一氫核磁共振的血漿代謝組學(xué)分析維生素B12對地塞米松誘導(dǎo)腭裂小鼠的阻抑作用

吳曉華 黃瀚 徐濱 周京琳 孔祥麗 石冰 黃靜 李偉

（1.口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學(xué)；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院 天然藥物學(xué)系，四川 成都 610041）

一氫核磁共振的血漿代謝組學(xué)分析維生素B12對地塞米松誘導(dǎo)腭裂小鼠的阻抑作用

吳曉華1黃瀚1徐濱1周京琳1孔祥麗1石冰1黃靜2李偉1

（1.口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學(xué)；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院 天然藥物學(xué)系，四川 成都 610041）

目的 采用基于一氫核磁共振（1H-NMR）的代謝組學(xué)方法研究使用維生素B12后，阻抑本已誘發(fā)的唇腭裂發(fā)育早期過程的變化，并評估其可行性。方法 選取對照組和實驗組各12只懷孕17.5 d的C57BL/6J雌鼠，分別是僅注射維生素B12的孕鼠和注射維生素B12后再注射過量地塞米松引起腭裂的孕鼠，處理動物的血漿樣本，并且觀察B12對腭裂產(chǎn)生率的的影響。利用核磁共振技術(shù)檢測血漿內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物，通過主成分分析方法（PCA）確定代謝物成分的變化。結(jié)果 根據(jù)2組腭裂是否發(fā)生，PCA得分散點圖產(chǎn)生了顯著的差別。結(jié)論 核磁共振的代謝組學(xué)方法是一種可行和有效的方法，可以深入探索唇腭裂的發(fā)病機制，并且為以后研究維生素B12的代謝機制奠定了基礎(chǔ)。

代謝組學(xué)； 腭裂； 維生素B12

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后，系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，也是目前組學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。代謝組學(xué)是通過考察生物體系受到內(nèi)部或外部刺激或擾動后（如某個特定基因變異或環(huán)境變化），而導(dǎo)致的基因表達、蛋白合成變化而引起的其代謝產(chǎn)物的變化或代謝產(chǎn)物隨時間的變化，來研究生物體系代謝途徑的一種技術(shù)[1]?；诤舜殴舱瘢╪uclear magnetic resonance，NMR）的代謝組學(xué)技術(shù)是目前研究和應(yīng)用較多的一種，可利用高分辨率的NMR技術(shù)測定生物體液樣本[1-2]，得到的海量數(shù)據(jù)通過模式識別和主成分分析（principal component analysis，PCA）[3-4]提取出代謝特征及其相關(guān)的內(nèi)源性小分子代謝物組成分變化規(guī)律，建立相關(guān)代謝譜圖，從整體上闡釋機體的代謝變化，以及與特性變化之間的聯(lián)系，并將這些信息與相關(guān)的病理生理過程結(jié)合起來。

唇腭裂（cleft of lip with or without palate，CLP）是人類最常見的先天性畸形之一，群體發(fā)病率約為l‰～2‰，發(fā)病率具有地區(qū)差異性，在中國其發(fā)病率高達1.82%。其病因非常復(fù)雜，目前傾向認(rèn)為是由多種基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。基因、環(huán)境之間的相互作用也受到廣泛關(guān)注，包括母親吸煙、飲酒、服用抗癲癇藥物、止吐藥物、孕前孕期服用維生素、母親的新陳代謝情況和接觸農(nóng)藥等。CLP病因?qū)W的研究為其預(yù)防和治療提供了思路，孕期的保健對預(yù)防和降低唇腭裂的發(fā)生具有重要意義。

維生素B12（vitamin B12，簡稱B12）是水溶性維生素，又稱鈷胺素，是一組有鈷結(jié)合咕啉環(huán)的紅色類咕啉化合物的總稱，是維持人體正常代謝和機能不可缺少的一種微量營養(yǎng)素。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，B12缺乏與出生缺陷、巨幼紅細(xì)胞性貧血、神經(jīng)管畸形等不良妊娠結(jié)局及乳腺癌等的發(fā)生有關(guān)，并嚴(yán)重影響到器官生長發(fā)育，尤其對未出生的胎兒。

