纖維調(diào)節(jié)素在人類牙周細(xì)胞損傷愈合中的免疫組織化學(xué)表達

錢虹 黃群 肖殷

（1.廣東省口腔醫(yī)院·南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 兒童牙科，廣東 廣州 510280；

2.廣東省婦幼保健院 口腔中心，廣東 廣州 510010；3.昆士蘭理工大學(xué)，澳大利亞 布里斯班 4000）

纖維調(diào)節(jié)素在人類牙周細(xì)胞損傷愈合中的免疫組織化學(xué)表達

錢虹1黃群2肖殷3

（1.廣東省口腔醫(yī)院·南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 兒童牙科，廣東 廣州 510280；

2.廣東省婦幼保健院 口腔中心，廣東 廣州 510010；3.昆士蘭理工大學(xué)，澳大利亞 布里斯班 4000）

目的 研究纖維調(diào)節(jié)素在牙周細(xì)胞損傷愈合中的表達，探討纖維調(diào)節(jié)素在牙周損傷愈合中的作用。方法培養(yǎng)人類牙周細(xì)胞（牙齦成纖維細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞）；在培養(yǎng)了牙周細(xì)胞的載玻片上做損傷細(xì)胞的圓形創(chuàng)口，建立牙周細(xì)胞損傷模型，跟蹤觀察7 d；用免疫組織化學(xué)染色的方法，觀察纖維調(diào)節(jié)素在牙周細(xì)胞損傷愈合過程中的表達。結(jié)果 牙周細(xì)胞損傷后第1天，纖維調(diào)節(jié)素較強表達于損傷邊緣新移行的細(xì)胞；隨后，纖維調(diào)節(jié)素對損傷區(qū)新近移行的細(xì)胞的表達強于創(chuàng)口周圍的細(xì)胞。結(jié)論 纖維調(diào)節(jié)素強烈表達于損傷區(qū)新近移行的牙周細(xì)胞，可能參與牙周損傷愈合的早期活動。

纖維調(diào)節(jié)素； 牙周細(xì)胞； 損傷愈合； 免疫組織化學(xué)

牙周損傷愈合是一個復(fù)雜的過程，包括細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間在時間上和空間上的協(xié)調(diào)活動，而這些活動涉及上皮和牙齦、牙周膜、牙骨質(zhì)和骨等結(jié)締組織，對損傷愈合區(qū)域細(xì)胞及組織的變化起決定性作用。牙周組織再生需要牙周組織中的細(xì)胞移行、增殖和分化，因而在牙周再生過程中，牙周細(xì)胞顯得非常重要。在牙周損傷部位的細(xì)胞類型將會影響愈合結(jié)果，牙周損傷區(qū)細(xì)胞數(shù)目的調(diào)節(jié)也被認(rèn)為是牙周組織再生的關(guān)鍵。因此，了解牙周損傷愈合的重點是了解損傷區(qū)細(xì)胞移行和增殖的調(diào)節(jié)。

利用體內(nèi)牙周損傷愈合模型進行損傷愈合的免疫組織化學(xué)研究[1-3]的結(jié)果顯示，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖中的纖維調(diào)節(jié)素與牙周損傷愈合有著密切的關(guān)系，很可能參與牙周損傷愈合早期的組織活動。為了進一步證實纖維調(diào)節(jié)素與牙周損傷愈合早期階段有關(guān)，本研究設(shè)計了體外牙周細(xì)胞損傷愈合模型，目的是揭示纖維調(diào)節(jié)素在牙周細(xì)胞損傷愈合期間細(xì)胞中的免疫組織化學(xué)表達。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人類牙齦成纖維細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞取自澳大利亞昆士蘭大學(xué)牙學(xué)院結(jié)締組織研究實驗室。這些細(xì)胞從人類正常牙齦、牙周膜和牙槽骨組織中分離出來，保存于液氮中。使用時，從液氮中取出細(xì)胞，培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，并加入10%胎牛血清、每毫升50單位青霉素、每毫升50單位鏈霉素以及10%非必需氨基酸。這些細(xì)胞孵育在37℃，含5%二氧化碳和95%空氣的濕潤環(huán)境中。培養(yǎng)基每2～3 d更換1次。實驗所用細(xì)胞為第4代到第8代。

