植物耐鹽基因工程研究進(jìn)展

化 燁，才 華，柏 錫，李 勇，紀(jì) 巍，季佐軍，朱延明

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

全世界有超過(guò)800萬(wàn)hm2的土地受到鹽害的影響，其數(shù)量占到世界總耕地面積的6%。由于過(guò)度開荒和灌溉，相當(dāng)大比例的農(nóng)業(yè)用地開始鹽漬化，預(yù)計(jì)在未來(lái)25年內(nèi)，將會(huì)有30%的耕地流失，到21世紀(jì)中期這個(gè)數(shù)字將會(huì)達(dá)到50%[1]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)教科文組織和糧農(nóng)組織不完全統(tǒng)計(jì)，全世界鹽堿地的面積為9.5438億hm2，其中我國(guó)為9913萬(wàn)hm2。我國(guó)堿土和堿化土壤的形成，大部分與土壤中碳酸鹽的累積有關(guān)，因而堿化度普遍較高，嚴(yán)重的鹽堿土壤地區(qū)植物幾乎不能生存[2]。而通過(guò)傳統(tǒng)育種的方法來(lái)提高作物的耐鹽性能夠獲得的效果是非常有限的，這主要由于植物的耐鹽性在分子及生理水平上都是由復(fù)雜的機(jī)制來(lái)調(diào)控的[3]。在分子水平上，植物的耐鹽性通常具有多基因性狀的特點(diǎn)，而在生理水平上，鹽土植物和具低耐鹽性的植物也顯示出很大范圍的適應(yīng)性，這給傳統(tǒng)育種工作帶來(lái)很大的困難。基因工程技術(shù)通過(guò)改變一個(gè)或幾個(gè)基因的活性來(lái)提高植物的耐鹽性，它是在基因水平上提高植物耐鹽性，更具有精確性和穩(wěn)定性，提高了育種的高效性，極大地加快了育種速度，對(duì)于我們了解耐鹽植物復(fù)雜的性狀以及耐鹽機(jī)制也是非常必要的。隨著分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)的日趨成熟和迅猛發(fā)展，通過(guò)基因工程手段改良作物的耐鹽性已經(jīng)受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注和重視。如何挖掘耐鹽基因和培育耐鹽優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物將是耐鹽分子育種的主要任務(wù)。本文就耐鹽相關(guān)基因的挖掘、各類耐鹽基因的應(yīng)用與植物耐鹽基因工程研究的現(xiàn)狀進(jìn)行了分析，從而對(duì)植物耐鹽基因工程研究提供一定的參考價(jià)值和指導(dǎo)意義。

1 鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)通路研究進(jìn)展

當(dāng)鹽脅迫來(lái)臨時(shí)，植物細(xì)胞膜上的受體最先接受脅迫信號(hào)，然后將信號(hào)向下游傳導(dǎo)，產(chǎn)生第二信使，包括鈣離子、活性氧（ROS）和肌醇磷酸鹽（見圖1）[4]。這些第二信使，如肌醇磷酸鹽，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平。鈣結(jié)合蛋白，又稱為鈣離子傳感器，能感知胞漿內(nèi)鈣離子水平的改變。這些傳感器分別與各自下游的分子相互作用，激活蛋白磷酸化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起功能蛋白表達(dá)或者由轉(zhuǎn)錄因子控制的特定種類基因的表達(dá)。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物使植物能夠適應(yīng)不利的環(huán)境條件并正常生長(zhǎng)。由此可見，植物單個(gè)細(xì)胞對(duì)于脅迫的響應(yīng)就像是一個(gè)完整的有機(jī)體一樣協(xié)調(diào)。脅迫誘導(dǎo)不僅使基因的表達(dá)發(fā)生了改變，還促進(jìn)了一些植物激素（如脫落酸，水楊酸和乙烯）的產(chǎn)生。這些分子能夠擴(kuò)大脅迫反應(yīng)最初的信號(hào)，并引起下一輪的信號(hào)傳導(dǎo)，這種信號(hào)傳導(dǎo)可能遵循與之前相同的路徑，或者是完全不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路。輔助分子（例如修飾蛋白）可能沒(méi)有直接參與信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，但它們卻參與了信號(hào)元件的修飾或組裝，并能夠附著在信號(hào)蛋白上與其協(xié)同作用。這些輔助分子包括豆蔻?；浮⑻腔?、甲基化酶和泛素化酶等。

