6種云南天然藥物對口腔優(yōu)勢菌的抗菌活性測定

李艷紅 劉娟 楊麗川 張燦華 李罡

（1.昆明醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔預(yù)防兒童牙科；2.昆明醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 醫(yī)藥化學(xué)系； 3.昆明醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔修復(fù)科，云南 昆明 650031）

6種云南天然藥物對口腔優(yōu)勢菌的抗菌活性測定

李艷紅1劉娟1楊麗川2張燦華1李罡3

（1.昆明醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔預(yù)防兒童牙科；2.昆明醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 醫(yī)藥化學(xué)系； 3.昆明醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔修復(fù)科，云南 昆明 650031）

目的 測定6種云南天然藥物對口腔臨床常見優(yōu)勢菌的體外抗菌活性，從而初步確定其在口腔臨床的藥用價(jià)值。方法 采用美國國立實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的厭氧菌藥物敏感試驗(yàn)——瓊脂稀釋法，測定6種云南天然藥物對21株口腔臨床常見優(yōu)勢菌模式株、臨床分離株的體外抗菌活性，用最小抑菌濃度（MIC）表示。結(jié)果 6種藥物對21株實(shí)驗(yàn)細(xì)菌均有抗菌作用：對10株致齲菌的MIC值范圍：蘇木為5～10mg·mL-1；其他5種藥物（麗江山慈菇、滇龍膽、訶子、龍血竭、杜仲）均大于20mg·mL-1。對11株牙髓根尖周炎和牙周病的常見優(yōu)勢菌的MIC值范圍：蘇木均小于等于0.062 5mg·mL-1；訶子為10～20mg·mL-1；其他4種實(shí)驗(yàn)藥物均大于20mg·mL-1。結(jié)論 6種藥物在口腔細(xì)菌性疾病的臨床治療中具有潛在的藥用價(jià)值。

口腔優(yōu)勢菌； 抗菌活性； 天然藥物

口腔內(nèi)適宜的環(huán)境條件使許多種類的微生物在口腔內(nèi)定居、生長繁殖，構(gòu)成了復(fù)雜的口腔微生態(tài)環(huán)境。這些微生物在口腔不同的部位共棲、競爭或拮抗，與宿主口腔的健康密切相關(guān)[1]。齲病、牙周病、牙髓根尖周病是口腔常見的細(xì)菌感染性疾病，在本質(zhì)上是菌群生態(tài)失衡性疾病，需生態(tài)防治。防齲中藥在調(diào)理口腔菌群平衡方面具有其他防齲藥物不可比擬的優(yōu)勢[2]，近來受到研究者的廣泛關(guān)注。但中藥對防治牙周病、牙髓根尖周病相關(guān)研究較少。本研究通過測定6種云南天然藥物對21株口腔臨床常見致齲菌、牙髓根尖周炎和牙周病優(yōu)勢菌模式株及臨床分離株的體外抗菌活性，初步探討其是否具有防治該類口腔細(xì)菌性疾病的潛在臨床藥用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及藥物實(shí)驗(yàn)液的準(zhǔn)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物貯存液配制 將藥物研磨粉碎后，采用高壓法配制實(shí)驗(yàn)藥物儲(chǔ)存液，配制方法：稱取1 g藥物加入5mL無菌蒸餾水，在試管中混合后置高壓鍋內(nèi)，121℃、15min（藥物質(zhì)量濃度200mg·mL-1）。

1.1.2 藥物實(shí)驗(yàn)液的配制 取藥物貯存液，用無菌BHI肉湯培養(yǎng)基（OXID公司，英國）對倍稀釋，配制藥物質(zhì)量濃度呈對倍遞減的實(shí)驗(yàn)溶液：100、50、25、12.5、6.25mg·mL-1，置 4℃保存。

1.2 含藥瓊脂平皿的配制

選用BHI瓊脂（OXID公司，英國）作為實(shí)驗(yàn)瓊脂培養(yǎng)基，在革蘭陰性厭氧桿菌的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中加入維生素K1-Hemin溶液。

分別取藥物貯存液和藥物實(shí)驗(yàn)液與溫度為45～55℃的BHI（或BHI-S）營養(yǎng)瓊脂混合并立即傾注于無菌平皿中，待冷卻后備用。含藥瓊脂平皿的藥物質(zhì)量濃度分別為：20、10、5、2.5、1.25、0.625mg·mL-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株及實(shí)驗(yàn)菌液的準(zhǔn)備