近來，地塞米松誘導(dǎo)小鼠腭裂的動物模型已成為研究腭裂病因、發(fā)病機制及治療的重要工具[7-8]。本實驗的目的就是利用代謝組學(xué)的新方法，以C57BL/6J小鼠為模型，研究在地塞米松引起小鼠胚胎致畸過程中，維生素類藥物B12對母鼠血漿內(nèi)代謝物組成的影響，研究唇腭裂的機制和預(yù)防方法，并為孕期服用維生素預(yù)防唇腭裂的原理開辟新途徑。

1 材料和方法

1.1 動物的飼養(yǎng)、建模與樣本采集

成年C57BL/6J小鼠：雄性20～25 g；雌性16～20 g，購自四川大學(xué)實驗動物中心。動物自由攝食飲水，雌雄分籠飼養(yǎng)于IVC級動物房7 d以適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)室條件為：光照12 h，黑暗12 h；室溫20～22℃；相對濕度30%～40%。第8天，以每籠雌雄2∶1比例合籠，共計30籠。

于每日交配的中點（8∶30 am），檢查各籠雌鼠陰道，如發(fā)現(xiàn)精栓，則初步認(rèn)為此鼠受孕，稱重、做標(biāo)記，并記為孕第0天（emergency 0，E0），放入空籠飼養(yǎng)以待觀察。認(rèn)真核對記錄日期，對E9～E10的雌鼠再次稱重，如體重未明顯增加，則認(rèn)為假孕，重新合籠；如體重增加2 g以上則確定懷孕，隨機分配進入對照組和實驗組，每組累積12只，對照組于E9～E11的15∶00 pm連續(xù)3 d腹腔注射B125mg·kg-1，實驗組也于E9～E11的15:00 pm連續(xù)3 d腹腔注射B125mg·kg-1，另外于E10～E12的10:00 am連續(xù)3 d腹腔注射地塞米松6mg·kg-1。

E17.5 d，2組孕鼠分別稱重后處死并獲取血漿樣本，置于內(nèi)含100μL左右鋰-肝磷酯抗凝劑的容器中，并迅速在3 000 g下低速離心10min，提取的上清液再于30 000 g下高速離心10min，2次提取上清。經(jīng)梯度離心后，除去大分子不溶性物質(zhì)而剩余小分子水溶性物質(zhì)[9]，貯藏在-80°C冰箱中以備核磁檢測使用。

剝離每只孕鼠的胚胎，逐個剪下腭胚突。正常情況下，孕17.5 d的胚胎腭胚突已經(jīng)融合[10]，在20倍體視顯微鏡下可清晰觀察到其融合情況，記錄每只孕鼠發(fā)生腭裂的胚胎數(shù)與總胚胎數(shù)并照片，用來作后期統(tǒng)計分析。

1.2 孕鼠血漿的基于—氫核磁共振（1H-nuclear ma-

gnetic resonance，1H-NMR）圖譜采集

凍存的血漿樣本于37℃水浴中融化，提取其中的200μL，并加入300μL重水，形成500μL混合液后注入5mm核磁管，多次混合均勻。

使用Bruker AVⅡ-600MHz超導(dǎo)傅立葉變化核磁共振波譜儀（Biospin公司，德國），在600.13MHz（周圍探針溫度27℃）和5mm PATXI探針條件下，調(diào)用一維的弛豫時間編輯（carr-purcell-meiboomgill，CPMG）脈沖序列，采用預(yù)飽和方式抑制水峰，所取參數(shù)參照Zhou等[11]研究。經(jīng)檢測得到的自由感應(yīng)衰減（free induction decay，F(xiàn)ID）信號經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)為一維的1H-NMR譜圖。以1.26×10-6位置處的乳酸定標(biāo)，使用TopSpin 1.3（Biospin公司，德國）軟件進行相位和基線校正。

1.3 1H-NMR數(shù)據(jù)處理和PCA分析

使用MestReC（4.8.1.1版本）軟件，對圖譜的0～9×10-6區(qū)域，按每段為0.04×10-6進行分段積分，同時排除以溶劑峰為中心的部分。將由此導(dǎo)出的所有積分?jǐn)?shù)據(jù)分組和排序，用Excel文件格式保存。先將2組積分值標(biāo)準(zhǔn)化，再使用SIMCA-P11.0軟件（Umetrics AB公司，瑞典）將所得數(shù)據(jù)進行PCA統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理2組孕鼠的胚胎腭裂發(fā)生率。

