不同方法制備抗原致敏的樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞對Tca8113細(xì)胞殺傷作用的影響

郅克謙 徐燕 任文豪 高嶺 趙璐 楊勇 張引成

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔頜面頭頸腫瘤外科，陜西 西安 710004）

不同方法制備抗原致敏的樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞對Tca8113細(xì)胞殺傷作用的影響

郅克謙 徐燕 任文豪 高嶺 趙璐 楊勇 張引成

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔頜面頭頸腫瘤外科，陜西 西安 710004）

目的 探討樹突狀細(xì)胞（DCs）疫苗治療舌癌的可行性，并選擇較優(yōu)的抗原負(fù)載方式。方法 分別采用弱酸洗脫法、反復(fù)凍融法制備Tca8113細(xì)胞抗原，并分為3組：弱酸洗脫抗原組、反復(fù)凍融抗原組、對照組（不加腫瘤抗原）。從外周血單核細(xì)胞中誘導(dǎo)DCs，分離出T淋巴細(xì)胞。以不同效靶比將DCs和T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，MTT法測光密度值，計算刺激指數(shù)。DCs抗原負(fù)載后，與T淋巴細(xì)胞混合，以不同效靶比加入預(yù)先接種了Tca8113細(xì)胞的培養(yǎng)板。MTT法測光密度值，計算殺傷率。結(jié)果 2種方法體外成功地構(gòu)建了DCs疫苗，抗原致敏組與對照組比較差異顯著，且弱酸洗脫組優(yōu)于反復(fù)凍融組。DCs疫苗可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞有效的殺傷Tca8113細(xì)胞，并表現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。結(jié)論 DCs疫苗致敏T淋巴細(xì)胞能夠有效的殺傷Tca8113細(xì)胞，酸洗脫抗原沖擊致敏的DCs疫苗在舌癌的免疫治療中優(yōu)于凍融抗原。

樹突狀細(xì)胞； 舌癌； 免疫治療

以各種方式誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，已成為有效的臨床抗腫瘤治療手段。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）疫苗在惡性淋巴瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌等腫瘤的治療中取得了令人鼓舞的療效[1-2]。本研究選用舌癌Tca8113細(xì)胞系，弱酸洗脫法和反復(fù)凍融法2種方法獲得腫瘤抗原，再與同種異體外周血來源DCs混合培養(yǎng)，獲得負(fù)載不同抗原的DCs，然后將抗原負(fù)載的DCs與自體T淋巴細(xì)胞共同孵育，得到致敏的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL），與Tca8113細(xì)胞作用，檢測其對舌癌細(xì)胞的殺傷效果，探討DCs疫苗治療舌癌的可行性，并選擇較優(yōu)的抗原負(fù)載方式。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

Tca8113細(xì)胞株（口腔疾病研究國家重點(diǎn)實驗室，四川大學(xué)），人淋巴細(xì)胞分離液（天津灝陽生物科技有限公司），重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte-macrophage colonystimulating factor,rhGM-CSF）、重組人白細(xì)胞介素-4（recombinant human interleukin-4，rhIL-4）（Cytolab/Peprotech ASIA公司，美國），Bradford蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物公司），胰蛋白酶（Gibco公司，美國），AF-Ⅱ Nikon熒光顯微鏡（Nikon公司，日本），Biotrak-Ⅱ酶聯(lián)免疫分光光度儀（Amersham Biosciences公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 DCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定及保存 健康志愿者肘靜脈取血40mL，加入250 U·mL-1肝素溶液4mL，等體積PBS（pH 7.2～7.4）稀釋。按分離液與抗凝血2∶1的體積比加入淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心。取界面層細(xì)胞，置于50mL離心管中，PBS懸浮細(xì)胞,離心（1 500 r·min-1，10min）洗細(xì)胞3次。將洗滌后的細(xì)胞重懸于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升2×106個。加入24孔培養(yǎng)板，每孔1mL，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h。每孔重新加入含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基1mL，并加入rhGM-CSF50μg·L-1，rhIL-4 40μg·L-1，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。另設(shè)1孔為對照孔，不加任何細(xì)胞因子。每3 d半換液1次，并補(bǔ)充培養(yǎng)液和細(xì)胞因子，使細(xì)胞因子終濃度同上。于培養(yǎng)第7天獲得DCs。