1.3.1 實(shí)驗(yàn)菌株 選用口腔臨床常見的21株牙體牙髓病和牙周病優(yōu)勢菌作為本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)菌株，細(xì)菌名稱及菌株號（由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）如下： 變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）7株，其中模式株1株（ATCC 25175）、臨床分離株6株（Sm27、Sm593、Sm516、Sm29、Sm583、Sm572）；黏性放線菌（Actinomyces viscosus，A.viscosus）1株：ATCC 15987；內(nèi)氏放線菌（Actinomyces naeslundii，A.naeslundii）1株：ATCC 12104；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，L. acidophilus）1株：ATCC 4356；牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）1株：ATCC 33277；中間普雷沃菌（Prevotella intermedius，P.intermedius）1株：ATCC 25611；變黑普雷沃菌（Prevotella nigrescens，P.nigrescens）1株：ATCC32567；洛氏普雷沃菌（Prevotella loescheii，P.loescheii）1株：ATCC 15930；具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn).nucleatum）1株：ATCC 25586；產(chǎn)黑色素的革蘭陰性無芽胞厭氧桿菌臨床分離株6株：M-1、M6-7、M2-1-1、M2-7-6、M11-2、M13-7。質(zhì)控菌株為脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis B.fragilis）ATCC 25285。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)菌液的準(zhǔn)備 在BHI瓊脂表面接種實(shí)驗(yàn)菌株，置于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)（80%N2+10%CO2+10%H2）培養(yǎng)48 h，取48 h純培養(yǎng)物接種BHI肉湯并放置厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，校正菌液濃度為0.5 McFarland（每毫升1.5×108個(gè)細(xì)胞）備用。

1.4 MIC值測定

采用美國國立實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的厭氧菌藥物敏感試驗(yàn)——瓊脂稀釋法，測定麗江山慈菇、滇龍膽、蘇木、訶子、龍血竭、杜仲等6種云南天然藥物對21株口腔臨床常見優(yōu)勢菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。用細(xì)菌點(diǎn)種儀取實(shí)驗(yàn)菌液（每毫升1.5×108個(gè)細(xì)胞）后分別點(diǎn)種于不同質(zhì)量濃度的系列含藥瓊脂平皿表面，然后放置于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h后讀取MIC值結(jié)果。

2 結(jié)果

6種實(shí)驗(yàn)藥物對10株致齲菌和11株牙髓根尖周炎和牙周病優(yōu)勢菌的MIC值結(jié)果詳見表1和表2。

表1 6種實(shí)驗(yàn)藥物水溶液對10株致齲菌的M IC值/mg·m L-1Tab 1 The M IC of 6 kinds of herbs to 10 kinds of cariogenic bacteria/mg·m L-1

表2 6種實(shí)驗(yàn)藥物對11株牙髓根尖周炎和牙周病優(yōu)勢菌的M IC值/mg·m L-1Tab 2 The M IC of 6 kinds of herbs to 11 kinds of predom inant bacteria involved in pulp periapical disease and periodontitis/mg·m L-1

用蒸餾水代替實(shí)驗(yàn)藥液的陰性對照組，所有實(shí)驗(yàn)細(xì)菌均生長良好，所以實(shí)驗(yàn)藥物水溶液的MIC值可納入結(jié)果分析。從表1可見，蘇木對10株致齲菌的抗菌作用最強(qiáng)，MIC值范圍為5～10mg·mL-1，90%細(xì)菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration 90，MIC90）為5mg·mL-1。其他5種實(shí)驗(yàn)藥物對10株致齲菌的MIC值均大于20mg·mL-1。從表2可見蘇木對11株牙髓根尖周炎和牙周病優(yōu)勢菌有很強(qiáng)的抗菌作用，MIC值范圍為小于等于0.062 5mg·mL-1，藥物對MIC90為小于等于0.062 5mg·mL-1；訶子對11株優(yōu)勢菌有一定的抗菌作用，MIC值的范圍為10～20mg·mL-1；其他4種實(shí)驗(yàn)藥物對11株優(yōu)勢菌的MIC值均大于20mg·mL-1。

