“雙低”油菜籽蛋白酶法改性研究

易建華， 潘毛頭， 朱振寶

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引 言

油菜是我國(guó)主要的油料作物，年均種植面積1.1～1.2億畝，產(chǎn)量居世界首位[1].油菜籽榨油后菜籽餅粕中蛋白質(zhì)含量約為35%～40%.中國(guó)每年有約600 萬噸菜籽餅粕，是僅次于豆粕的潛在大宗植物蛋白質(zhì)資源[2].菜籽蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白，其氨基酸組成與大豆蛋白質(zhì)以及聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦值非常接近[3]，同時(shí)菜籽蛋白與大豆蛋白相比具有原料價(jià)格優(yōu)勢(shì)，因此加強(qiáng)菜籽蛋白的應(yīng)用研究，使之部分取代大豆蛋白具有重要的經(jīng)濟(jì)意義.

由于菜籽餅粕存在硫苷、植酸及多酚類等抗?fàn)I養(yǎng)因子，極大地限制了其在食品中的應(yīng)用，目前僅作為肥料使用或少量用于飼料，造成蛋白資源的極大浪費(fèi).隨著“雙低”( 低芥酸，低硫苷)油菜優(yōu)良品種的培育及大量推廣種植，為低毒性或無毒性菜籽蛋白的制備及應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[4].但迄今為止，“雙低”菜籽餅粕蛋白的相關(guān)研究多集中于以實(shí)驗(yàn)室制備的低溫菜籽餅粕為原料[3-5]，而實(shí)際上，在工業(yè)化過程中工廠多數(shù)仍采用傳統(tǒng)高溫壓榨工藝制取菜籽油，但菜籽經(jīng)高溫制油工藝后因變性使蛋白質(zhì)功能性質(zhì)大大降低，影響了其在食品加工中的應(yīng)用[6].因此，通過改性提高高溫菜籽蛋白功能性質(zhì)具有十分重要的意義.

蛋白質(zhì)改性包括3種方法: 物理法、化學(xué)法和酶法[7].目前，由于技術(shù)和設(shè)備問題，蛋白質(zhì)物理改性尚未工業(yè)化生產(chǎn).化學(xué)改性由于可能造成食品安全性問題，不容易被消費(fèi)者所接受，而酶法改性是利用蛋白酶在溫和的條件下催化水解蛋白質(zhì)達(dá)到蛋白質(zhì)改性的目的，是一種不降低食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值, 同時(shí)又能獲得更好食品蛋白質(zhì)功能特性的簡(jiǎn)便方法.因此，本文以秦優(yōu)11號(hào)高溫“雙低”菜籽餅粕為試材，采用NaCl提取結(jié)合超濾工藝制備菜籽鹽提蛋白(RPSS)，以大豆分離蛋白(SPI)作為對(duì)照，研究了RPSS的酶法改性，為高溫菜籽餅粕中蛋白質(zhì)的食用性開發(fā)提供技術(shù)指導(dǎo)，同時(shí)也可以為食品工業(yè)提供新的功能性配料.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料與試劑

原料： “雙低”油菜籽(秦優(yōu)11號(hào))，其高溫壓榨餅粕成分如表1所示.

蛋白酶：Acalase2.4L?、Flavourzyme?：諾維信(中國(guó))有限公司；其余試劑均為分析純：西安化學(xué)試劑廠.

表1 秦優(yōu)11號(hào)菜籽高溫壓榨餅粕主要成分

1.2 主要儀器、設(shè)備

PB-8型酸度計(jì)(賽多利斯公司)；JA5003型電子分析天平(賽利斯科學(xué)儀器有限公司)；超級(jí)恒溫水浴(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)； LG10-2.4A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)； RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SH2-D型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；722型光柵分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；微量凱氏定氮儀，上海洪紀(jì)儀器廠；Millipore超濾儀(美國(guó)Millipore 公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

菜籽粕去皮和仁皮分離，粉碎處理后，用石油醚進(jìn)行脫脂處理，并除去溶劑，干燥后過40目篩，得實(shí)驗(yàn)樣品， 4 ℃保存?zhèn)溆?

1.3.2 成分測(cè)定

粗蛋白：GB 5009.5-2010；粗脂肪：GB 2906-82；植酸：GB5009.153-2003；硫苷：GB/T 23890-2009；灰分：參照GB/T5009.4-2010；水分：參照GB5497-85.

1.3.3 鹽提菜籽蛋白(RPSS)制備

稱取50 g脫脂菜籽餅粕，加5% NaCl溶液1 000 mL，50 ℃，提取90 min，4 000 r/min離心10 min，上清液采用MWCO50000超濾膜處理，截留液冷凍干燥，備用.