培養(yǎng)第7天的DCs，取1孔細(xì)胞懸液，離心，PBS洗滌（1 000 r·min-1，每次5min），涂附于預(yù)先用多聚賴氨酸包被的載玻片上，自然干燥，4℃冷丙酮固定10min，置于PBS中振洗5min，濾紙吸干，滴加過氧化氫酶阻斷劑10min，正常羊血清封閉5min，滴加一抗CD1a抗體置濕盒內(nèi)，37℃孵育2 h，滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育30min，滴加鏈親和素過氧化物酶液，37℃孵育20 min。每步驟后均用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，干燥后中性樹膠封片。檢測DCs的特征性表型CD1a。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；普通光鏡觀察經(jīng)蘇木精-伊紅染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色的DCs形態(tài)；透射電鏡觀察細(xì)胞超微形態(tài)。

1.2.2 舌癌細(xì)胞不同形式腫瘤抗原的制備 弱酸洗脫法：Tca8113細(xì)胞置于含10%FBS的RPMI 1640中培養(yǎng)5 d，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，用RPMI1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1離心5min，PBS洗細(xì)胞2次，加入10mL弱酸提取液（0.13mol·L-1Citrate acid，0.066mol·L-1Na2HPO4，調(diào)節(jié)pH至3.3，細(xì)胞密度為每毫升1×107個）混勻，2 000 r·min-1離心5min，吸取上清，即為抗原肽洗脫液；將其加入到透析袋中扎緊袋口，放入約3 000mL雙蒸水中，攪拌，4 h后換雙蒸水，至pH值大于7.2，置入超濾離心管，4 000 r·min-1，20min濃縮液體，加入PBS 10mL溶解，離心后經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存。

細(xì)胞凍融法：Tca8113細(xì)胞置于含10%FBS的RPMI1640中培養(yǎng)7 d，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，用RPMI1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1離心5min，PBS洗細(xì)胞2次，PBS調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×107個，放入離心管內(nèi)，封口，于43℃水浴中靜置30min，置于-80℃冰箱中快速冷凍20min，再迅速放入37℃水浴中解凍10min，反復(fù)4次，2 000 r·min-1離心20min，取上清液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌后即為腫瘤凍融抗原，分裝，4℃保存。

1.3 自體T淋巴細(xì)胞反應(yīng)

培養(yǎng)至7 d的DCs細(xì)胞，RPMI1640調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×106個，移入12孔培養(yǎng)板，每孔2mL，部分孔內(nèi)加入凍融抗原0.1mL，部分加入酸洗脫抗原肽0.1mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對照組不加抗原。絲裂霉素C（25μg·mL-1），37℃，5%CO2孵育1 h后，用含10%FBS的RPMI1640充分洗滌去除絲裂霉素C，并補(bǔ)充細(xì)胞因子，使rhGM-CSF終濃度為50μg·L-1，rhIL-4為40μg·L-1。按DCs與T細(xì)胞分別為1∶10、1∶50、1∶100的比例將DCs和T細(xì)胞接種于96孔圓底培養(yǎng)板，T細(xì)胞密度達(dá)到每毫升1×104個，每孔200μL，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h。實驗分組：A組為凍融抗原致敏DCs加T細(xì)胞，B組為酸洗脫抗原致敏DCs加T細(xì)胞，C組為實驗對照組，未致敏DCs加T細(xì)胞。A、B、C組按效靶比為1∶10、1∶50、1∶100的比例各自分為A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3組。測定每孔的光密度值，計算刺激指數(shù)。

1.4 致敏DCs疫苗對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

上述經(jīng)DCs致敏的T淋巴細(xì)胞以25∶1、50∶1、100∶1的比例加入預(yù)先接種了Tca8113細(xì)胞的96孔平底培養(yǎng)板中，總體積為200μL，不足的用10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基補(bǔ)齊，37℃，5%CO2培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)48 h結(jié)束前的4 h，吸棄懸浮細(xì)胞，每孔重新加培養(yǎng)基0.2mL，MTT液（5 g·L-1）20μL。37℃，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)，于培養(yǎng)結(jié)束時，吸棄每孔中的上清液，加入DMSO 150μL，微量振蕩器振蕩10min，以徹底溶解晶體。用酶標(biāo)儀檢測各孔的光密度值。A組：T細(xì)胞加酸洗脫抗原肽致敏DCs加Tca8113，B組：T細(xì)胞加凍融瘤細(xì)胞抗原致敏DCs加Tca8113，C組：T細(xì)胞加未致敏DCs加Tca8113細(xì)胞。A、B、C組按25∶1、50∶1、100∶1的效靶比分為A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3組，每組設(shè)3個復(fù)孔，光密度值以3孔均值表示，計算殺傷率。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)的DCs形態(tài)