2 結(jié)果

2.1 2組孕鼠胚胎唇腭裂發(fā)生率及χ2檢驗

2組腭胚突發(fā)育情況見圖1。計算2組樣本的腭裂發(fā)生率的檢驗統(tǒng)計量：χ2=8.02，得出的結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.005），說明實驗組的腭裂發(fā)生率高于對照組（表1）。

表1 2組胚胎腭裂發(fā)生率的比較Tab 1 Comparison of incidence of cleft of palate in the embryos between two groups

2.2 2組孕鼠血漿1H-NMR圖譜和PCA分析結(jié)果

圖2所示為對照組和實驗組血漿的一維1H-NMR譜圖。它是以血漿中各種物質(zhì)的氫原子作為此物質(zhì)的標(biāo)志，不同位移代表了不同的物質(zhì)，且信號強弱反映出該物質(zhì)濃度的大小。

圖2 2組血漿的1H-NMR圖Fig 2 1H-NMR spectras of plasma from two groups

PCA是雙線性的分解作用和未經(jīng)監(jiān)控的方法，能夠用于檢查原始數(shù)據(jù)和降低其到合適的信息內(nèi)容量，即降低復(fù)雜性。PCA通過2D或3D圖譜[3，12]的形式表達了原始的n維變化。本實驗選取對1H-NMR譜變化影響最大的2個PC值，作PCA得分散點圖（圖3）。圖中顯示2組樣本所代表的主成分積分值，位于（95%可信區(qū)間）4個區(qū)域內(nèi)；但并非確切的以2組不同分組劃分，而是以直線所示左右區(qū)域劃分，左邊代表實驗組中發(fā)生腭裂的5個樣本，右邊代表對照、實驗組中未發(fā)生腭裂的共計19個樣本；直線兩邊的樣本之間并無重大交叉和重疊，這說明發(fā)生腭裂樣本與未腭裂樣本之間的代謝物組譜存在顯著的差異，血漿的代謝組學(xué)分析能夠較好地反映出來。

圖3 2組血漿的PCA得分散點圖Fig 3 PCA-score plot of plasma from two groups

3 討論

本實驗為代謝組學(xué)的探索性研究，主要探討利用代謝物組1H-NMR模式識別的方法，來體現(xiàn)致畸動物模型在維生素B12拮抗劑的保護作用下，其妊娠過程中血漿早期代謝物組的變化以及B12的代謝產(chǎn)物。初步結(jié)果表明，此分析方法能夠區(qū)分2組，且代謝組成存在顯著差異。

首先，驗證了B12對胚胎腭裂實驗小鼠的保護作用。唇腭裂的機制研究[13]表明，孕婦孕期攝取一定劑量的B12，能夠有效降低后代胎兒唇腭裂的發(fā)生率。根據(jù)上述研究，本實驗采用5mg·kg-1的劑量，并選擇正常腭胚突已完成融合的孕17.5 d[10]做直觀形態(tài)學(xué)檢查來驗證致畸效果，并與徐濱等[14]之前研究的地塞米松致畸作用的腭裂率作比較，可以認(rèn)為實驗組的腭裂發(fā)生率低于地塞米松組，結(jié)果顯示實驗組的腭裂發(fā)生率已從徐濱等的20%降低到10%左右，且低于地塞米松組，由此證明了其保護作用，并可進一步利用代謝組學(xué)方法分析B12的代謝物組。

其次，證明了存在代謝組差異并進行分析。一些平行文獻[11，15]證明了NMR和MS光譜學(xué)數(shù)據(jù)分析的化學(xué)計量學(xué)方法的有效性和可信性。也有大量有關(guān)核磁數(shù)據(jù)的分析，說明模式識別分析和復(fù)合變量統(tǒng)計是分組的有效模型，并發(fā)現(xiàn)了疾病組和對照組[16]的關(guān)系。本實驗采用PCA方法，將2組樣本復(fù)雜而龐大的代謝物組信息進行數(shù)學(xué)降維，再進一步分析處理這些信息，得到直觀和形象的PCA得分散點圖，可清晰地觀察到腭裂個體與正常個體的差別。