1.3.4 RPSS功能特性研究

1.3.4.1 溶解性

以大豆分離蛋白(SPI)作為對(duì)照，準(zhǔn)確稱取RPSS樣品 2.0 g，加入40 mL蒸餾水，以 0.1 mol HCl或0.1 mol NaOH調(diào)pH值，40 ℃下攪拌45 min，用中速濾紙過濾，并用少量的蒸餾水沖洗濾渣，定容至50 mL，用微量凱氏定氮法測(cè)定上清液中樣品及未處理樣品中的含氮量.按下式計(jì)算氮溶解指數(shù)(NSI)：

NSI(%)=(上清液中含氮量/樣品總氮)×100%

1.3.4.2 持水性

參照文獻(xiàn)[8]方法，稱取0.5 g樣品，加入10 mL去離子水，在10 min內(nèi)攪拌6次，然后在3 000 r/min下離心10 min，離心后得到的沉淀物在50 ℃下保持25 min，稱量其質(zhì)量，持水性計(jì)算公式：

持水性(%)=(沉淀物質(zhì)量-樣品質(zhì)量)/樣品質(zhì)量×100%

1.3.4.3 吸油性

參照文獻(xiàn)[8]方法，準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品于離心管中，加入6 mL大豆色拉油，放置30 min，然后3 000 r/min離心15 min，稱量上層大豆色拉油的質(zhì)量，吸油性計(jì)算公式為：

吸油性(%)=(大豆色拉油質(zhì)量-上層大豆色拉油質(zhì)量)/樣品質(zhì)量×100%

1.3.5 蛋白酶水解RPSS及對(duì)其功能特性的影響

配制1 L 5% RPSS溶液，置于超級(jí)恒溫反應(yīng)器，并調(diào)至其最適溫度及pH，分別加入堿性蛋白酶Aclase2.4L?及Flavourzyme?( E/S=1.5%)，通過滴加0.5 mol/L NaOH保持體系pH恒定.pH-stat法測(cè)定水解度(DH)，研究RPSS的酶解進(jìn)程.酶解液達(dá)到相應(yīng)水解度后，取出酶解液，沸水浴10 min，終止酶解過程，冷卻至室溫后調(diào)pH至7.0，冷凍干燥即得不同DH酶解產(chǎn)物，同時(shí)研究酶解對(duì)RPSS功能特性的影響.DH計(jì)算公式如下[9]：

式中：B—水解過程中消耗NaOH的體積，mL；N—NaOH的濃度，mol/L；α—在實(shí)驗(yàn)條件下的氨基解離度，α= 10pH-pK/(1+10pH-pK) (pK=7.0)；MP—蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；htot—每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，mmol/g蛋白質(zhì)，對(duì)于菜籽蛋白，該值取8.38.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同蛋白酶水解菜籽蛋白特性的研究

圖1 兩種蛋白酶水解菜籽蛋白水解進(jìn)程曲線

由圖1可知，兩種蛋白酶水解特性有明顯差異.堿性蛋白酶Aclase2.4L?的水解能力較強(qiáng)，且在50 min以內(nèi)水解度上升較快，可達(dá)到8.8%；60～350 min，水解速度趨于緩和，水解度變化幅度只有4.2%.而風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme?的水解速度一直比較平緩，水解度變化幅度很小，水解350 min，水解度僅為3.4%.結(jié)果說明，不同的蛋白酶對(duì)菜籽蛋白的水解度存在顯著區(qū)別，其原因可能在于酶對(duì)底物的作用不同.

2.2 酶法水解對(duì)菜籽蛋白溶解性的影響

以SPI為對(duì)照，研究了不同水解度(DH 2.0%、5.0%、8.0%、11.0%)Aclase2.4L?菜籽蛋白酶解物與不同水解度(DH 0.6%、1.8%、3.0%)Flavourzyme?菜籽蛋白酶解物的溶解性，結(jié)果如圖2、3所示.

圖2 DH對(duì)菜籽蛋白Aclase2.4L?酶解物溶解性影響 圖3 DH對(duì)菜籽蛋白Flavourzyme?酶解物溶解性影響

由圖2、3可知，蛋白酶種類及水解度對(duì)RPSS的溶解性影響較大.SPI與RPSS的pI都接近pH4.0，且與SPI相比，相同pH(等電點(diǎn)除外)未酶解處理的RPSS溶解性低于SPI，但隨著水解度的增大，RPSS溶解性有不同程度的提高，其原因可能與分子尺寸減小和可電離基團(tuán)增多以及羰基的暴露有關(guān).由圖2可以發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶Aclase2.4L?水解菜籽蛋白， RPSS(DH=11.0%)氮溶指數(shù)超過SPI，且在較寬的pH值范圍內(nèi)水解產(chǎn)物具有很好的溶解性，等電點(diǎn)對(duì)RPSS溶解性影響不明顯.由此可見，深度酶解(DH>10%)更利于改善RPSS溶解性.此外比較圖2、3可看出，與Aclase2.4L?相比，風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme?對(duì)RPSS溶解性改善作用有限，且當(dāng)DH為0.6%～3.0%，RPSS的溶解性低于SPI(pI4.0除外)，因此在實(shí)際應(yīng)用過程中，可以采用Aclase2.4L?水解菜籽蛋白來提高RPSS溶解性.