外周血單核細(xì)胞貼壁3 h后獲得黏附細(xì)胞，加入細(xì)胞因子，培養(yǎng)1～2 d見貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，懸浮生長細(xì)胞數(shù)量增多，呈單層均勻分布。培養(yǎng)3～4 d，見細(xì)胞呈積聚趨勢，簇狀生長，形成大小不等的DCs細(xì)胞集落，形態(tài)較不規(guī)則，同時DCs細(xì)胞表面有許多微絨毛樣突起，部分細(xì)胞突起較大。培養(yǎng)至第7天，可見到大量具有樹突狀突起的懸浮細(xì)胞。對照孔內(nèi)細(xì)胞絕大部分呈貼壁生長狀態(tài)，呈明顯的星狀或條索狀。培養(yǎng)至第7天的樹突狀細(xì)胞，加入Tca8113細(xì)胞凍融抗原或者酸洗脫抗原繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，鏡下觀察可見細(xì)胞變大，懸浮細(xì)胞數(shù)量增加，呈簇狀生長。蘇木精-伊紅染色后普通光鏡下觀察，細(xì)胞體積較大，近似圓形，細(xì)胞周圍有毛刺樣突起，胞質(zhì)嗜酸染色，核較大且略偏一側(cè)，著色較深，大部分為圓形，有時呈顯葉狀或短桿狀。透射電鏡下見樹突狀細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞表面有許多微絨毛樣的突起，個別細(xì)胞表面有較粗大的突起。細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核質(zhì)比不高，核膜迂曲明顯，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，常染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)少，核仁可見，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核糖體豐富，線粒體短小，數(shù)量較多，少量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分散在細(xì)胞質(zhì)中。

2.2 表型鑒定

免疫組化染色后表面呈褐色的為陽性細(xì)胞，可見CD1a陽性表達(dá)于DCs胞膜上。

2.3 自體T淋巴細(xì)胞反應(yīng)

效靶比為1∶10時，A1、B1、C1組刺激指數(shù)值的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），大小關(guān)系為A1＞B1＞C1。效靶比為1∶50時，A2、B2與C2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；A2、B2之間無差異（P＞0.05）。效靶比為1∶100時，A3、B3、C3組之間無差異（表1）。以上數(shù)據(jù)說明經(jīng)腫瘤凍融抗原或酸洗脫抗原致敏的DCs均可刺激T淋巴細(xì)胞增殖，未經(jīng)抗原致敏的DCs不能刺激T淋巴細(xì)胞的增殖?？乖旅舻腄Cs刺激T細(xì)胞增殖能力，酸洗脫組大于凍融組，但效靶比為1∶100時，2組雖都有刺激作用，但作用較小?？乖旅舻腄Cs刺激T細(xì)胞增殖的作用隨效靶比的增加而增大。

表1 各組細(xì)胞的刺激指數(shù)值（n=3，±s）Tab 1 Stimulation index values of each group（n=3，±s）

表1 各組細(xì)胞的刺激指數(shù)值（n=3，±s）Tab 1 Stimulation index values of each group（n=3，±s）

分組刺激指數(shù)值1∶10 1∶50 1∶100 A 8.438±1.318 5.647±0.666 1.910±0.184 B 7.361±0.832 5.474±0.644 1.562±0.264 C 1.373±0.161 1.223±0.146 1.123±0.094

2.4 DCs介導(dǎo)CTL對Tca8113細(xì)胞的殺傷作用

效靶比為25:1時，A1、B1組殺傷率均大于C1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），A1、B1之間殺傷率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。效靶比為50∶1、100∶1時，A、B、C組之間殺傷率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），大小關(guān)系為A＞B＞C。不同效靶比時，A1、A2、A3之間殺傷率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），A1＜A2＜A3；B1、B2、B3比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），B1＜B2＜B3，C1小于C2、C3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），C2、C3組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。說明經(jīng)Tca8113腫瘤細(xì)胞抗原致敏的樹突狀細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞有效的殺傷Tca8113細(xì)胞。酸洗脫組比凍融組殺傷率高。未經(jīng)Tca8113腫瘤細(xì)胞抗原致敏的樹突狀細(xì)胞亦可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞殺傷Tca8113細(xì)胞，但殺傷率較低，與抗原致敏組比較差異顯著。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷Tca8113細(xì)胞作用隨效靶比的增加而增大。

