人肥大細胞類糜蛋白酶分泌型真核表達載體的構(gòu)建

唐曉磊,何素輝,梁曉東,陳章權(quán)

(廣東醫(yī)學(xué)院,廣東東莞 523808)

肥大細胞類糜蛋白酶(MC-Chy)是肥大細胞中一種重要的炎癥介質(zhì),近年來研究表明它在變態(tài)反應(yīng)性疾病、高血壓、動脈粥樣硬化、腫瘤、肺纖維化等疾病發(fā)生發(fā)展中的起著重要的病理生理作用[1,2],國內(nèi)相關(guān)報道較少。由于分離純化天然的MC-Chy極為困難,為獲取分泌表達的重組MC-Chy,進一步深入研究MC-Chy的免疫病理作用,2009年10月～2010年3月,我們進行了MC-Chy分泌型真核表達載體的構(gòu)建?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 pGEM-T載體為Promega公司產(chǎn)品, DNA凝膠回收與質(zhì)粒抽提試劑盒為QiaGen公司產(chǎn)品,Kpn I、Xho I限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶為Takara公司產(chǎn)品,pcDNA3.1表達載體、含肥大細胞類糜蛋白酶基因的質(zhì)粒和大腸桿菌DH5α由本研究室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)Genbank中人MC-Chy的編碼序列進行引物設(shè)計,用人免疫球蛋白 κ鏈的信號肽編碼序列置換人MC-Chy自身的信號肽序列,設(shè)計一對特異引物,即P1：5′-GGTACCATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTA CTCTGGCT CCCAGACACCACTGGAGAAGAGATCATCGGGGGCA CAGAATGC-3′(下劃橫線為KpnⅠ酶切位點,下劃波浪線為人免疫球蛋白κ鏈信號肽編碼序列);P 2：5′-CTCGAGTTAATTTGCCTGCAGGATCTGGTT-3′(下劃橫線為Xho I酶切位點)。

1.2.2 基因擴增 以本研究室制備含MC-Chy基因的質(zhì)粒pDEST17/CMA[3]為模板,用上述引物進行PCR擴增。反應(yīng)條件：94℃變性30 s、65℃退火30 s、72℃延伸 30 s,30個循環(huán)后,72℃延伸 45 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化,將純化的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,轉(zhuǎn)化菌液涂布于含100μg/ml氨芐青霉素(Amp)丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的Luria-Bertani(LB)平板上,37℃培養(yǎng)過夜,挑取單個白色菌落進行培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒,以KpnⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定,并選取陽性克隆DNA測序,用Blast軟件進行DNA序列同源性分析,陽性克隆命名為pGEM-T/Chy。

1.2.3 真核表達載體的構(gòu)建 將質(zhì)粒pGEM-T/ Chy和pcDNA3.1分別用KpnⅠ和XhoⅠ進行雙酶切,并分別純化回收目的片段。回收產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH 5α,轉(zhuǎn)化菌液涂布于含Amp(100μg/ml)的LB平板上,37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落進行增菌培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒,用PCR與Kpn I、Xho I進行雙酶切鑒定后,將陽性克隆進行 DNA測序鑒定,陽性克隆命名為pcDNA3.1/Chy。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,見有1條約750 bp的條帶(見圖1),與預(yù)期結(jié)果相符。克隆入pGEM-T載體,經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切,電泳分析顯示切下約750 bp的DNA片段(見圖2),DNA測序結(jié)果表明,插入了687 bp的Chy基因,在其上游成功連接了60 bp的人免疫球蛋白 κ鏈信號肽基因,閱讀框正確,同源性分析顯示插入的人MC-Chy編碼區(qū)基因與Gen-Bank中的DNA序列一致。

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定結(jié)果 經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切從pGEM-T/Chy切下目的片段,純化、回收后與經(jīng)同樣雙酶切回收的pcDNA3.1片段相連接,構(gòu)建pcDNA3.1/Chy質(zhì)粒。挑取5個菌落,PCR鑒定出2個陽性克隆(見圖3),進一步Kpn I和Xho I雙酶切鑒定顯示切下約750 bp的DNA片段,與預(yù)期結(jié)果相符。DNA測序結(jié)果表明目的片段正確插入表達載體pcDNA3.1。Blast同源性分析顯示,目的基因及連接在其上游的信號肽基因無突變,閱讀框正確,可用于進一步的重組表達。

