牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白Fim A基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)和純化

李昂 謝紅幗 梁平 朱春暉 石建峰 饒國(guó)洲 茍建重

（1.西安交通大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究中心；2.牙周科，陜西西安710004）

牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白Fim A基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)和純化

李昂1謝紅幗2梁平2朱春暉2石建峰1饒國(guó)洲1茍建重2

（1.西安交通大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究中心；2.牙周科，陜西西安710004）

目的克隆牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白FimA基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)其在大腸桿菌中融合表達(dá)，并鑒定、純化其表達(dá)產(chǎn)物。方法克隆牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白FimA基因，構(gòu)建表達(dá)載體pET15b-FimA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）pLyS感受態(tài)細(xì)胞；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，以抗6×His Tag單克隆抗體為一抗，Western blot鑒定、Co2+柱親和層析純化融合蛋白。結(jié)果克隆的FimA基因序列及插入表達(dá)載體中的FimA序列均與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列呈現(xiàn)100%同源性；IPTG誘導(dǎo)后Western blot鑒定4.1×104處有目的蛋白表達(dá)；Co2+柱親和層析法獲得純化的高濃度FimA蛋白。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白FimA基因的原核表達(dá)載體pET15b-FimA，并在大腸桿菌中獲得成功表達(dá)和純化，為進(jìn)一步制備牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白單克隆抗體和研制開(kāi)發(fā)預(yù)防牙周炎的亞單位蛋白疫苗奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

牙齦卟啉單胞菌；菌毛蛋白A；融合表達(dá)

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是目前公認(rèn)的一種牙周致病菌，其表面含有大量毒性因子，如蛋白酶、菌毛、脂多糖、血凝素等[1]。其中菌毛可介導(dǎo)P.gingivalis在口腔的定植黏附，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種黏附分子、炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和成熟，導(dǎo)致牙槽骨的吸收，是P.gingivalis造成牙周組織侵襲性破壞的基礎(chǔ)[2-4]。研究表明[5-6]，P.gingivalis菌毛蛋白具有良好的免疫原性，在體內(nèi)能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)，抑制多種炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生，抵制P.gingivalis的黏附定植和進(jìn)一步地侵襲破壞能力，阻斷P.gingivalis感染后牙周組織受到破壞，是一種有潛力的牙周炎疫苗候選免疫原[7]。據(jù)此,本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)基因克隆與重組技術(shù)構(gòu)建P.gingivalis菌毛蛋白FimA基因的原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)其在大腸桿菌中表達(dá)，通過(guò)純化以獲得高濃度的FimA融合蛋白，為進(jìn)一步制備P. gingivalis菌毛蛋白單克隆抗體和開(kāi)發(fā)研制預(yù)防牙周炎的蛋白亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

P.gingivalis ATCC 381（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所）；大腸桿菌JM109和BL21（DE3）pLyS、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；pMD18-T vector System、pET-15b vector、Ex TaqTM DNA Polymerase、PCR試劑盒、T4 DNA Ligase、各種限制性核酸內(nèi)切酶、DNA Marker、X-gal、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）（大連寶生物工程大連有限公司）；TALON純化試劑盒（Clontech公司，美國(guó)）；硝酸纖維素膜、Anti-his antibody、Goat anti-Mouse IgG（H+L）、ECL底物發(fā)光試劑盒（Pierce公司，美國(guó)）。實(shí)驗(yàn)引物合成、DNA序列測(cè)定（上海生工生物工程技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 牙齦卟啉單胞菌基因組DNA的提取接種P. gingivalis ATCC 381于改良GAM血液瓊脂培養(yǎng)基（加入1 mg·L-1維生素K和50 g·kg-1脫纖維蛋白羊血），37℃厭養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)4 d，刮取板面上的所有菌落，離心收集菌體，采用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，提取P.gingivalis基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度儀檢測(cè)含量和純度。

