戊型肝炎病毒IgA抗體的研究進展

0007 南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院空勤療養(yǎng)區(qū) 周越球 陸松堯 0000 解放軍第454醫(yī)院 梁立敏

HE是由HEV引起的經(jīng)消化道傳播的急性傳染病，發(fā)病率逐年升高。有研究表明HEV還可通過血液途徑傳播[1]，而且最近發(fā)現(xiàn)HE在器官移植患者中可以慢性化[2]。HEV流行廣泛，呈全球性分布，主要累及衛(wèi)生條件差的亞洲、非洲和中美洲等地區(qū)中的發(fā)展中國家，在西方發(fā)達國家也有散發(fā)病例報道，在未暴發(fā)HEV的地區(qū)人群可檢測到抗HEV抗體。在某些發(fā)展中國家，HE占成人急性病毒性肝炎的50%以上，盡管只有1%～3%的患者發(fā)展為致死性急性肝炎，病死率為2.5%，明顯高于甲型(0.1%)和乙型(0.9%)肝炎，孕婦感染后病死率可高達20%。我國曾發(fā)生11次HE的暴發(fā)或流行，是HE高發(fā)區(qū)之一，1986年至1988年新疆發(fā)生迄今為止規(guī)模最大的HE暴發(fā)性流行，約有12萬人感染[3]。據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的傳染病疫情公示，近年來我國HE發(fā)病數(shù)呈現(xiàn)連續(xù)增長的態(tài)勢，死亡率也在逐年增加，已經(jīng)被列為因HE發(fā)病和死亡而引起的經(jīng)濟負擔(dān)最為嚴重的國家之一。

HEV是一個近似球形的二十面體顆粒，表面有突起和刻缺，形似杯狀，無包膜，平均直徑為32～34 nm。HEV對高鹽、氯化銫、氯仿等敏感，在70℃～80℃中易裂解，在液氮中穩(wěn)定。HEV的基因組是一單股、正鏈RNA分子，全長約7.5 kb，由5′端非編碼區(qū)(NCR)、非結(jié)構(gòu)區(qū)(NSR)、結(jié)構(gòu)區(qū)(SR)、3′端NCR和3′端Poly(A)尾巴組成，5′端NCR和3′端NCR之間為編碼區(qū)，包含3個開放讀碼框(ORF1、ORF2和ORF3)。ORF1主要編碼與HEV復(fù)制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白，包括甲基轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶、RNA解鏈酶及RNA聚合酶。ORF2編碼病毒衣殼蛋白，為主要的結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)。ORF3位于ORF1和ORF2之間，與ORF1和ORF2有部分重疊，編碼病毒特異性的免疫反應(yīng)抗原。作為一種單鏈RNA病毒，HEV基因組與蛋白質(zhì)容易發(fā)生變異，根據(jù)HEV核苷酸序列同源性比較的結(jié)果，目前至少可以將HEV分成4個主要的基因型和多個亞型?；蛐?：包括3個亞型，分別以HEV緬甸株(1a型)、巴基斯坦株(1b型)和摩洛哥株(1c型)為代表，以往以中國新疆株為代表的中國HEV與巴基斯坦株屬同一亞型；基因型2：以HEV墨西哥株為代表；基因型3：由美國株及大多數(shù)豬HEV組成；基因型4：包括新近發(fā)現(xiàn)的HEV中國株和臺灣株[3-4]。ORF2蛋白在已發(fā)現(xiàn)的HEV基因型中最為保守，具有很強的免疫原性，其編碼的氨基酸序列的同源性并不完全一致，第3型和第4型之間達94.6%，顯示了在種系進化上3、4兩型間的氨基酸序列相近，可能含有共同的抗原表位。第1型和第2型之間的氨基酸序列同源性達92.2%～92.8%。流行病學(xué)資料報道以往我國HE發(fā)病以1型毒株為主要病原體，近期的研究報告顯示4型HEV是目前引起我國散發(fā)性HE的主要病毒株[4]。

HE是一種嚴重危害人類健康的全球性疾病，目前尚無特效治療方法，也無特異性被動和主動免疫制劑可供預(yù)防。早期診斷，不僅對于患者的治療和改善預(yù)后具有重要意義，還可以及早發(fā)現(xiàn)具有傳染性的HE患者，準(zhǔn)確評判HE急性感染、亞臨床感染、既往感染，對臨床處理及預(yù)后判斷有重要意義。做到及早隔離傳染源，防止病毒污染水源和食物，造成大規(guī)模暴發(fā)流行。