3 討論

肥大細胞存在于機體的許多組織中,具有許多生物功能,不僅在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用,也在變態(tài)反應(yīng)性疾病、炎癥、心血管疾病、腫瘤等發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的免疫病理作用[1,4,5]。其作用是通過細胞活化脫顆粒、釋放炎癥介質(zhì)實現(xiàn)的。其炎癥介質(zhì)分為預(yù)先合成介質(zhì)和新合成介質(zhì),其中預(yù)先合成介質(zhì)以組胺和中性蛋白酶等為主,肥大細胞中性蛋白酶主要包括肥大細胞羧肽酶、類胰蛋白酶和類糜蛋白酶等[1],這些中性蛋白酶與肝素緊密結(jié)合成大分子混合物儲藏于肥大細胞顆粒內(nèi),隨著肥大細胞的活化釋放出細胞外發(fā)揮作用。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒pGEM-T/Chy酶切鑒定結(jié)果

圖3 pcDNA 3.1/Chy重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

MC-Chy國外研究較多,國內(nèi)相關(guān)的研究報道較少。目前的研究表明MC-Chy具有增加微血管的通透性和引起炎性細胞浸潤、刺激成纖維細胞的增殖、誘導(dǎo)平滑肌細胞及細胞凋亡、促進腫瘤血管生成、刺激膠原蛋白的合成并促進纖維化的形成等作用[1,4～6]。因此,其在哮喘、高血壓、動脈粥樣硬化、腫瘤、肺纖維化等疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用,是變態(tài)反應(yīng)性疾病和心血管疾病的一個新治療靶點[2]。肥大細胞活化產(chǎn)生介質(zhì)具有多樣性,甚至產(chǎn)生生化作用相反的介質(zhì),其中MC-Chy就有類似性質(zhì),它能水解血管緊張素Ⅰ生成血管緊張素Ⅱ,而同樣屬于中性蛋白酶的肥大細胞羧肽酶則能水解血管緊張素Ⅱ,生成生物學(xué)作用與其相反的血管緊張素1-7[7],MC-Chy能水解大分子內(nèi)皮素生成具有高度縮血管活性的內(nèi)皮素 1[8],而肥大細胞羧肽酶則能降解內(nèi)皮素 1[9]。目前僅了解這些肥大細胞中性蛋白酶的生物學(xué)活性,但對于它們在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不清楚。

天然的肥大細胞中性蛋白酶分離純化以及純化后酶活性的保存均非常困難。因此,我們擬用重組蛋白進行相關(guān)研究。MC-Chy屬于預(yù)先合成的介質(zhì),存在于肥大細胞胞質(zhì)顆粒中,它本身含有信號肽,當(dāng)細胞活化后才能釋放至細胞外。在進行重組蛋白制備時,若保留其本身信號肽,重組蛋白能否分泌出細胞外迄今尚未見報道。為使產(chǎn)物分泌后表達,本實驗選擇高效分泌表達的免疫球蛋白 κ鏈信號肽與成熟MC-Chy基因融合,通過PCR擴增獲取融合有免疫球蛋白κ鏈信號肽的MC-Chy基因片段,通過酶切連接插入真核表達載體pcDNA3.1,成功構(gòu)建了人MC-Chy分泌型真核表達載體。此前我們成功構(gòu)建了人肥大細胞羧肽酶分泌型真核表達載體,這些工作的完成為重組肥大細胞羧肽酶與MC-Chy的制備及探討二者在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[1]Pejler G,R?nnberg E,Waern I,et al.Mastcell proteases-multifaceted regulators of inflammatory disease[J].Blood,2010,115 (24)：4981-4990.

[2]Bacani C,Frishman WH.Chymase：a new pharmacologic target in cardiovascular disease[J].Cardiol Rev,2006,14(4)：187-193.

[3]陳章權(quán),黃震,何天文,等.人肥大細胞類糜蛋白酶基因的原核表達及其多克隆抗體制備與鑒定[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志,2007,23(11)：1025-1027.

[4]Kovanen PT.Mast cells：multipotent local effector cells in atherothrombosis[J].Immunol Rev,2007,217：105-122.

[5]Crivellato E,Nico B,Ribatti D.Mast cells and tumour angiogenesis：new insight from experimental carcinogenesis[J].Cancer Lett, 2008,269(1)：1-6.

[6]Leskinen M,Wang Y,Leszczynski D,etal.Mast cellchymase induces apoptosis of vascular smooth muscle cells[J].Arteriosc ler Thromb Vasc Biol,2001,21(4)：516-522.

[7]Lundequist A,Tchougounova E,Abrink M,et al.Cooperation betweenmast cellcarboxypeptidase A and the chymasemousemast cell protease 4 in the formation and degradation ofangiotensinⅡ[J].J Biol Chem,2004,279(31)：32339-32344.

[8]Simard E,Jin D,Takai S,et al.Chymase-dependent conversion of big endothelin-1 in the mouse in vivo[J].JPharmacol Exp Ther, 2009,328(2)：540-548.

[9]Schneider LA,Schlenner SM,Feyerabend TB,et al.Molecular mechanism ofmast cell mediated innate defense against endothelin and snake venom sarafotoxin[J].J Exp Med,2007,204(11)：2629-2639.