表2 CTL對Tca8113細(xì)胞殺傷作用（n=3，±s）Tab 2 Killing effect on Tca8113 cell by CTL（n=3，±s）

表2 CTL對Tca8113細(xì)胞殺傷作用（n=3，±s）Tab 2 Killing effect on Tca8113 cell by CTL（n=3，±s）

分組 殺傷作用25∶1 50∶1 100∶1 A 42.06±1.34 60.67±2.51 83.27±2.02 B 39.71±2.67 51.26±2.36 70.86±1.95 C 28.83±2.31 36.12±4.30 36.31±3.92

3 討論

腫瘤抗原刺激樹突狀細(xì)胞的成熟和鑒定是樹突狀細(xì)胞疫苗研究的關(guān)鍵。Berthier等[3]認(rèn)為DCs的培養(yǎng)分為啟動培養(yǎng)和分化培養(yǎng)2個階段：應(yīng)用粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白介素-4 7 d，臍血、成人骨髓或外周血中的造血干細(xì)胞以及外周血中單核細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的DCs；應(yīng)用成熟誘導(dǎo)因子促使DCs成熟。本實驗中，外周血單核細(xì)胞用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)7 d后，用Tca8113細(xì)胞的酸洗脫或者凍融抗原作用，細(xì)胞體積增大，樹突狀突起更加明顯，且能夠顯著刺激初始型T淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)針對Tca8113細(xì)胞特異性的CTL殺傷作用，表明所誘導(dǎo)的DCs攝取抗原后具有較強(qiáng)的抗原提呈作用，具有成熟DCs的典型特征及功能。筆者認(rèn)為在細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4的持續(xù)刺激下，DCs可能隨著吞噬或胞飲抗原后分化成熟，對外源性抗原，DCs通過交叉抗原提呈的途徑，即使用抗原加工的旁路途徑使外源性抗原經(jīng)由MHC-I類途徑提呈給T淋巴細(xì)胞，DCs內(nèi)的MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子都可與外源性抗原肽結(jié)合并提呈，而且，DCs對抗原的這種交叉提呈可能不需要DCs成熟信號的刺激。DCs表面表達(dá)豐富的免疫分子，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)能用于其鑒定的非常理想的特異性分子標(biāo)記[4]。因此，目前鑒定DCs通常是通過細(xì)胞形態(tài)、組合性細(xì)胞表面標(biāo)志以及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中刺激初始型T淋巴細(xì)胞增殖能力等來綜合判斷[5]。本實驗培養(yǎng)的DCs有典型的細(xì)胞形態(tài)及抗原攝取、加工、提呈能力，且能刺激初始型T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CTL特異性殺傷腫瘤效應(yīng)，認(rèn)為誘導(dǎo)出了成熟狀態(tài)的DCs。通過對其表面不同時期表達(dá)的各種細(xì)胞分子進(jìn)行分析，探討抗原致敏的成熟DCs激活并刺激初始型T淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)特異性CTL腫瘤殺傷效應(yīng)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

目前大多數(shù)腫瘤（包括舌癌）尚未能明確鑒定和獲取腫瘤相關(guān)抗原或特異性抗原，而且單一抗原的免疫攻擊可能無法殺傷腫瘤，腫瘤易于產(chǎn)生針對單一抗原的免疫逃逸。全細(xì)胞腫瘤抗原刺激樹突狀細(xì)胞能避免腫瘤抗原多肽刺激存在的某些不足，如無需明確腫瘤抗原，可能有多種不同的腫瘤抗原沖擊樹突狀細(xì)胞，從而誘導(dǎo)針對不同抗原決定簇的CTL克隆等。利用反復(fù)凍融法、弱酸洗脫法和超聲破碎法提取的水溶性蛋白作為腫瘤抗原，具有多種抗原表位，更有利于對腫瘤細(xì)胞的免疫攻擊。有學(xué)者通過免疫組化法分析口腔鱗癌中DCs表型認(rèn)為，在口腔鱗癌組織中及頸部引流區(qū)淋巴結(jié)內(nèi)的DCs，其浸潤程度下降并存在功能成熟障礙。因此，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性HLA-Ⅰ類抗原分子的表達(dá)和提呈對包括舌癌在內(nèi)的惡性腫瘤的治療是可行的。此外，細(xì)胞性腫瘤抗原易于獲取和制備，雖理論上有誘發(fā)自體免疫性疾病的風(fēng)險，但在臨床研究中到目前為止并未發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的自體免疫反應(yīng)，因而用腫瘤細(xì)胞全細(xì)胞抗原致敏DCs有較大的臨床應(yīng)用潛力。