1.2.2 目的基因擴(kuò)增及克隆載體構(gòu)建根據(jù)P.gingivalis ATCC 381 FimA基因序列（ID17794），采用電腦軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′-CCTCATATGGTGGTATTGAAGACCAGCA-3′，加入NdeⅠ酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)密碼子ATG，下游引物：5′-TTA CCAAGTAGCATTCTGACCAACGA-3′，含終止密碼子TAA。以P.gingivalis基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入熱循環(huán)（94℃變性30 s，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min），共30個(gè)循環(huán)，72℃20 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物中的目的片段。用T4 DNA連接酶將目的片段亞克隆入pMD18-T，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，采用氨芐西林瓊脂平板進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑取白色克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。根據(jù)Vector NTI 9.0軟件分析結(jié)果選用HindⅢ和Bam HⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序分析，正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18T-FimA。

1.2.3 FimA原核表達(dá)載體pET15b-FimA的構(gòu)建及鑒定將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMD18T-FimA和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-15 b分別以NdeⅠ和Bam HⅠ雙酶切，用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠分別回收酶切產(chǎn)物中的FimA和pET-15b大片段，T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選氨芐西林陽(yáng)性克隆擴(kuò)菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒命名為pET15b-FimA。

1.2.4 FimA在大腸桿菌BL21（DE3）pLyS中的表達(dá)提取pET15b-FimA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）pLyS感受態(tài)細(xì)胞，挑取一單克隆菌落，接種入1 mL Amp+（50 μg·mL-1）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250 r·min-1振搖6 h。取菌液50 μL加LB 1 mL共6管，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)2 h。待菌液濃度達(dá)A550nm0.6～0.8時(shí)，分別加入IPTG，誘導(dǎo)的IPTG終濃度分別為1、2 mmol·L-1，誘導(dǎo)時(shí)間為1、2和3 h，同時(shí)以轉(zhuǎn)化有空載體pET-15b的BL21為陰性對(duì)照。分別離心收集細(xì)菌沉淀，每管加入400 μL蛋白上樣緩沖液，重懸后煮沸10 min，10 000 g離心10 min，取上清液備用。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析：配制12%分離膠和5%濃縮膠，取上述樣品，每孔30 μL，濃縮膠電壓90 V，分離膠電壓120 V，電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色3 h。脫色液脫色至蛋白條帶清晰，背景無(wú)色透明，觀察結(jié)果。

1.2.5 Co2+柱親和層析FimA蛋白的純化挑取轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pET15b-FimA的BL21陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增至500mL LB（Amp+）培養(yǎng)液中，37℃振搖4 h；加入IPTG致終濃度為2 mmol·L-1，37℃振搖3 h；收集細(xì)菌沉淀。于冰上用pH 7.0的Buffer A重懸細(xì)胞沉淀物，輕搖至半透明；4℃，10 000～12 000 g離心20 min除雜質(zhì)；將上清液加入經(jīng)Buffer A處理的Co2+柱親和層析的TALON樹(shù)脂中，反復(fù)沖洗柱子；加入5倍柱床體積的Buffer B洗脫，每份500 μL收集洗脫液。將洗脫液以Buffer C稀釋后，置于透析袋中，在4℃攪拌條件下，梯度透析，將透析好的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分析目的蛋白。

1.2.6 Western blot鑒定純化的FimA蛋白將純化的FimA融合蛋白進(jìn)行12%的SDS-PAGE，切取所需條帶，300 mA、65 min轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。10%脫脂奶粉搖床上封閉4 h，TBST洗膜3次；加入1∶2 000稀釋的抗His標(biāo)簽抗體為一抗，4℃過(guò)夜。洗膜后加入1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1 h。ECL底物發(fā)光顯色試劑盒顯色，X線(xiàn)曝光分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增FimA基因

提取的P.gingivalis ATCC 381基因組DNA純度較高，A260nm/A280nm=1.78，說(shuō)明基本沒(méi)有RNA及蛋白污染。DNA質(zhì)量濃度為65 μg·mL-1。以獲得的DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，電泳顯示于1 000 bp處有一特異性條帶，與預(yù)期大?。? 053 bp）大小一致（圖1）。