目前已闡明與鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的有促細(xì)胞分裂劑激活性蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，maPK）信號(hào)傳導(dǎo)途徑、鹽超敏感（Salt overly sensitive，SOS）信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及其他蛋白激酶參與的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[5]。在真核生物中存在maPK級(jí)聯(lián)途徑，其中包括3個(gè)功能上相互聯(lián)系的蛋白激酶，maPK被maPK激酶（maPKK）磷酸化而激活，maPKK又被maPK激酶激酶（maPKKK）磷酸化而激活。柏錫等將OsmaPK4基因整合到水稻基因中[6]，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻種子在含0.2 mol·L-1NaCl的培養(yǎng)基上能夠正常萌發(fā)；轉(zhuǎn)基因水稻幼苗在0.4 mol·L-1NaCl處理時(shí)莖部仍然為綠色，種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)情況略優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因植株。迄今已從多種植物中分離到了maPK基因，并發(fā)現(xiàn)maPK級(jí)聯(lián)途徑與植物對(duì)干旱、高鹽、低溫、激素（乙烯、脫落酸、赤霉素、生長(zhǎng)素）、創(chuàng)傷、病原反應(yīng)、氧化反應(yīng)以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)[7]，但各途徑之間的相互關(guān)系還需進(jìn)一步研究。Zhu等通過(guò)突變和耐鹽篩選[8]，從擬南芥中篩選到一系列SOS突變株，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)全新的植物鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑。這些SOS突變體分屬5個(gè)等位基因群，即 SOS1～SOS5，其中 SOS1、SOS2和SOS3在同一信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起作用[9]，SOS2的活化和SOS2與SOS3的相互作用都需要Ca2+的參與[10-11]，SOS3-SOS2除了直接對(duì)SOS1進(jìn)行磷酸化[12]，還能夠調(diào)節(jié)SOS1的表達(dá)，隨后的研究還發(fā)現(xiàn)SOS3-SOS2還可能調(diào)節(jié)其他鹽脅迫效應(yīng)器的表達(dá)[13]。蛋白激酶在胞內(nèi)調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中也扮演了重要角色，它是位于細(xì)胞膜上的受體蛋白激酶，不僅能夠感受外界脅迫信號(hào)，還參與胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)。依據(jù)磷酸化氨基酸的種類可將蛋白激酶分為3類，即酪氨酸蛋白激酶、組氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，maPK即為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。除maPK外，其他類型的蛋白激酶也參與了鹽脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)，主要包括鈣依賴而鈣調(diào)素不依賴的蛋白激酶（Calcium-dependentand calmodulin-independent protein kinase，CDPK）、受體蛋白激酶、GSK3/shaggy激酶和組氨酸激酶等。除上述幾種蛋白激酶外，還有其他蛋白激酶如核糖體蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白激酶等。

在鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)通路中涉及到生理代謝、細(xì)胞防御、能量產(chǎn)生和運(yùn)輸、離子轉(zhuǎn)運(yùn)和平衡、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂等諸多方面的相關(guān)的基因,還有很大一部分至今未知其功能。這些基因以某種協(xié)調(diào)的機(jī)制發(fā)揮作用，維持鹽脅迫下植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

2 植物耐鹽相關(guān)基因的研究

植物受到非生物脅迫時(shí)，很多基因和它們的表達(dá)產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)此做出響應(yīng)。了解這些響應(yīng)脅迫基因的功能，將有助于闡明植物脅迫耐受機(jī)制，從而更準(zhǔn)確、更穩(wěn)定地將這些基因應(yīng)用于耐鹽基因工程中。