1 HEV RNA、抗-HEV IgA、抗-HEV IgM和抗-HEV IgG與HE的關(guān)系

1.1 HEV RNA與HE的關(guān)系 HE潛伏期平均4～6周，在出現(xiàn)臨床癥狀之前或同時即有糞便排毒和病毒血癥，然后才出現(xiàn)肝損害，血清HEV抗體在起病前1周左右開始升高，HEV RNA在血清或糞便中出現(xiàn)較早，HEV RNA的檢測是HE確診的指標(biāo)，但大多數(shù)患者的病毒血癥持續(xù)時間較短，平均約為2周，病毒載量低，所以檢出率較低，故RT-PCR法檢測HEV RNA陰性的病例不能排除HE。鑒于PCR結(jié)果受標(biāo)本采集時間的限制，而且PCR操作復(fù)雜、成本高、易受污染、會造成誤診或漏診，因此不宜作為常規(guī)檢測項目在臨床廣泛開展[5]。

1.2 抗-HEV IgM與HE的關(guān)系 目前HE的診斷主要依靠血清HEV抗體檢測，抗-HEV IgM是HE急性感染的診斷指標(biāo)之一[6-7]，在感染HEV第2周就可以在血清中被檢測到，第6周達到高峰，隨后迅速下降，陽性持續(xù)時間較短(3個月左右)。而且抗-HEV IgM現(xiàn)有診斷試劑常有漏診和誤診。眾所周知，類風(fēng)濕因子等的存在會影響血清IgM的檢測，造成假陽性，這在其他疾病檢測中屢見不鮮，抗-HEV IgM檢測也不例外[8-9]。而抗-HEV IgM檢測也常常有假陰性報道，Nicand等[5]在抗-HEV IgM陰性的HE亞臨床感染患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)病毒血癥和糞便排毒；Mitsui等[10]也報道在醫(yī)療工作人員系列血清追蹤調(diào)查中，HE亞臨床型感染患者出現(xiàn)短暫病毒血癥，而IgM檢測持續(xù)陰性；Gotanda等[11]報道了在谷丙轉(zhuǎn)氨酶明顯升高的獻血員中，出現(xiàn)HEV病毒血癥卻無IgM反應(yīng)性，等等。最近，Zhao等[9]又發(fā)現(xiàn)在11例HEV抗原陽性的HE患者血清中，抗-HEV IgM陰性。這部分漏診的帶毒者即成為HEV的移動傳染源，有可能是造成HE區(qū)域性小規(guī)模流行和持續(xù)散發(fā)的原因。這說明現(xiàn)有的IgM診斷試劑尚不能滿足HEV感染的臨床診斷和流行病學(xué)篩查與防治的需要。

1.3 抗-HEV IgG與HE的關(guān)系 抗-HEV IgG一般在發(fā)病2周后可檢測到，在第7周達到高峰，并能一直保持在較高的水平，至少可持續(xù)1年甚至數(shù)年，因此抗-HEV IgG不能鑒別患者為HEV急性感染還是既往感染[8,12]。有研究表明IgG抗體親和力高低測定可診斷是否為急性感染。通常感染初期IgG親和力低，恢復(fù)期IgG親和力高，但重復(fù)感染患者通常也表現(xiàn)為IgG親和力高。這種情況在孕婦弓型蟲感染患者中也有報道。雖然抗體親和力能用來區(qū)分感染時間，特別是亞臨床和無黃疸的患者，也可以鑒定抗-HEV IgM陰性的急性感染，但高和低親和力的區(qū)分不得不憑經(jīng)驗，而且不是所有急性感染都是抗-HEV IgG親和力都低，也有的患者發(fā)病早期抗-HEV IgG陽性，而親和力高，因此抗體親和力實驗只能作為一種驗證實驗[13]。

1.4 抗-HEV IgA與HE的關(guān)系 IgA作為免疫球蛋白中一個重要的成員，在黏膜免疫中起著重要的作用。認為可以作為外部屏障作用阻止病毒吸附到黏膜上皮細胞，同時攔截正在感染上皮細胞的病毒，并通過分泌作用將截獲的病毒送回到上皮細胞外，已經(jīng)證實在脊灰病毒、漢坦病毒等感染中，IgA發(fā)揮不容忽視的作用[14-15]。EBV-VCA-IgA的檢測已被公認是鼻咽癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、預(yù)后監(jiān)測及大規(guī)模普查的敏感、可靠、簡便的方法，是提高鼻咽癌早期確診率的有效途徑[16]。IgA抗體被證實在一些病毒性疾病的急性感染期升高，可以作為早期診斷的標(biāo)志。

