兔脊髓缺血再灌注損傷與正常組蛋白質(zhì)組的差異分析

朱本清,楊小玉,顧 銳*,邱賓濤

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科,吉林 長春 130033;2.北京蛋白質(zhì)組中心,北京 112206）

脊髓缺血再灌注損傷是脊柱外科臨床中較難預(yù)防的并發(fā)癥,產(chǎn)生災(zāi)難性的后果,目前對其發(fā)病機制還很不明確,為全面系統(tǒng)研究損傷機制,本實驗設(shè)計觀察缺血、再灌注的蛋白表達規(guī)律,尋找差異蛋白。

1 材料與方法

1.1 儀器

IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT Twelve電泳系統(tǒng)、Typhoon 9410掃描儀、超聲破碎儀均是Amersham公司產(chǎn)品,美國ABI-4800型反射式基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜。

1.2 試劑

Cy2,Cy3,Cy5熒光染料是Amersham公司產(chǎn)品,DMF購于SIGMA公司,裂解液（7M尿素、2M硫尿、4%CHAPS）、水化液（8M 尿素、2%CHAPS）、平衡母液（6M 尿素、50mM Tris-HCl、20%甘油、2%SDS）、RCDC定量試劑盒、10×電泳緩沖液（250 mM Tris、1.92M glycine、1%SDS）、Bradford 定量試劑盒 、30%丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=29∶1）、1.5 mol/L Tris-HCl（ph 8.8）、10%SDS均是Bio-Rad公司產(chǎn)品,低熔點瓊脂糖是BIOWEST公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備和脊髓標(biāo)本采集 清潔級兔由吉林大學(xué)實驗動物中心提供,動物實驗操作在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院動物實驗室。健康成年新西蘭大白兔,體重2.5-3.0 kg,雌雄不限。

動物隨機分為:對照組（只行手術(shù)不阻斷腹主動脈）、單純?nèi)毖M（缺血25min）、缺血（缺血25min）再灌組（6、12、24、48 h）,每組 6只。用 10%的水合氯醛按0.3mg/kg行腹腔注射麻醉,開腹后于左腎動脈分叉下用血管夾阻斷腹主動脈造成脊髓腰骶段缺血。對照組和缺血組,于術(shù)后麻醉下取脊髓L4-5節(jié)段,缺血再灌注組缺血25m in后去除血管夾-—再灌注,關(guān)閉腹腔。再灌注6、12、24、48 h麻醉下活體取脊髓L4-5節(jié)段[1]。將所取材液氮速凍-70℃冰箱保存。

1.3.2 樣品制備 將組織用液氮預(yù)冷的砸碎器砸碎,將砸碎的粉末用液氮研磨,加Cocktail蛋白酶抑制劑20μl/m l,加入 lysis buffer,轉(zhuǎn)入Dounce勻漿器中勻漿。樣品放在裝有冰水混合物的燒杯里超聲,累計超聲60 s。再用純水超聲。室溫提取30 min,離心,4 0000 g*1 hrs4℃離心,小心取出上清,分別測量標(biāo)記出蛋白濃度,按照用途不同,分裝與保存在-80度冰箱。

1.3.3 蛋白標(biāo)記 調(diào)樣品終濃度為5mg/ml,pH在8.0-9.0之間,每個樣品取 50μg（10μl）混合成pool。取出DIGE染料母液,渦旋混勻30 s,12 000 g離心30 s,室溫放置 10 min,取0.4μl母液加入0.6 μl DMF混勻,分別加入50μg的pool和樣品中進行標(biāo)記。12個樣品在膠中的分布及染料標(biāo)記;每塊膠中用不同染料標(biāo)記的pool和樣品混合,得到6管混合樣品,每管36μl加入等體積的2*sample buffer渦旋混勻每管中加入水化液至終體積450μl。

等電聚焦:取出IPG預(yù)制膠條,在聚焦盤中將上面6管混合樣品連續(xù)、線性加樣,去除IPG預(yù)制膠條的保護層。放入聚焦盤,室溫放置30-60min。在膠條背面均勻、連續(xù)覆蓋礦物油。設(shè)置等點聚焦程序。

第二向SDS電泳:配置12%SDS凝膠,將IPG膠條取出,去油、吸干,然后放入平衡緩沖液Ⅰ、衡緩沖液Ⅱ后,取出IPG膠條,沖洗,吸干,放置在SDS凝膠的長玻璃板上,封口后,迅速地將IPG膠條插入未凝固上的瓊脂糖封膠液中,凝固,放入SDS凝膠電泳槽中,開始電泳,電泳結(jié)束后行熒光染色。