2.1 植物耐鹽相關(guān)基因的挖掘

2.1.1 基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘

通過(guò)構(gòu)建脅迫處理各種作物的cDNA文庫(kù)，獲得了大量的表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs），從而識(shí)別非生物脅迫相關(guān)基因[14]。在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，脅迫處理提取作物不同部位組織的mRNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序來(lái)豐富EST數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)對(duì)EST數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，已將水稻和擬南芥基因組序列信息補(bǔ)充完整，為基因挖掘提供了寶貴的資源。對(duì)cDNA文庫(kù)中EST序列進(jìn)行拼接，更為我們提供了關(guān)于脅迫反應(yīng)中相關(guān)基因的數(shù)量、基因組成和可能的基因家族數(shù)量等相關(guān)信息。同時(shí)，脅迫響應(yīng)基因通過(guò)BLASTX與Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)它們進(jìn)行注釋，可以將不同物種中脅迫響應(yīng)的基因聯(lián)系起來(lái)。這樣，拼接過(guò)程中的一致序列提供了比單個(gè)EST數(shù)據(jù)更清晰的數(shù)據(jù)組。研究表明，在所有脅迫處理的cDNA文庫(kù)中，未知基因仍然占有非常高的比例（20%～30%）。注釋這些未知功能的基因，能夠繪制出一個(gè)更完整的植物脅迫應(yīng)答機(jī)制的輪廓。Wang等通過(guò)建立鹽脅迫條件下鹽芥的cDNA文庫(kù)[15]，發(fā)現(xiàn)了鹽脅迫下超量表達(dá)的ESTs。Sreenivasulu等在單子葉植物，例如大麥、小麥、玉米和水稻中也進(jìn)行了類似的工作，發(fā)現(xiàn)了鹽脅迫相關(guān)的ESTs，并對(duì)耐鹽相關(guān)基因進(jìn)行挖掘[16]。同時(shí)，在挖掘這些基因的過(guò)程中，我們也會(huì)得到關(guān)于植物脅迫耐受基本調(diào)控和代謝網(wǎng)絡(luò)的啟示。

2.1.2 通過(guò)轉(zhuǎn)錄譜確定脅迫響應(yīng)的基因

對(duì)比基于ESTs的基因組學(xué)方法，SAGE、MPSS、基因芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）能夠定量分析脅迫處理植物的各個(gè)發(fā)育階段不同組織中高通量表達(dá)的基因，而想要了解基因表達(dá)的類型和功能可以通過(guò)基于EST的cDNA芯片來(lái)實(shí)現(xiàn)?；虮磉_(dá)譜利用cDNA芯片可以鑒定更多與脅迫耐受機(jī)制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和傳導(dǎo)通路。通過(guò)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平的研究，來(lái)鑒定更多脅迫響應(yīng)的基因。在不同物種甚至同一物種不同的基因型中，基因?qū)τ诿{迫的響應(yīng)也是不同的，因?yàn)槟承┗蛐途哂懈咝У男盘?hào)感知能力并且在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生改變，使它們對(duì)脅迫環(huán)境具有適應(yīng)性和完全的耐受性。當(dāng)然，不同的脅迫類型和脅迫程度，基因的表達(dá)也是不相同的。Kawasaki等報(bào)道了在高鹽條件下，水稻鹽耐受型品種Pokkali和鹽敏感型品種IR29在脅迫15 min后到第7天的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)鹽耐受的栽培品種在轉(zhuǎn)錄水平上的響應(yīng)在鹽脅迫15 min以后就發(fā)生了，并且表現(xiàn)出許多基因的上調(diào)表達(dá)，包括甘氨酸豐富蛋白、ABA和脅迫誘導(dǎo)蛋白、金屬硫樣蛋白、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶、水通道蛋白亞基、枯草桿菌蛋白酶抑制劑和酪氨酸酶抑制劑等等[17]。他們還發(fā)現(xiàn)在鹽處理過(guò)程中，許多耐鹽品種中上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的響應(yīng)速度比在鹽敏感的栽培品種中要慢。同樣，Sreenivasulu等觀察鹽耐受型與敏感型谷子的幼苗在250 mmol·L-1NaCl脅迫下基因表達(dá)類型，發(fā)現(xiàn)14個(gè)特定的ESTs在鹽耐受型的谷子株系中上調(diào)表達(dá)，并且延長(zhǎng)鹽脅迫時(shí)間，仍然得到相同的結(jié)果[18]，這與Kawasaki等在水稻中得到的結(jié)果是一致的[17]。據(jù)此，學(xué)者們認(rèn)為，在長(zhǎng)時(shí)期的非生物脅迫處理過(guò)程中的谷類植物，它的蛋白酶抑制劑、應(yīng)激蛋白、水通道和抗氧化劑成分是能夠被誘導(dǎo)的，并推測(cè)這些成分在植物抵抗不同非生物脅迫處理的過(guò)程中起著重要的作用。此外，目前應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的一個(gè)重要方面就是根據(jù)多種脅迫相互作用下基因表達(dá)的類型來(lái)確定脅迫響應(yīng)過(guò)程中關(guān)鍵的調(diào)控因子?；蚪M范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析已經(jīng)確定了成百上千的編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，這些轉(zhuǎn)錄因子是由許多環(huán)境脅迫誘導(dǎo)得到的或者響應(yīng)這些脅迫信號(hào)的[19]。轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)類型是高度復(fù)雜的，因此植物對(duì)于非生物脅迫的耐受力和抵抗力是由一個(gè)非常復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制的。通過(guò)研究在非生物脅迫來(lái)臨時(shí)轉(zhuǎn)基因植物或者敲除突變體在轉(zhuǎn)錄水平上的變化，能夠確定基因間相互作用及其下游元件。Seki等在擬南芥超表達(dá)DREB1a基因的轉(zhuǎn)錄譜（1300個(gè)基因）中，確定有12個(gè)冷和干旱誘導(dǎo)的基因是DERB1轉(zhuǎn)錄因子家族的靶基因[19]。