圖1 FimA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig 1 The electrophoresis map of PCR products

2.2 重組克隆質(zhì)粒pMD18T-FimA的鑒定

依據(jù)Vector NTI 9.0軟件對(duì)pMD18T-FimA進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析的結(jié)果，選用HindⅢ/Bam HⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pMD18T-FimA進(jìn)行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在2 000～3 500 bp之間和1 000 bp處各有一單一條帶，與預(yù)期大小（2 656 bp和1 089 bp）一致（圖2）。測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST同源性分析同Gen Bank收錄的P.gingivalis ATCC 381 FimA基因（ID17794）的編碼區(qū)（206～1 290 bp）核苷酸序列完全一致，符合率100%。

2.3 原核表達(dá)載體pET15b-FimA的構(gòu)建與鑒定

按照Vector NTI 9.0軟件對(duì)pET15b-FimA的酶切位點(diǎn)分析結(jié)果，選用NdeⅠ和HindⅢ對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，電泳結(jié)果顯示有與預(yù)期大小一致的酶切片段。表明成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET15b-FimA（圖3）。

圖2 pMD18T-FimA質(zhì)粒HindⅢ/Bam HⅠ雙酶切結(jié)果Fig 2 The electrophoresis map of plamid pMD18T-FimA digested with HindⅢ/Bam HⅠ

圖3 pET15b-FimA質(zhì)粒NdeⅠ/HindⅢ雙酶切結(jié)果Fig 3 The electrophoresis map of plasmid pET15b-FimA digested with NdeⅠ/HindⅢ

2.4 pET15b-FimA在大腸桿菌BL21（DE3）pLyS中的表達(dá)分析

重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET15b-FimA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）pLyS，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，在4.1×104處顯示明顯融合蛋白條帶，大小與預(yù)期大小基本一致，而空質(zhì)粒pET-15b在該處無(wú)特異條帶（圖4）。IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)融合蛋白表達(dá)量影響較大。表明牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白FimA編碼基因在大腸桿菌BL21（DE3）pLyS中獲得成功表達(dá)。

2.5 Western blot鑒定純化的FimA蛋白

FimA融合蛋白經(jīng)過(guò)包涵體裂解、Co2+柱親和層析、去除尿素等變性劑，洗脫液中得到被純化的6× His-FimA融和蛋白。以鼠抗6×His Tag單克隆抗體為一抗，以β-actin（4.3×104）為參照進(jìn)行Western blot檢測(cè)，其結(jié)果顯示了純化的蛋白為His-FimA融合蛋白，并且表達(dá)量和純度較未純化樣品有明顯增加（圖5）。

圖4 FimA的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)分析Fig 4 Protein expression analysis induced by IPTG

圖5 純化的FimA蛋白Western blot圖譜Fig 5 The map of FimA protein was purified by Co2+-NTA

3 討論

研制開(kāi)發(fā)針對(duì)P.gingivalis菌毛抗原的牙周炎疫苗一直是牙周病輔助治療的方向之一。2007年，姜廣水等[8]構(gòu)建了FimA蛋白和白細(xì)胞介素-15共表達(dá)質(zhì)粒pIRES-FimA/IL15，經(jīng)滴鼻免疫和肌肉注射免疫BABL/cdx鼠，證實(shí)FimA基因滴鼻免疫可以作為抗牙齦卟啉單胞菌DNA疫苗有效的黏膜免疫途徑，能誘導(dǎo)循環(huán)和口腔局部抗體反應(yīng)。目前，比較有應(yīng)用前景的P.gingivalis疫苗策略主要采用純化蛋白加佐劑的免疫形式，如Koizumi等[9]發(fā)現(xiàn)4.0×104外膜蛋白加霍亂毒素經(jīng)鼻腔免疫，能夠引起實(shí)驗(yàn)鼠的長(zhǎng)效免疫反應(yīng)和免疫保護(hù)性。