在大部分HEV早期感染患者中，可檢測到抗-HEV IgM和抗-HEV IgA陽性，但抗-HEV IgA陽性持續(xù)時間比抗-HEV IgM長，平均約為(120±23)d，對HEV感染的早期診斷更有意義[8]。早在1993年Chau等[17]就發(fā)現(xiàn)血清抗-HEV IgA與IgM同步升高，在恢復(fù)期消失，可以作為HEV急性期的感染指標(biāo)。近年來越來越多的研究證實了這種觀點[18-19]，IgA作為HEV急性診斷指標(biāo)的研究越來越受到人們的重視。Takahashi等[20]在豬感染HEV的研究中發(fā)現(xiàn)，抗-HEV IgA與病毒血癥的相關(guān)性遠遠高于抗-HEV IgM，提示抗-HEV IgA可以指示排毒。而且有些急性感染的患者沒有ALT的升高，會有短期的病毒血癥，抗-HEV IgG陽性，抗-HEV IgM陰性，卻可以檢測到抗-HEV IgA陽性，類似情況在脊髓灰質(zhì)炎病毒、漢坦病毒引起的病例中也有過相關(guān)報道[14-15]。有研究表明抗-HEV IgA是HE的急性指標(biāo)，可代替或輔助現(xiàn)有IgM診斷試劑用于HE診斷，既增加了檢測特異性，又能有效減少漏診[19-21]。

2 抗-HEV IgA的檢測方法

2.1 蛋白印跡試驗檢測抗-HEV IgA 有文獻報道用蛋白印跡試驗檢測抗-HEV IgA[22]，這種方法具有靈敏度高、特異性好的特點，可用作HE患者的確證試驗。但這種方法操作復(fù)雜，耗時較長，影響因素較多，不適合在臨床上廣泛開展。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測抗-HEV IgA的方法，具有靈敏、快速、操作簡便、費用較低的優(yōu)點，操作中可用較少的人力快速處理大批量血清標(biāo)本，檢測結(jié)果既可直接用肉眼定性判斷，也可借助酶標(biāo)儀精確定量讀數(shù)，數(shù)據(jù)重復(fù)性好，結(jié)果客觀可靠，還可借助全自動酶免分析儀使操作過程實現(xiàn)自動化、標(biāo)準(zhǔn)化，適合臨床常規(guī)檢測，是目前HE實驗室輔助診斷方法的研究熱點。

2.2 HEV IgA間接法ELISA 目前文獻報道檢測抗-HEV IgA多用間接法ELISA，其原理是將用已包被抗原與特異性IgM、IgG、IgA結(jié)合，由于患者血清中存在大量的抗-HEV IgG、抗-HEV IgM與抗-HEV IgA競爭結(jié)合位點，從而敏感性降低，須通過去除抗-HEV IgG和抗-HEV IgM來提高其敏感性[9]。同時因間接法所包被抗原采用基因1型或2型HEV重組蛋白或合成肽抗原，有研究表明，用第1、2基因型多肽做抗原對檢測第3和4基因型感染患者的抗-HEV IgG、抗-HEV IgM和抗-HEV IgA時，其反應(yīng)不敏感[23]。最近，Bendall等[13]研究發(fā)現(xiàn)，以HEV第1、2基因型抗原建立的ELISA診斷試劑在檢測英國本土HEV第3基因型感染的患者血清時，急性期HEV抗體檢出率可達95%，而半年后檢出率僅為12%。Herremans等[22]則發(fā)現(xiàn)以HEV第1、2型抗原檢測HEV第1型感染，檢出率為100%，而檢測第3基因型毒株感染時，檢出率僅為67%(ELISA)和57%(immunoblot assay)。由于HEV具有多基因型的特征，不同基因型抗原和感染不同基因型HEV患者血清反應(yīng)時會出現(xiàn)抗原抗體結(jié)合的差異，這是導(dǎo)致一些檢測方法漏檢的主要原因。因此建立高靈敏度和特異性的ELISA檢測方法需要使用具有廣泛反應(yīng)性的抗原，尤其是對我國這樣存在多基因型HEV感染的國家以及地區(qū)進行臨床診斷和流行病學(xué)篩查[4]。