2.1.3 應(yīng)用高通量基因失活技術(shù)確定基因在非生物脅迫中潛在的功能

盡管目前應(yīng)用基因組學(xué)技術(shù)來(lái)挖掘基因還在繼續(xù)進(jìn)行，但鑒定非生物脅迫響應(yīng)候選基因的任務(wù)量還是很大，并且超過(guò)40%～50%的已知基因的功能仍然不確定。為了揭示他們?cè)诜巧锩{迫耐受中可能的功能，也可以通過(guò)基因失活的高通量方法或突變體篩選來(lái)確定并闡釋基因的功能。目前有兩個(gè)主要的互補(bǔ)方法來(lái)確定目的基因的突變體，分別為TILING和T-DNA插入。這兩種方法已用來(lái)挖掘擬南芥、水稻、玉米和大麥中非生物脅迫響應(yīng)基因的潛在功能。Zhu等通過(guò)常規(guī)遺傳篩選，獲得了擬南芥sos突變體，該突變體顯示出對(duì)于NaCl脅迫的高度敏感，并且生長(zhǎng)受到了抑制[20]。他們還發(fā)現(xiàn)sos突變體在缺K+培養(yǎng)基中生長(zhǎng)會(huì)受到影響，并且對(duì)Na+和Li+離子也高度敏感。Shi等根據(jù)最近的生理生化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)sos1在獲得K+的過(guò)程中并不直接起作用[21]。通過(guò)鑒定，認(rèn)為sos1是Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，通過(guò)將Na+離子泵入液泡來(lái)維持細(xì)胞質(zhì)中低濃度的Na+。

2.2 植物耐鹽相關(guān)基因類別與應(yīng)用

2.2.1 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶基因

許多植物在失水脅迫條件下會(huì)積累小分子相容性溶質(zhì)或滲壓劑。導(dǎo)入滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶基因，使植物在水分脅迫下能合成更多的代謝產(chǎn)物（如脯氨酸、甜菜堿、海藻糖、甘露醇、果聚糖、甘氨酸等），有利于提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)植物的耐鹽性。Garg等在水稻中超量表達(dá)細(xì)菌海藻糖合成基因，增加了水稻對(duì)鹽的耐受性[22]:在100 mmol·L-1NaCl中培養(yǎng)4周，轉(zhuǎn)基因植株的干重是未轉(zhuǎn)基因植物干重的4倍。Abebe等在小麥中超量表達(dá)細(xì)菌甘露醇合成基因mt1D，能夠增加小麥的耐鹽性:在150 mmol·L-1NaCl中，缺失mt1D基因的植株芽鮮重減少了70%，而轉(zhuǎn)基因植物只減少了50%[23]。Waditee等發(fā)現(xiàn)從甘氨酸到甜菜堿的生物合成途徑，該途徑由兩個(gè)N-甲基轉(zhuǎn)移酶催化[24]。N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因在甜菜堿合成過(guò)程中的潛在作用在淡水藍(lán)藻和擬南芥中得到證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻中共同表達(dá)N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因會(huì)使甜菜堿在植物體內(nèi)大量積累，并賦予淡水藍(lán)藻耐鹽性，使它能夠在海水中正常生長(zhǎng)。

2.2.2 氧脅迫相關(guān)基因

鹽堿、干旱和低溫脅迫同時(shí)伴隨有活性氧（ROS）的產(chǎn)生。這些毒性分子破壞生物膜，尤其是破壞線粒體和葉綠體的膜系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化脅迫。通過(guò)導(dǎo)入解毒酶和氧化脅迫相關(guān)酶的基因，如SOD、CAT和GST等，并使其過(guò)量表達(dá)，以有效地排除活性氧自由基，保護(hù)和穩(wěn)定蛋白復(fù)合體和膜結(jié)構(gòu)，從而提高細(xì)胞耐脫水的能力。Yoshimura等通過(guò)不同的抗氧化劑和ROS清除劑來(lái)減輕氧化損傷，增強(qiáng)植物對(duì)于鹽和干旱的耐受性[25]。在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中超量表達(dá)衣藻的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯顯示出對(duì)氧化脅迫的耐受性，這種氧化脅迫多是由寒冷和鹽脅迫造成的。Sunkar等在擬南芥中超量表達(dá)醛脫氫酶AtALDH3基因，通過(guò)消除細(xì)胞內(nèi)的ROS，提高了擬南芥對(duì)于干旱和鹽的耐受性[26]。