3 討論

3.1 關(guān)于藥物的介紹

云南地處低緯度、高海拔區(qū)域，地形地貌復(fù)雜，形成了復(fù)雜多樣的氣候類型和立體氣候的特點(diǎn)。豐富多樣的自然條件，匯集了從熱帶、亞熱帶至溫帶甚至寒帶的不同生態(tài)型的物種，最新統(tǒng)計(jì)顯示，云南中藥資源經(jīng)調(diào)查有6 559種，品種和數(shù)量均屬全國之首，并有許多特有的品種，具有中草藥資源深度開發(fā)利用的前景。本研究從產(chǎn)地在云南的原藥材、云南的獨(dú)特組方藥、云南民族藥材中，初步選取種植技術(shù)成熟、產(chǎn)量豐富、價(jià)格便宜、研究較為廣泛的40余種云南天然藥物；再在仔細(xì)閱讀文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)是否有文獻(xiàn)報(bào)道其對人體中其他部位定植的細(xì)菌有抗菌或抑菌作用，篩選出以下6種具有抗菌作用及潛在研究價(jià)值的藥物，初步探討其在口腔細(xì)菌性疾病臨床治療中的藥用價(jià)值。

3.1.1 麗江山慈菇 山慈菇為蘭科植物杜鵑蘭、獨(dú)蒜蘭和云南獨(dú)蒜蘭的干燥假鱗莖，有抗腫瘤、抗血管生成、抗菌、對乙酰膽堿受體M3的阻斷作用、對酪氨酸酶的激活等作用。研究[3]發(fā)現(xiàn)，以山慈菇為主的復(fù)方制劑對致病大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母菌等均有抗菌作用。

3.1.2 滇龍膽 龍膽為龍膽科植物龍膽、三花龍膽、條葉龍膽或堅(jiān)龍膽的干燥根及根莖，味苦、性寒，為清肝膽濕熱、瀉下焦郁火之常用中藥，具有保肝、利膽、健胃、中樞興奮、抗炎、抗菌等作用[4]。陳玉等[5]采用紙片擴(kuò)散法發(fā)現(xiàn)1 g·mL-1的龍膽草水煎劑不具有抑制變異鏈球菌的作用。

3.1.3 蘇木 蘇木為豆科植物，又名蘇方木、蘇枋、赤木、棕木、紅柴，味甘、咸、性平，除具有舒筋通絡(luò)、活血散結(jié)、鎮(zhèn)靜、祛痰、止痛、天然色素等傳統(tǒng)功效外，還具有免疫抑制、抗氧化性、抗菌、抗補(bǔ)體、抗腫瘤、抗心臟移植排斥反應(yīng)、降糖作用等活性?？咕芯堪l(fā)現(xiàn)：蘇木對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、白喉?xiàng)U菌、流感桿菌、副傷寒丙桿菌、百日咳桿菌、傷寒桿菌、副傷寒甲、乙桿菌及肺炎桿菌等有抑制作用。抗菌活性成分有高異黃酮成分和巴西蘇木素[6]。

3.1.4 訶子 訶子為使君子科植物訶子或絨毛訶子的干燥成熟果實(shí)，具有澀腸斂肺、降火利咽、抗菌、強(qiáng)心、抗氧化等作用。體外實(shí)驗(yàn)[7]證明，訶子對痢疾桿菌、綠膿桿菌、白喉?xiàng)U菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎球菌、溶血性鏈球菌、變形桿菌、鼠傷寒桿菌等均有抗菌作用，乙醇提取物的抗菌及抗真菌作用更強(qiáng)。

3.1.5 龍血竭 龍血竭有“活血之圣藥”的美譽(yù)，性平，味甘、溫、咸、平，歸心、肝經(jīng)，具有良好的活血散淤、定痛止血、抗菌、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、降血糖、抗炎及促進(jìn)表皮修復(fù)等作用?？咕芯縖8]發(fā)現(xiàn)，龍血竭對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、1053白喉?xiàng)U菌和5種常見表皮真菌有不同程度的抑制作用；抑菌活性成分為血竭樹脂中的對羥基苯甲酸乙酯等。

3.1.6 杜仲 杜仲，又名思仙、思仲、木棉等，是杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，為我國名貴滋補(bǔ)藥材，具有降壓、增強(qiáng)免疫、抗衰老、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抗腫瘤、抗菌等作用?？咕芯縖9]發(fā)現(xiàn)，杜仲對結(jié)核桿菌、福氏痢疾桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、炭疽桿菌等有抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)上述6種藥物對21株實(shí)驗(yàn)細(xì)菌均有不同程度的抗菌作用，對于防治口腔細(xì)菌性疾病具有潛在的藥用價(jià)值，值得進(jìn)一步研發(fā)。其中蘇木的抗菌作用最佳，其有效成分可能是蘇木中的高異黃酮成分和巴西蘇木素。

3.2 關(guān)于實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇21株常見的致齲菌、牙髓根尖周病和牙周病優(yōu)勢菌作為實(shí)驗(yàn)細(xì)菌，其中包括了實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較強(qiáng)的模式株9株和近期臨床分離株12株，從而使研究結(jié)果更能體現(xiàn)臨床治療中的實(shí)用價(jià)值。然而，對有明顯抗菌作用和有待進(jìn)一步探討其抗菌作用的實(shí)驗(yàn)藥物還需要擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)菌株數(shù)。