表2 RPSS與SPI持水性和吸油性比較

2.3 酶解對(duì)RPSS持水性和吸油性的影響

2.3.1 RPSS與SPI持水性和吸油性比較

由表2可知，RPSS持水性極顯著低于SPI(P<0.01)，但其吸油性卻極顯著高于SPI(P<0.01).蛋白質(zhì)的持水性與吸油性與其分子表面的極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)有關(guān)，蛋白質(zhì)分子表面的極性基團(tuán)越多，則吸水性越強(qiáng)；相反，分子表面的非極性基團(tuán)越多，則吸油性越強(qiáng).從表2對(duì)比可以推斷，RPSS分子表面具有較多的非極性基團(tuán)，因此其持水性較差，而吸油性較強(qiáng).

RPSS具有良好的持油性，可應(yīng)用于高脂食品中，并可促進(jìn)脂肪與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而減少食品蒸煮時(shí)脂肪損失；RPSS應(yīng)用于肉制品中，在保持成品質(zhì)量的前提下，可降低瘦肉比率，提高產(chǎn)品質(zhì)地、得率和蛋白質(zhì)指標(biāo)，降低成本.

2.3.2 酶解對(duì)RPSS持水性影響

蛋白酶Aclase2.4L?和Flavourzyme?，不同DH對(duì)RPSS持水性影響結(jié)果如圖4、5所示.

圖4 堿性蛋白酶Aclase2.4L?對(duì)RPSS持水性的影響 圖5 Flavourzyme?對(duì)RPSS持水性的影響

由圖4、5可知，經(jīng)蛋白酶水解后，RPSS持水性表現(xiàn)出降低趨勢(shì)，且水解度越大，蛋白質(zhì)的持水性越??；由q檢驗(yàn)可知，Aclase2.4L?水解RPSS，除DH5.0 RPSS與DH 8.0 RPSS持水性無顯著性差異外，其余都表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)；而Flavourzyme?作用RPSS，水解度為0.6%和 1.8%時(shí)，RPSS持水性差異不顯著，其余RPSS持水性差異達(dá)到極顯著.

2.3.3 酶解對(duì)RPSS吸油性的影響

圖6、7分別為堿性蛋白酶Aclase2.4L?與Flavourzyme?對(duì)RPSS吸油性的影響.由圖6、7比較可知，兩種蛋白酶對(duì)RPSS吸油性的影響表現(xiàn)出較大差異.堿性蛋白酶Aclase24L?水解RPSS ，隨水解進(jìn)行，RPSS吸油性顯著降低，后有所提高，當(dāng)水解度繼續(xù)提高，RPSS吸油性又呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；而利用Flavourzyme?作用RPSS，RPSS吸油性卻表現(xiàn)為先顯著增大后降低的趨勢(shì)，因此，采用Flavourzyme?并進(jìn)行輕度水解(DH<1%)有利于提高RPSS吸油性.

圖6 堿性蛋白酶Aclase2.4L?對(duì)RPSS吸油性的影響 圖7 Flavourzyme?對(duì)RPSS吸油性的影響

3 結(jié)束語(yǔ)

蛋白酶水解可不同程度提高RPSS溶解性，其中，堿性蛋白酶Aclase2.4L?對(duì)菜籽蛋白溶解性影響較大，當(dāng)DH>10%，菜籽蛋白溶解性大于SPI，且不受等電點(diǎn)影響；與SPI相比，RPSS吸油性較強(qiáng)，持水性較差；酶法水解不同程度降低RPSS持水性，而采用Flavourzyme?，適度水解(DH<1%)可顯著提高RPSS吸油性.

參考文獻(xiàn)

[1] 姜紹通，潘 牧，鄭 志.菜籽粕貯藏蛋白制備及功能性質(zhì)研究[J].食品科學(xué)，2009，30(8)：29-32.

[2] 鄭美瑜，陳劍兵，陸勝民，等.菜籽蛋白的提取和純化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008， 24(8)：267-270.

[3] 劉大川，周俊梅，張寒俊，等.低植酸、低單寧“雙低”菜籽分離蛋白制備工藝的研究[J].中國(guó)油脂，2005，30(8):38-41.

[4] 嚴(yán)梅榮，鞠興榮，王丹丹.堿提酸沉淀方法制取菜籽蛋白質(zhì)的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24(6)：72-75.

[5] 張寒俊，劉大川，王興國(guó)，等. 雙低油菜籽蛋白質(zhì)及其他成分溶解曲線研究[J].中國(guó)油脂，2003，28(1): 27-29.

[6] 何 江，鈕琰星，黃鳳洪，等.菜籽濃縮蛋白研究進(jìn)展[J].中國(guó)油脂，2009，34(10)：20-23.

[7] 蔡麗麗，陸啟玉，錢 林.酶法改性食品蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展[J].糧油加工與食品機(jī)械，2006，(6)：85-87.

[8] Lqari H.，Vioque J.，Pedroche J.，etal.. Lupinus angustifolius protein isolates chemical composition functional properties and protein characterization[J]. Food Chemistry，2002， 76:349-356.

[9] Adler-Nissen J. Enzymatic hydrolysis of food proteins[M].New York: Elsevier Applied Science Publishers，1986:9-56.