1.2 牙周細(xì)胞損傷模型

細(xì)胞損傷操作步驟如下：1）當(dāng)培養(yǎng)的牙齦成纖維細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞充滿培養(yǎng)基時，將它們轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)載玻片上（每毫升105個細(xì)胞），繼續(xù)培養(yǎng)；2）約1周后，細(xì)胞充滿整個載玻片；3）將經(jīng)過消毒的圓柱狀橡皮置于載玻片上，輕壓并旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)生約6mm直徑的圓形創(chuàng)口，借助倒置顯微鏡檢查損傷區(qū)是否干凈，無細(xì)胞殘存；4）創(chuàng)口區(qū)用PBS輕輕沖洗；5）置于新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 免疫組織化學(xué)

在牙齦成纖維細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞損傷后第1、3、7天，取出載玻片，采用ABC法常規(guī)免疫組織化學(xué)染色。一抗選用多克隆抗纖維調(diào)節(jié)素抗體（1∶1 000）；用光學(xué)顯微鏡觀察切片染色情況，并記錄實驗結(jié)果。

2 結(jié)果

抗纖維調(diào)節(jié)素的多克隆抗體用于體外損傷牙周細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色，觀察種在載玻片上的牙齦成纖維細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞損傷后纖維調(diào)節(jié)素的表達。在牙周細(xì)胞損傷后第1天，創(chuàng)口邊緣向損傷區(qū)移行的牙齦成纖維細(xì)胞較強表達纖維調(diào)節(jié)素，損傷區(qū)周圍的纖維調(diào)節(jié)素表達略弱。在牙周細(xì)胞損傷后第3天，新近移行到損傷區(qū)的細(xì)胞都比損傷區(qū)周圍的細(xì)胞有更強的纖維調(diào)節(jié)素表達（圖1左）。損傷后第7天，一些細(xì)胞已經(jīng)到達損傷區(qū)域的中心，原來缺損細(xì)胞的損傷區(qū)逐漸被細(xì)胞充滿。在損傷區(qū)中心的細(xì)胞對纖維調(diào)節(jié)素的著色極強，而周圍的大多數(shù)細(xì)胞表達略弱（圖1中、1右）。纖維調(diào)節(jié)素在牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的損傷愈合中也呈現(xiàn)與牙齦成纖維細(xì)胞中類似的表達。

圖1 纖維調(diào)節(jié)素在牙齦成纖維細(xì)胞損傷愈合中的表達 ABC ×200Fig 1 Expression of fibromodulin in gingival fibroblasts during wound healing ABC ×200

3 討論

牙周損傷愈合是一個極其復(fù)雜的過程，涉及至少4種不同的結(jié)締組織，包括牙齦、牙周膜、骨和牙骨質(zhì)。在組織再生時，必然發(fā)生特定細(xì)胞向損傷區(qū)移行、細(xì)胞增殖、新的細(xì)胞外基質(zhì)充填缺損的組織等過程。牙周損傷愈合過程中的主要活動包括以下過程：損傷形成；大量生長因子和細(xì)胞因子出現(xiàn)；細(xì)胞因子和炎性因子誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞移行和增殖；新的基質(zhì)合成。

損傷的產(chǎn)生是導(dǎo)致再生的系列活動中的一個基本步驟[4]。培養(yǎng)細(xì)胞的機械損傷模型有幾種[5-7]，本研究采用的損傷模型是Klein-Soyer等[8]設(shè)計的損傷模型的改良型。該模型的優(yōu)點是：可以做出一致的圓盤形損傷區(qū)，這種損傷的范圍能使細(xì)胞培養(yǎng)相對較長的時間而不至于損傷后迅速愈合，因此有利于觀察細(xì)胞的增殖、移行。在其他模型系統(tǒng)（如反復(fù)刮擦系統(tǒng)）中，細(xì)胞移行太快，損傷在非常短的時間內(nèi)修復(fù)，很難用于定性、定量評估[9]。Lacker等設(shè)計的模型雖然沒有上述缺陷，但他們使用損傷工具做出的長條形損傷區(qū)，只能控制損傷區(qū)的寬度，很難使損傷區(qū)長度達到一致。