3 抗-HEV IgA檢測需要解決的問題

抗-HEV IgA抗體被證實在HEV急性感染期升高，可以作為早期診斷的標(biāo)志，已經(jīng)越來越被認可和重視。目前國內(nèi)外還沒有抗-HEV IgA診斷試劑盒正式上市，雖然檢測抗-HEV IgA方法已經(jīng)有了很大的進展，但還存在很多問題：①因各種檢測方法采用的抗原不盡相同，因此敏感性差。最早對HEV的研究表明，HEV基因型按地理位置分布，一個地方只存在一種基因型，但是隨著新的HEV毒株不斷被發(fā)現(xiàn)，同一個地區(qū)可以存在兩種及以上的基因型。隨著與經(jīng)濟發(fā)展相適應(yīng)的全球人員流動性的增加以及HEV研究的深入，HEV基因型的地域分布特征已經(jīng)并將繼續(xù)發(fā)生重要改變。這種情況下，使用多基因型混合抗原建立酶聯(lián)免疫檢測方法，可以大大減少漏診率。②因為抗IgA與IgA不同片段結(jié)合位點的差異，導(dǎo)致檢測方法的敏感性也會有較大差異，選擇與IgA反應(yīng)性高的抗IgA單克隆抗體，可提高抗-HEV IgA檢測的敏感性和特異性[17]。③IgA可以從黏膜中分泌，故如能取唾液進行檢測，不僅方便而且減輕患者痛苦，值得進一步研究。④在免疫球蛋白缺乏癥患者中，HEV近期感染者其抗-HEV IgA可能表現(xiàn)為陰性。⑤通過血液傳播的患者可逃避黏膜免疫，IgA很低甚至沒有。

4 抗-HEV IgA檢測前景展望

目前，對抗-HEV IgA的診斷價值也越來越重視，研制具有高特異性和敏感性的診斷試劑盒具有十分重要的意義。目前IgA類抗體檢測方法除了蛋白印跡試驗檢測，間接法ELISA外，捕獲法ELISA也有較好應(yīng)用，如冠狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等的IgA抗體的檢測[14-24]。其原理是首先將高特異性的抗人IgA α鏈McAb包被于微孔板，專一地捕獲血清中的IgA，不與IgM、IgG或其他種類的免疫球蛋白結(jié)合，然后抗原特異性IgA抗體與酶標(biāo)抗原結(jié)合，再加入底物液顯色。目前IgA捕獲法ELISA在HEV抗體檢測中還沒有相關(guān)報道，但張?zhí)m芳等[25]已成功建立了基于多基因型HEV混合抗原的IgM抗體捕獲法ELISA。該法與間接法ELISA相比，前者陰性本底很低，陰性和陽性結(jié)果區(qū)別更加明顯，便于結(jié)果的判斷，所用的酶標(biāo)抗原是不同基因型和亞型混合抗原，抗原性穩(wěn)定，共同抗原表位在不同基因型之間可誘發(fā)交叉中和反應(yīng)，能檢測出來源于不同國家和地區(qū)的血清標(biāo)本，具有較為廣泛的血清反應(yīng)性，漏檢的機會少，敏感性高。HEV IgM捕獲法ELISA的建立及其他病毒IgA抗體捕獲法ELISA的建立為HEV IgA捕獲法ELISA的建立奠定了基礎(chǔ)。

[1]Matsubayashi K,Kang JH,Sakata H,et al.A case of transfusion-transmitted hepatitis E caused by blood from a donor infected with hepatitis E virus via zoonotic food-borne route[J].Transfusion,2008,48(7):1368-1375.

[2]Kamar N,Mansuy JM,Cointault O,et al.Hepatitis E virusrelated cirrhosis in kidney-and kidney-pancreas-transplant recipients[J].Am J Transplant,2008,8(8):1744-1748.

[3]Khuroo MS,Kamili S,Khuroo MS.Clinical course and duration of viremia in vertically transmitted hepatitis E virus(HEV)infection in babies born to HEV-infected mothers[J].J Viral Hepat,2009 Feb 18.[Epub ahead of print].

[4]喬偉振，孟繼鴻.戊型肝炎病毒基因型地域分布的演變[J].國外醫(yī)學(xué)·病毒學(xué)分冊，2004，11(1)：29-32.

[5]Nicand E,Grandadam M,Teyssou R,et al.Viraemia and faecal shedding of HEV in symptom-free carriers[J].Lancet,2001,357:68-69.