2.2.3 離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因

Na+是鹽漬土壤中主要的有害離子，在植物體中過(guò)量積累會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、降低胞質(zhì)酶活性、阻礙光合作用和代謝過(guò)程，引發(fā)離子脅迫。研究表明，在高鹽環(huán)境下，Na+進(jìn)入液泡主要依賴液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及液泡型H+-ATPase和H+-PPase基因表達(dá)的上調(diào)或活性的提高[27]。而胞質(zhì)內(nèi)過(guò)多的Na+排出胞外主要由質(zhì)膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，利用質(zhì)膜型H+-ATPase和H+-PPase產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度完成。Gaxiola等首先在擬南芥中克隆了編碼液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX1基因[28]，Xue等利用該基因在小麥中超量表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因小麥在中度鹽漬土中的產(chǎn)量提高15%[29]。

2.2.4 編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因

轉(zhuǎn)錄因子在植物滲透脅迫反應(yīng)中起關(guān)鍵調(diào)控作用，它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中的過(guò)量表達(dá)會(huì)激活許多抗逆功能基因同時(shí)表達(dá)，獲得比單獨(dú)導(dǎo)入某個(gè)功能基因更強(qiáng)的抗逆性。脅迫響應(yīng)基因的啟動(dòng)子有幾個(gè)典型的順式作用元件，例如DRE/CRT、ABRE和MYCRS/MYBRS，它們受到各種上游轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。在了解順式作用元件的基礎(chǔ)上，借助酵母單雜交的手段即可分離到與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因?，F(xiàn)已有很多與DRE相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子被分離出來(lái)，分別命名為 CBF1/DREB1B、CBF2/DREB/C和CBF3/DREB1A。研究表明，CBF類轉(zhuǎn)錄因子受低溫誘導(dǎo)，可以提高植物對(duì)低溫的抗性。而與其同源的DREB2類轉(zhuǎn)錄因子則受高鹽、干旱調(diào)節(jié)，參與植物耐鹽的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。Park等將轉(zhuǎn)錄因子MsPRP2、SCOF-1、Tsi1基因?qū)胲俎！煵莸?，也可提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)滲透脅迫的抗性[30]。

2.2.5 感應(yīng)和傳導(dǎo)脅迫信號(hào)的蛋白激酶基因

蛋白激酶是一類胞內(nèi)信使依賴的、在蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程中起中介和放大作用，是信號(hào)傳遞中關(guān)鍵酶，它廣泛參與植物對(duì)干旱、鹽脅迫、ABA誘導(dǎo)、光誘導(dǎo)等的應(yīng)答反應(yīng)。Shou等在玉米中組成表達(dá)maPKKK/NPK1能夠激活氧化信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)，使轉(zhuǎn)基因植物對(duì)低溫、高溫和鹽具有耐受性[31]。Liu等發(fā)現(xiàn)了一種新的鈣傳感器CBL（鈣調(diào)磷酸酶B細(xì)胞樣）蛋白[32]。不同的CBL同工型在脅迫條件下都是上調(diào)的。并且CBLs特定的與一類稱為CBL互作蛋白激酶（CIPKs）相互作用，通過(guò)磷酸化作用將信號(hào)傳導(dǎo)給下游的信號(hào)元件。本研究室在野生大豆耐鹽cDNA文庫(kù)中篩選到CRCK基因，該基因的產(chǎn)物在Ca2+存在下能夠與CaM結(jié)合，參與滲透脅迫信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。超量表達(dá)CRCK基因的擬南芥對(duì)高鹽和ABA具有明顯的抗性。現(xiàn)已將該基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆，并對(duì)抗性植株進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)及生物學(xué)檢測(cè)，最終獲得耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆新品系。