3.3 關(guān)于藥物有效成分提取方法

本實(shí)驗(yàn)對藥物有效成分的萃取方法做了初步的探討：包括用高壓萃取法、水浴浸泡萃取法和醇溶萃取法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用高壓萃取法提取的麗江山慈菇、滇龍膽、龍血竭、杜仲呈凝固狀或黏稠狀；用水浴浸泡萃取法（即稱取1 g藥物加入5mL無菌蒸餾水，在試管中混合后置80℃恒溫水浴箱中30min）提取的藥物，除麗江山慈菇呈黏稠狀外，其他藥物上清為均勻混濁液；醇溶萃取法（即稱取1 g藥物加入5mL 75%乙醇，在試管中混合后備用）配制的6種實(shí)驗(yàn)藥液則全部為均勻混濁液，但在MIC測定時(shí)，乙醇溶劑的陰性對照平板上的實(shí)驗(yàn)細(xì)菌均未生長，提示該體積分?jǐn)?shù)的乙醇液可抑制細(xì)菌生長，所以對所用乙醇體積分?jǐn)?shù)尚需探討。

3.4 實(shí)驗(yàn)藥物抗菌作用的比較

本研究發(fā)現(xiàn)這6種藥物對21株實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的抗菌作用存在差異，其中蘇木的抗菌作用最佳，其有效成分可能是蘇木中的高異黃酮成分和巴西蘇木素。蘇木對10株致齲菌的MIC值為5～10mg·mL-1，MIC90為5mg·mL-1；對11株牙髓根尖周病和牙周病優(yōu)勢菌則顯示很強(qiáng)的抗菌作用，MIC值范圍為小于等于0.062 5mg·mL-1，MIC90為小于等于0.062 5mg·mL-1；其他5種實(shí)驗(yàn)藥物中，雖然訶子對11株牙髓根尖周病和牙周病優(yōu)勢菌有一定的抗菌作用，MIC值范圍為10～20mg·mL-1，但訶子對10株致齲菌的MIC值大于20mg·mL-1。其他4種實(shí)驗(yàn)藥物：麗江山慈菇、滇龍膽、龍血竭和杜仲對所有21株實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的MIC值均大于20mg·mL-1。

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（本文編輯 湯亞玲）

Antibacterial activity determ ination of six kinds of natural herbs in Yunnan on normal oral predom inant bacteria in vitro

LI Yan-hong1,LIU Juan1,YANG Li-chuan2,ZHANG Can-hua1,LIGang3.（1.Dept.of Preventive and Pediatric Dentistry,The Affiliated Stomatology Hospital of Kunming Medical University,Kunming650031,China; 2.Dept.of Medical and Pharmaceutical Chemistry,School of Pharmocology,Kunming Medical University,Kunming,650031,China;3.Dept.of Prosthodontics,The Affiliated Stomatology Hospital of Kunming Medical University,Kunming650031,China）

ObjectiveTo determine the antibacterial activity of six kinds of natural herbs in Yunnan on normal oral predominant bacteriain vitro.MethodsAgar dilution method,the antimicrobial susceptibility testing of anaerobes which was recommended by National Committee for Clinical Laboratory Standard（NCCLs）,was used to determine the antimicrobial susceptibility of herbs to 21 kinds of oral model strains and clinical isolates.The results were expressed by minimum inhibitory concentration（MIC）.Results All six kinds of herbs were effective to the oral predominant bacteria.For the ten kinds of cariogenic bacteria,the MIC of caesalpinia sappan lignum was between 5-10mg·mL-1, and the MIC of other herbs was above 20mg·mL-1.For the eleven kinds of predominant bacteria which normally involved in pulp periapical disease and periodontitis,the MIC of caesalpinia sappan lignum was below 0.062 5mg·mL-1, and the MIC of the terminalia chebula retz was between 10-20 mg·mL-1,and the others were above 20 mg·mL-1.ConclusionThe six kinds of herbs in Yunnan could be used in treatment or prevention of oral bacterial diseases.

oral predominant bacteria； antibacterial activity； natural herb

R 780.1

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2010.02.021

1000－1182（2010）02－0199-04

2009-09-30；

2010-02-05

云南省科技廳面上基金資助項(xiàng)目（2008CD118）

李艷紅（1975—），女，湖南人，講師，碩士

李罡，Tel：13888277033