[6]Yu C,Engle RE,Bryan JP,et al.Detection of immunoglobulin M antibodies to hepatitis E virus by class capture enzyme immunoassay[J].Clin Diagn Lab Immunol,2003,10(4):579-586.

[7]Seriwatana J,Shrestha MP,Scott RM,et al.Innis BL.Clinical and epidemiological relevance of quantitating hepatitis E virusspecificimmunoglobulin M[J].ClinDiagn LabIm-munol,2002,9(5):1072-1078.

[8]Tian DY,Chen Y,Xia NS.Significance of serum IgA in patientswith acute hepatitisE virusinfection[J].World J Gastroenterol,2006,12:3919-3923.

[9]Zhao C,Li L,Harrison TJ,et al.Relationships among viral diagnostic markersand markersof liverfunction in acute hepatitis E[J].J Gastroenterol,2009,44(2):139-145.

[10]MitsuiT,Tsukamoto Y,SuzukiS,etal.Serologicaland molecular studies on subclinical hepatitis E virus infection using periodic serum samples obtained from healthy individu als[J].J Med Virol,2005,76:526-533.

[11]Gotanda Y,Iwata A,Ohnuma H,et al.Ongoing subclinical infection of hepatitis E virus among blood donors with an elevated alanine aminotransferase level in Japan[J].J Med Virol,2007,79:734-742.

[12]周暉，江楚文，李魯平，等.兩種戊型肝炎IgM抗體診斷試劑的比較[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，42(9)：667-671.

[13]BendallR,Ellis V,Ijaz S,etal.Serologicalresponse to hepatitis E virus genotype 3 infection:IgG quantitation,avid ity,and IgM response[J].J Med Virol,2008,80:95-101.

[14]張禮璧，信洪武，裴紅英，等.捕獲法ELISA檢測脊髓灰質(zhì)炎IgA抗體方法的建立與應(yīng)用[J].病毒學(xué)報，1998，9(8)：255-258.

[15]孟祥芝，陳宇萍，李川，等.用重組漢坦病毒NP、GP檢測急性期HFRS患者血清中特異性IgG、IgM、IgA抗體[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2003，17(3)：254-257.

[16]李群.EB病毒VCA-IgA和EA-IgA抗體與鼻咽癌診斷的關(guān)系[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，13(2)：180-183.

[17]Chau KH,Dawson GJ,Bile KM,et al.Detection of IgA class antibody to hepatitis E virus in serum samples from patients with hepatitis E virus infection[J].J Med Virol,1993,40(4):334-338.

[18]Zhang S,Tian D,Zhang Z,etal.Clinicalsignificance of anti-HEV IgA in diagnosisof acute genotype 4 hepatitis E virus infection negative for anti-HEV IgM[J].Dig Dis Sci,2009,54(11):2512-2518.

[19]Elkady A,Tanaka Y,Kurbanov F,et al.Evaluation of anti-hepatitis E virus(HEV)immunoglobulin A in a serological screening for HEV infection[J].J Gastroenterol,2007,42(11):911-917.

[20]Takahashi M,Nishizawa T,Tanaka T,et al.Correlation be tween positivity for immunoglobulin A antibodies and viraemia of swine hepatitis E virus observed among farm pigs in Japan[J].J Gen Virol,2005,86(6):1807-1813.

[21]Gotanda Y,Iwata A,Ohnuma H,et al.Ongoing subclinical infection of hepatitis E virus among blood donors with an elevated alanine aminotransferase level in Japan[J].J Med Virol,2007,79(6):734-742.

[22]Herremans M,Duizer E,Jusic E,et al.Detection of hepatitis E virus-specific immunoglobulin A in patients infected with hepatitis E virus genotype 1 or 3[J].Clin Vaccine Immunol,2007,14(3):276-280.

[23]SchlauderGG,Dawson GJ,ErkerJC,etal.Thesequence and phylogenetic analysis of a novel hepatitis E virus isolated from a patient with acute hepatitis reported in the U-nited States[J].J Gen Virol,1998,79:447-456.

[24]Naslund K,Traven M,Larsson B,etal.Capture ELISA systems for the detection of bovine coronavirus-specfic IgA and IgM antibodies in milk and serum[J].Vet Microbiol,2000,72(3-4):183-206.

[25]張?zhí)m芳，胡正，李梅，等.鼠源性抗人IgM μ鏈單克隆抗體的制備和鑒定[J].實用醫(yī)技雜志，2004，11(10B)：2095-2096.