另外，從實驗結(jié)果可看出，雖然實驗組與腭裂組胚胎腭裂率有差別，但不具有統(tǒng)計學(xué)差異；此外實驗組與對照組胚胎腭裂率也有顯著差別，仍然比對照組高出許多，說明藥物的保護作用不夠強烈，由此推斷出5mg·kg-1劑量可能偏低還不夠準(zhǔn)確，需深入研究以探明能夠完全抑制腭裂的合適劑量。

從2組主成分分析圖可看出，并非以實驗組和對照組區(qū)分，而是以是否發(fā)生腭裂區(qū)分，證明了此方法可建立起較好的腭裂模型。發(fā)生腭裂的5個樣本中具有其他樣本沒有的唇腭裂標(biāo)志代謝物，而未發(fā)生腭裂的19個樣本也分為對照組12個樣本和實驗組7個樣本，可反映出B12作用后代謝物組的變化。

對藥物作用機制的相關(guān)研究表明，B12作為一種輔酶，影響DNA的表達，多種脂類和蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致代謝物組的改變。已探索的生理功能有：1）作為甲基轉(zhuǎn)移酶的輔因子，參與蛋氨酸、胸腺嘧啶等的合成，因此B12可促進蛋白質(zhì)的生物合成，缺乏時影響嬰幼兒的生長發(fā)育。2）保護葉酸在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移和貯存。有研究[17]表明，孕婦懷孕早期必須保證足夠的葉酸鹽，而補充葉酸可降低早產(chǎn)率和提高嬰兒出生重量；動物實驗[17]也表明，妊娠的9～11 d期間加入反代謝物后引起的葉酸缺乏導(dǎo)致90%大鼠唇裂；另有動物研究[18]表明，葉酸和B6、B12復(fù)合維生素的加入可降低單獨的唇裂或腭裂。B12的加入可能促進了葉酸的產(chǎn)生和代謝，從而促進了腭胚突的正常發(fā)育，真正起到保護劑的作用。

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（本文編輯 湯亞玲）

Analyzing the inhibition of vitam in B12to dexamethasone-induced palatognathous mouse using1H-nuclear magnetic resonance based metabonom ics method

WU Xiao-hua1,HUANG Han1,XU Bin1,ZHOU Jing-lin1,KONG Xiang-li1,SHI Bing1,HUANG Jing2,LIWei1.（1.State Key Laboratory of Oral Diseases,Sichuan University,Chengdu610041,China;2.Dept.of Natural Medicine,West China College of Pharmacy,Sichuan University, Chengdu610041,China）

ObjectiveMetabonomic analysis has been increasingly used to monitor metabolic abnormalities in cells and their micro-environment in order to detect the biomarkers recently.This study evaluated the feasibility of applying1H-nuclear magnetic resonance（1H-NMR）based metabonomic method to detect the differences of the early development of cleft palate in the plasma from control group and experimental group.MethodsPregnant mice（inbred C57BL/6J strain）with vitamin B12injected only were assigned as the control group,pregnant mice with excessive Dex,injected after vitamin B12as the experimental group,each group includes 12 mice.And the effect of B12to rate of cleft palate was observed.The technology of nuclear magnetic resonance（NMR）was used to detect the endogenous small molecule metabolites.Finally,changes of metabolites ingredients were ascertained by using the method of principal component analysis（PCA）.Results There was significant difference in PCA scores plot between the two groups according to whether cleft palate occured.ConclusionThe1H-NMR based metabonomic approach might be used as a feasible and efficient method for a deep exploration of the pathogenesis of cleft lip and palate and an early exploration of the mechanism of vitamin B12.

metabonomics； cleft palate； vitamin B12

R 780.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2010.03.21

1000－1182（2010）03－0311-04

2009-11-08；

2010-03-13

教育部科學(xué)技術(shù)研究重大基金資助項目（307022）

吳曉華（1986—），女，山西人，碩士

李偉，Tel：028-85503494