1.3.4 圖像掃描及分析 電泳結(jié)束后,用Typhoon 9410掃描儀在488/520 nm,532/580 nm,633/670 nm波長分別對Cy2,Cy3,Cy5熒光染料標(biāo)記的圖像進行掃描。用DeCyder v.5.02圖像分析軟件對DIGE圖像進行分析和差異點尋找。觀察各個蛋白點在缺血和再灌注各個時間點的變化,取正常組與缺血再灌注24 h組比較篩選差異點。

1.3.5 質(zhì)譜鑒定 應(yīng)用膠內(nèi)酶切法制備蛋白質(zhì)肽譜,應(yīng)用美國ABI-4800型反射式基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜反射式掃描,范圍:700-4000Da;激光能量:MS 5000,MSMS 5500應(yīng)用GPS軟件檢索在NCBI的兔形目數(shù)據(jù)庫檢索,取誤差MS 0.2Da;MSMS 0.3Da;數(shù)據(jù)取舍標(biāo)準(zhǔn);取蛋白質(zhì)打分大于52分,置信水平95%以上[2]。

2 結(jié)果

對DIGE圖像進行分析和差異點尋找。觀察各個蛋白點在缺血和再灌注各個時間點的變化,發(fā)現(xiàn)在再灌注24 h點與其他時間點比有顯著變化,其他時間點間變化不顯著,共觀測出46個差異點。取正常組與缺血再灌注24 h組比較篩選差異點,共鑒定出10個差異蛋白,見表1,圖1-4是典型蛋白在各個時間點的變化折線圖。

表1 差異蛋白

3 討論

蛋白質(zhì)組（proteome）是指一個基因組、一種生物、一種細胞或組織所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的開展使對生命活動的認(rèn)識由局限片面到具體系統(tǒng),由間接的基因水平深入到蛋白質(zhì)水平。雙向電泳（2-DE）是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù),是依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量的不同,通過兩次垂直方向的電泳,將復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上呈點狀分開。該技術(shù)可用來建立細胞、組織或生物體基因組所表達的全部蛋白質(zhì)的二維凝膠圖譜,即:蛋白質(zhì)組圖譜。2-DE技術(shù)的最大優(yōu)勢在于它可以對細胞或組織內(nèi)復(fù)雜的蛋白質(zhì)組分進行整體性分析,從而可以分析不同生理和病理條件下蛋白質(zhì)的表達變化,并從中總結(jié)出生命活動的規(guī)律[3]。

圖1 alpha-tubulin的變化

圖2 succinate dehyd rogenase complex subunit A的變化

圖3 annexin VI的變化

圖4 neurofilament protein M的變化

脊髓缺血-再灌注損傷（Ischemia/Reperfusion I/R）的研究表明可能與微循環(huán)障礙、炎癥機制有關(guān),有細胞凋亡機制、水通道蛋白與脊髓損傷等學(xué)說,脊髓缺血再灌注損傷不同時限直接影響脊髓損傷修復(fù)與預(yù)后[4-6],然目前其確切損傷機制尚不清,缺乏有效的防治措施。根據(jù)近年來脊髓損傷機制研究新進展,我們推測脊髓損傷后局部蛋白質(zhì)組表達將發(fā)生序貫性、特異性變化,運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),將系統(tǒng)闡述脊髓缺血再灌注損傷引發(fā)蛋白質(zhì)組變化特點,篩查拮抗脊髓缺血再灌注損傷不同階段蛋白質(zhì)組作用水平調(diào)控點,將獲得特異蛋白質(zhì)進功能研究,明確其損傷機制,聯(lián)合生物學(xué)效應(yīng)分子水平作用靶點,篩出具有臨床標(biāo)志意義、提供藥物作用的靶蛋白質(zhì)分子以及發(fā)現(xiàn)在信號傳遞中起重要作用的蛋白質(zhì)分子,將對于脊髓缺血再灌注損傷不同階段發(fā)生、發(fā)展、凋亡,針對新藥設(shè)計和調(diào)控脊髓缺血再灌序慣性損傷具有極其重要意義。

通過對損傷與正常脊髓蛋白質(zhì)組雙向熒光差異電泳（DIGE）圖譜以及兩者蛋白質(zhì)組匹配差異圖譜的分析發(fā)現(xiàn):損傷24小時蛋白變化最明顯,與正常脊髓蛋白質(zhì)組間存在46個差異點,鑒定出10個差異蛋白。本次研究為探討脊髓缺血再灌注損傷機制打下了基礎(chǔ)。設(shè)想通過差異蛋白質(zhì)功能的研究,可以獲得脊髓損傷蛋白和保護蛋白,為今后的研究、診斷和治療,提供幫助。

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