1,FAN Li-yuan2,JIANG Jun-qiang1,CAIWei1,DING Yi3.（1.Dept.of Endodontics,Stomatological Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou646000,China;2.Dept.of Prosthodontics,Stomatological Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou646000,China;3.Dept.of Periodontology,West China College of Stomatology,Sichuan University,Chengdu610041,China）

ObjectiveTo explore the feasibility of methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）colorimetric method and the applied condition for the normal bacteria in the mouth,asStreptococcus mutans（S.mutans）,Streptococcus sanguis（S. sanguis）,Haemophilus actinomycetemcomitans（H.actinomycetemcomitans）.MethodsColony forming units（CFU）which was the standard antitheses was used to count bacteria.This study would gain some parameters by changing wavelength,reactive time,dosage and so on.MTT colorimetric method was applied in the counting ofS.mutans,S. sanguisandH.actinomycetemcomitans.Results When countingS.mutans,the best wavelength was 510 nm,the best range was 1.5×105～1.0×107CFU·mL-1.When countingS.sanguis,the best wavelength was 545 nm,the best range was 1.5×105～2.0×107CFU·mL-1.When countingH.actinomycetemcomitans,the best wavelength was 557 nm,the best range was 1.0×106～5.0×107CFU·mL-1.MTT colorimetric method can be used for different agedS.mutans,S.sanguisandH.actinomycetemcomitans.ConclusionOral bacteria could be counted by MTT colorimetric method,which is fast and convenient.

methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric method；Streptococcus mutans；Streptococcus sanguis；Haemophilus actinomycetemcomitans； bacterial cell counting

R 780.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2010.03.020

1000－1182（2010）03－0306-05

2009-12-11；

2010-04-06

王忠朝（1980—），男，四川人，住院醫(yī)師，碩士

丁一，Tel：028-61153007