2.2.6 解旋酶基因

非生物脅迫往往影響的是細(xì)胞基因表達(dá)機(jī)制，參與處理核酸的解旋酶也可能受到影響。大部分DNA解旋酶存在于細(xì)胞，并參與不同發(fā)展階段基因的調(diào)控以及脅迫條件下的基因調(diào)控。這些DNA解旋酶可能有不同的底物以及構(gòu)造的要求。雖然已經(jīng)許多文獻(xiàn)報(bào)道了大腸桿菌、噬菌體、病毒、酵母菌、小牛胸腺和人類的DNA解旋酶，但只有少數(shù)DNA解旋酶的生物學(xué)作用被揭示[33]。此外，我們關(guān)于植物DNA解旋酶的知識(shí)也很有限，只知道有6個(gè)被純化的解旋酶蛋白。解旋酶的作用及分子機(jī)制現(xiàn)在才剛剛開始探索。目前，正在研究PDH45（豌豆的DNA解旋酶45）在鹽脅迫耐受中的潛在作用[34]。已經(jīng)證明，超量表達(dá)PDH45的轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出較高的耐鹽性。在連續(xù)的鹽脅迫下，T1代轉(zhuǎn)基因植株能夠成長(zhǎng)并產(chǎn)生正常的可育種子，根據(jù)種子的重量推算產(chǎn)量并沒(méi)有任何削減[35]。最近，一個(gè)新的DNA解旋酶基因PDH47（豌豆的DNA解旋酶47）也已經(jīng)被分離，并證明是受冷誘導(dǎo)表達(dá)的[36]。

2.2.7 其他調(diào)控序列

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)一些小的非編碼RNA，MicroRNAs（miRNA）和 siRNAs，它們是 mRNA 降解、轉(zhuǎn)譯抑制和染色質(zhì)修飾的重要調(diào)控子。miRNA作用的靶基因包括代謝途徑中的酶類基因、泛蛋白化途徑中的酶基因、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)傳導(dǎo)組分和涉及RNA加工、蛋白質(zhì)合成方面的基因。Sunkar等在已知的43個(gè)miRNA中鑒定發(fā)現(xiàn)4個(gè)miRNA在不同的非生物脅迫條件下表達(dá)發(fā)生變化[37]。由此可見，miRNA在植物對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答中可能起重要的調(diào)控作用。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)源小RNAs也可能在植物對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答方面起著重要的作用。

3 展望

非生物脅迫特別是鹽脅迫，是世界范圍內(nèi)影響糧食產(chǎn)量的重要因素。應(yīng)用植物生物技術(shù)包括分子輔助育種和基因工程手段提高作物的耐鹽性是快速并且有效的方法。不同研究者從諸多方面對(duì)植物的耐鹽機(jī)制作了大量研究，并已達(dá)到一定的廣度和深度，但由于植物鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程是一個(gè)多基因表達(dá)的結(jié)果，因此對(duì)任何一個(gè)基因進(jìn)行操縱都可能導(dǎo)致大量相關(guān)基因和他們的產(chǎn)物發(fā)生改變。而在提高植物耐鹽性的研究中，要盡可能的減少這些改變，不破壞植物的天然機(jī)制，適時(shí)的激活脅迫基因的表達(dá)。啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng)、激活脅迫基因時(shí)，應(yīng)在沒(méi)有脅迫條件下盡量降低外源基因的表達(dá)量，基因的產(chǎn)物也應(yīng)該針對(duì)適合的組織和細(xì)胞定位，控制表達(dá)的時(shí)間和豐度，從而不影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，保證作物的產(chǎn)量。因此，在后續(xù)植物對(duì)鹽脅迫耐受性的研究中，應(yīng)該考慮到:①選用安全性較高的篩選標(biāo)記基因；②鹽、干旱、高溫這幾種脅迫耐受的機(jī)制是相互干擾的；③植物受到脅迫和從脅迫中恢復(fù)的周期是一個(gè)普遍的過(guò)程，也是與脅迫耐受密切相關(guān)的；④應(yīng)觀察長(zhǎng)期脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，因?yàn)檫@種長(zhǎng)期脅迫才更接近大多數(shù)作物的壽命。因此，對(duì)于作物實(shí)際耐受性的結(jié)論，必須包括生物量、產(chǎn)量和存活率等數(shù)據(jù)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和方法的不斷發(fā)展和完善，植物耐鹽生理和機(jī)理研究的不斷深入以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)將生物技術(shù)與傳統(tǒng)的生物學(xué)和育種學(xué)充分的整合起來(lái)，在植物體內(nèi)建立可受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的、比較完善的耐鹽體系，為提高植物耐鹽性探索出更可靠、更穩(wěn)定的新途徑，以更好地提高植物尤其是糧食作物的耐鹽性。

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