本研究凍融抗原負(fù)載DCs組刺激初始型T淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)和誘導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)明顯強(qiáng)于未負(fù)載腫瘤抗原的DCs組，與王志勇等[6]的研究結(jié)果相一致。比較2種抗原致敏的DCs誘導(dǎo)CTL對舌癌細(xì)胞體外殺傷作用的大小，酸洗脫組大于凍融組（P＜0.01）?？赡茉驗椋簝鋈诜ū人嵯疵摲ㄔ谙嗤瑪?shù)量細(xì)胞中提取的抗原蛋白量大，但含有大量的雜蛋白，腫瘤抗原僅占其中的一部分，因而抗原性差。另外，凍融抗原組中可能存在抑制細(xì)胞免疫的成分，也造成了細(xì)胞毒效應(yīng)的下降。凍融過程中，有些蛋白可能分解不徹底，相對分子質(zhì)量過大會不利于DCs攝入和處理抗原。弱酸洗脫法可洗脫絕大部分細(xì)胞膜表面與MHC-Ⅰ類分子相結(jié)合的抗原肽，而對與MHC-Ⅱ類分子和其他非MHC結(jié)合的抗原無作用，也不會引起多肽結(jié)構(gòu)改變，使酸洗脫物成分相對單一[7]。因此，以弱酸洗滌Tca8113細(xì)胞的方法獲取的腫瘤抗原能夠保留其特異性。弱酸洗脫法雖然只獲得MHC-Ⅰ類分子肽，不含有MHC-Ⅱ類抗原肽，但由于DCs高表達(dá)MHC-Ⅰ類分子和共刺激分子、黏附分子，在體外可以不必需要CD4+T細(xì)胞的輔助直接誘導(dǎo)CTL的生成。

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（本文編輯 湯亞玲）

Killing effect of cytotoxicty Tlymphocyte primed by two different methods preparation of dendritic cells pulsed with antigen on Tca8113 cells in vitro

ZHI Ke-qian,XU Yan,REN Wen-hao,GAO Ling,ZHAO Lu, YANG Yong,ZHANG Yin-cheng.（Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatological Hospital,Xi′an Jiaotong University,Xi′an710004,China）

ObjectiveTo study the feasibility of dendritic cells（DCs）vaccine on the therapy of tongue carcinoma and find the better way of antigen load.MethodsThe antigen peptides of Tca8113 cells were obtained by acid eluted technique and repetitive freeze thaw method.Separating T cell and inducing dendritic cells were obtained from human peripheral blood monocyte.Divided into three groups:Weak acid elution method antigen group,anti-freezethaw method antigen group,and the control group（without tumor antigen）.T cells and DCs were mixed to culture by different effector-target ratio.Using MTT assay measured the quantities of absorbance and calculated stimulation index.Dendrtic cells pulsed with antigen were mixed with T cells by different effector-target ratio.MTT assay was used to measure the quantities of absorbance and calculate killing rate.Results DCs vaccine was constructed successfully.DCs vaccine can induce T lymphocytes to kill Tca8113 cells and display the dose-effect relationship.There was significant difference among the three groups.The acid eluted and repetitive freeze thaw groups were better than the control group.The acid eluted group was better than repetitive freeze thaw group.ConclusionDCs vaccine can induce T lymphocytes to kill Tca8113 cells.The antigen peptides obtained by acid eluted technique is better than repetitive freeze thaw method in immunotherapy of tongue cancer.

dendritic cell； tongue cancer； immunotherapy

R 739.8

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2010.02.020

1000－1182（2010）02－0195-04

2009-04-02；

2009-07-27

陜西省科技攻關(guān)資助項目[2006k09-G3（5）和2009k17-03]；西安市科技計劃資助項目[SF09030（4）]

郅克謙（1968—），男，新疆人，副教授，博士

郅克謙，Tel：029-81015479