本研究的目的就是獲取FimA的重組蛋白作為亞單位蛋白疫苗，而融合標(biāo)簽技術(shù)是目前獲得重組蛋白的一種有效方法。其通過(guò)DNA重組在靶蛋白編碼基因的3′端或5′端融合某種標(biāo)簽的編碼基因，通過(guò)適宜的宿主來(lái)表達(dá)重組蛋白質(zhì)[10]。其中多聚組氨酸，即His標(biāo)簽[11]，其相對(duì)分子質(zhì)量小，對(duì)融合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小，不需要從融合蛋白質(zhì)中切除，且可通過(guò)其對(duì)金屬離子如鎳、鈷具有高度的選擇性和親和力[12]，利用抗His標(biāo)簽的單克隆抗體從復(fù)雜的提取物中對(duì)融合蛋白進(jìn)行選擇性結(jié)合、洗脫和純化。所提取的蛋白和從菌體中直接獲得的蛋白一樣，可以用于動(dòng)物免疫。2007年，日本學(xué)者Takahashi等[13]用P.gingivalis ATCC 33277全菌表面提純的菌毛加重組的霍亂毒素經(jīng)鼻免疫BALB/c小鼠，證實(shí)能夠?qū). gingivalis誘導(dǎo)的牙周炎發(fā)揮明顯的免疫保護(hù)作用。2009年，Kim等[14]構(gòu)建的CTB-FimA1（氨基酸殘基1～200）和CTB-FimA2（氨基酸殘基201～337）重組亞單位蛋白疫苗也在動(dòng)物體內(nèi)獲得較好的免疫保護(hù)效果。

菌毛蛋白由相對(duì)分子質(zhì)量為4.1×104的菌毛單體聚合形成，其編碼基因?yàn)閱慰截惢騀imA，全長(zhǎng)1 290 bp，編碼347個(gè)氨基酸。翻譯后產(chǎn)物菌毛蛋白的功能域位于氨基酸序列的31～331aa不等，各個(gè)位點(diǎn)之間可相互交叉或覆蓋[15]。根據(jù)FimA基因開(kāi)放閱讀框架核苷酸序列的差異可將P.gingivalis分為6型（Ⅰ～Ⅴ型和Ⅰb亞型），在P.gingivalis陽(yáng)性的健康人中，以Ⅰ型FimA P.gingivalis為主（76.1%），在牙周炎病人中，以Ⅱ型FimA P.gingivalis為主（66.1%），而且Ⅱ型FimA P.gingivalis與重型牙周炎明顯相關(guān)[16]。但不同基因型的FimA編碼區(qū)均存在有不同長(zhǎng)度的同源序列，其編碼蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上也存在較大同源性，相互之間可以發(fā)生較強(qiáng)的交叉免疫[17]。本實(shí)驗(yàn)選擇從P.gingivalis ATCC 381 DNA中擴(kuò)增出完整的FimA基因編碼區(qū)、構(gòu)建其原核表達(dá)載體并獲得融合蛋白的成功表達(dá)，為臨床降低健康人群P.gingivalis感染率、干擾其他基因型P.gingivalis感染做出探索性研究。

本實(shí)驗(yàn)所用的原核表達(dá)載體pET-15b載體屬于pET載體系列，與劉薇等[18]表達(dá)FimA重組蛋白使用的pBAD載體有所不同。該表達(dá)載體在E.coli BL21（DE3）pLyS宿主菌中能高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)、且這種表達(dá)的外源蛋白質(zhì)因帶有鈣調(diào)素結(jié)合多肽和凝血酶切點(diǎn)，故該蛋白產(chǎn)物易于純化和產(chǎn)業(yè)化。本課題選用Clontech的TALON鈷離子樹(shù)脂進(jìn)行親和層析柱，對(duì)FimA重組蛋白進(jìn)行純化，用抗His標(biāo)簽的單抗對(duì)純化的蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果證實(shí)，獲得了濃縮純化度很高的FimA重組蛋白。這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備多克隆抗體，進(jìn)一步探索P.gingivalis菌毛結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，研發(fā)牙周炎蛋白亞單位疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（本文編輯湯亞玲）