據(jù)研究，來自牙周膜的祖代細(xì)胞向損傷區(qū)移行、增殖和分化，最終形成牙周組織。而在損傷區(qū)，這種祖代細(xì)胞的選擇性聚居被認(rèn)為是導(dǎo)致牙周再生的關(guān)鍵[10]。從臨床水平來看，采用排除牙齦成纖維細(xì)胞的技術(shù)有助于牙周膜細(xì)胞聚居。如果不排除牙齦成纖維細(xì)胞，損傷區(qū)域的結(jié)締組織和上皮附著將會占據(jù)牙周再生的主要活動，從而影響牙周組織的再生。由此可見，本研究采用的體外損傷模型有利于幫助更好地理解和調(diào)節(jié)與牙周損傷愈合相關(guān)的復(fù)雜活動。

在損傷愈合的早期階段，蛋白多糖生產(chǎn)的重要性是不容忽視的。體內(nèi)實驗性損傷愈合模型顯示，蛋白多糖的合成比膠原合成早幾天。新形成的細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞移行的重要調(diào)節(jié)者。病灶黏附區(qū)蛋白多糖的數(shù)量分析結(jié)果也證實了蛋白多糖在早期細(xì)胞移動中起作用[11]。

纖維調(diào)節(jié)素作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖的一個成員在損傷愈合中有表達。在大鼠的皮膚損傷愈合模型中，成年鼠損傷愈合的早期，缺少纖維調(diào)節(jié)素的表達，導(dǎo)致瘢痕和纖維化形成；而在胚胎鼠損傷愈合模型中，纖維調(diào)節(jié)素的早期表達較明顯，最終導(dǎo)致無瘢痕愈合[12]。纖維調(diào)節(jié)素在人類肉芽組織的成纖維細(xì)胞中的表達明顯提高，提示這種蛋白多糖可能在牙周慢性炎癥和損傷愈合中起作用。

在體內(nèi)實驗的免疫組織化學(xué)研究中，本實驗觀察到纖維調(diào)節(jié)素在牙周損傷愈合的初期，強烈表達于移行的牙齦上皮細(xì)胞和肉芽組織，隨著愈合過程的進行，纖維調(diào)節(jié)素在牙周組織中的表達略有減弱，推測纖維調(diào)節(jié)素與牙周損傷愈合的早期階段有關(guān)[2]。從體外實驗免疫組織化學(xué)的研究結(jié)果來看，纖維調(diào)節(jié)素對新近向牙周細(xì)胞損傷區(qū)移行的牙齦成纖維細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞有強烈的表達，損傷區(qū)周圍的細(xì)胞則表達稍弱。該結(jié)果進一步證實了纖維調(diào)節(jié)素在牙周損傷愈合早期階段起作用。

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（本文編輯 湯亞玲）

Immunohistochem ical presentation of fibromodulin during wound healing of periodontal cells

QIAN Hong1,HUANG Qun2,XIAO Yin3.（1.Dept.of Pediatric Dentistry,Guangdong Provincial Stomatological Hospital,Stomatological Hospital Affiliated to Southern Medical University,Guangzhou510280,China;2.Stomatological Center, Guangdong Provincial Women and Children′s Hospital,Guangzhou510010,China;3.Queesland University of Technology,Brisbane4000,Australia）

ObjectiveTo investigate immunohistochemical presentation of fibromodulinin vitroduring wound healing of three types of periodontal cells and discuss the role of fibromodulin.MethodsCultured periodontal cells were wounded and followed by observation up to 7 days.The immunohistochemical expression of fibromodulin in periodontal cells was observed.Results Immunohistochemical localization of fibromodulin during cellular wound healing showed that newly migrating periodontal cells toward the wound area were expressed strongly for fibromodulin at day 1 after wounding;thereafter,fibromodulin expression was noted stronger in newly migrating periodontal cells localized in the central part of the wound area than those around the wound area.ConclusionThese data suggest that fibromodulin may be involved in the early events of wound healing for periodontal cells.

fibromodulin； periodontal cells； wound healing； immunohistochemistry

R 781

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2010.02.023

1000－1182（2010）02－0208-03

2009-03-15；

2009-09-22

教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金資助項目[教外司留（2005）383號]

錢虹（1968—），女，湖北人，主任醫(yī)師，博士

錢虹，Tel：020-84406578