《中國(guó)口腔醫(yī)學(xué)年鑒》2008年卷出版發(fā)行

由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院周學(xué)東教授主編，全國(guó)50余所口腔醫(yī)學(xué)院校、口腔醫(yī)院組成的編輯委員會(huì)編纂的《中國(guó)口腔醫(yī)學(xué)年鑒》2008年卷已于2009年9月正式出版發(fā)行。本卷設(shè)回顧、論壇、博士后出站報(bào)告摘要、優(yōu)秀博士學(xué)位論文摘要、文選·述評(píng)、教育、人物、口腔醫(yī)學(xué)組織機(jī)構(gòu)、記事、文獻(xiàn)法規(guī)、特載和索引12個(gè)欄目，全面、客觀、準(zhǔn)確地記錄了2008年度中國(guó)口腔醫(yī)學(xué)在臨床、教學(xué)和科研等方面的發(fā)展?fàn)顩r和最新研究動(dòng)態(tài)及學(xué)術(shù)水平，反映了口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重大事件與學(xué)術(shù)交流簡(jiǎn)況等。本書(shū)57萬(wàn)字，16開(kāi)，精裝，定價(jià)73.00元（郵購(gòu)需另加郵掛費(fèi)7.00元）。需購(gòu)書(shū)者請(qǐng)匯款至成都市人民南路三段14號(hào)（郵政編碼610041）《中國(guó)口腔醫(yī)學(xué)年鑒》編輯部，聯(lián)系電話(huà)：028-85503479，028-85502414；E-mail：zgkqyxnj@vip.163.com。

《中國(guó)口腔醫(yī)學(xué)年鑒》編輯部

Construction of prokaryotic expression vector of FimA gene from Porphyromonas gingivalis,fusion expres-sion and purification in E.coli BL21（DE3）pLyS

LI Ang1,XIE Hong-guo2,LIANG Ping2,ZHU Chun-hui2,SHI Jian-feng1,RAO Guo-zhou1,GOU Jian-zhong2.
（1.Research Center for Stomatology,College of Stomatology,Xi′an Jiaotong University,Xi′an 710004,China；2.Dept.of Periodontology,College of Stomatology,Xi′an Jiaotong University,Xi′an 710004,China）

Objective To clone the FimA gene of fimbriae from Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis）and to construct prokaryotic expression vector which was induced in E.coli BL21（DE3）pLyS in the form of fusion protein expression and to identify,purify the product of its expression.M ethods To clone the FimA gene of fimbriae from P.gingivalis and to construct prokaryotic expression vector pET15b-FimA vector which was transformed into the competent cells of BL21（DE3）pLyS.The expression of fusion protein was induced by isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside（IPTG）.With anti-6×His Tag monoclonal antibody as the first antibody,the expressed fusion protein was characterized by Western blot and purified by Co2+-NTA affinity chromatography.Results Cloned FimA gene sequences and inserted into expression vector of the FimA sequences were related to the sequence in GenBank database showed 100%homology.IPTG induced and then identified by Western blot showed a fragment of 4.1×104has been expressed.Co2+-NTA affinity chromatography column was used to obtain high concentrations of FimA purified protein. Conclusion The recombinant prokaryotic expression vector of pET15b-FimA was constructed and was expressed and purified successfully in E.coli BL21（DE3）pLyS.This study laid the experimental foundation to further prepare for monoclonal antibodies of fimbriae of P.gingivalis and to develop the subunit protein vaccine of prevention of periodontitis.

Porphyromonas gingivalis；FimA；fusion expression

R 786

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2010.03.004

1000－1182（2010）03－0241-05

2009-11-10；

2010-02-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30500560）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（2006C242）；西安市科技攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目（GG05159）

李昂（1970—），男，北京人，副研究員，博士

茍建重，Tel：029-87287539