精子運(yùn)動(dòng)能力評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展

尚可可，張西亞，韓勝利，李國翬

（1.天津大學(xué) 精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 設(shè)備科，天津 300052；3.天津市計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)科學(xué)研究院， 天津300192； 4.天津開發(fā)區(qū)奧金高新技術(shù)有限公司，天津 300072）

目前，全國育齡夫婦約2.3億人，不孕不育發(fā)生率在15%～20%，男性不育的發(fā)病率呈逐漸增加的趨勢(shì),約占男女不育不孕的一半。男性不育的臨床評(píng)估和基礎(chǔ)研究的一項(xiàng)重要試驗(yàn)是精子受孕能力檢測(cè)。

精子受孕能力是生育能力的重要指標(biāo)，由于受精過程是一個(gè)復(fù)雜的理化反應(yīng)過程，受到許多因素的影響，在實(shí)際操作中，直接測(cè)量體內(nèi)受孕能力[1-3]比較困難、成本高、方法繁瑣。而精子離體運(yùn)動(dòng)能力分析在某方面與精子體內(nèi)受孕能力存在著良好的相關(guān)性，因此，精子運(yùn)動(dòng)能力是評(píng)價(jià)受孕能力重要的指標(biāo)。

精子運(yùn)動(dòng)能力客觀評(píng)價(jià)方法經(jīng)歷了最初的肉眼顯微鏡觀察方法、光散射測(cè)量到計(jì)算機(jī)輔助精子運(yùn)動(dòng)特性分析，對(duì)精子運(yùn)動(dòng)能力評(píng)價(jià)越來越準(zhǔn)確、越來越客觀。本文對(duì)精子運(yùn)動(dòng)能力評(píng)價(jià)方法進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。

1 傳統(tǒng)人工精子運(yùn)動(dòng)能力分析

傳統(tǒng)的人工精子運(yùn)動(dòng)能力分析由有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生通過生物顯微鏡放大精液樣本圖像，觀察一定數(shù)量的精子，計(jì)數(shù)一定的時(shí)間內(nèi)精子運(yùn)動(dòng)經(jīng)過的距離，然后計(jì)算平均值。這種人工的計(jì)數(shù)方法主觀性強(qiáng)、準(zhǔn)確性低、重復(fù)性差，而且操作醫(yī)生需要經(jīng)過特殊訓(xùn)練和長(zhǎng)期實(shí)踐。

隨后出現(xiàn)定時(shí)曝光技術(shù)，采用暗視野顯微鏡對(duì)運(yùn)動(dòng)中的精子進(jìn)行定時(shí)曝光拍照，根據(jù)不同精子留下的軌跡長(zhǎng)度，可以求出它們運(yùn)動(dòng)速度的快慢。該方法缺點(diǎn)是曝光時(shí)間太長(zhǎng)、軌跡粗重、重疊后不易辯認(rèn)。如單純縮短曝光時(shí)間，精子運(yùn)動(dòng)的軌跡又太短，難于比較運(yùn)動(dòng)的差異。

為了克服定時(shí)曝光技術(shù)的問題，多次曝光技術(shù)被采用。在光源與視野之間加一個(gè)黑盤，上面有6條狹縫透光，在1s曝光時(shí)間，黑盤轉(zhuǎn)一圈，這時(shí)精子的運(yùn)動(dòng)軌跡就成了6個(gè)連成串的亮圓圈，克服了上述缺點(diǎn)。該方法在一些臨床和研究單位仍被采用。

2 激光光散射測(cè)量法

激光光散射方法是通過分析精子散射光光譜獲得精子的運(yùn)動(dòng)特性。激光器發(fā)射的光經(jīng)濾光片衰減后，照射精子發(fā)生光散射，根據(jù)光學(xué)多普勒效應(yīng)，精子活動(dòng)速度決定散射光的光譜。通過頻譜分析，可以得到精子運(yùn)動(dòng)速度平均值及速度分布函數(shù)等運(yùn)動(dòng)指數(shù)。該方法可以無害地同時(shí)對(duì)數(shù)百個(gè)精子運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行實(shí)時(shí)、在線評(píng)價(jià)，完全排除主觀因素。

宋傳琳等[4]在上世紀(jì)90年代已經(jīng)開始研究該方法，基于該方法，經(jīng)過1000多例臨床研究，證實(shí)了正常人精子運(yùn)動(dòng)速度平均為35μ m/s，多數(shù)不育病人的精子運(yùn)動(dòng)速度偏低，平均為31μ m/s，低于28μ m/s者可認(rèn)為精子活力不正常。

該方法設(shè)備簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟、已得到較廣泛應(yīng)用。然而，該方法只能測(cè)得精子運(yùn)動(dòng)指數(shù)，不能得到精子形態(tài)及運(yùn)動(dòng)姿態(tài)等參數(shù)。精子形態(tài)是精子的重要特征,近年來國際上非常重視人類精子的形態(tài)學(xué)分析。體外受精研究表明,正常形態(tài)精子數(shù)量與受精率呈正相關(guān),畸形精子很少能結(jié)合到卵透明帶上[5]。

3 精子動(dòng)態(tài)特性計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析方法

近年來，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和圖像處理技術(shù)的發(fā)展，計(jì)算機(jī)輔助精子運(yùn)動(dòng)能力分析(CASA)方法得到迅速發(fā)展。該方法是將顯微鏡下精子圖像采集到計(jì)算機(jī)中，結(jié)合圖像處理技術(shù)，實(shí)時(shí)、在線顯示分析精子的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)軌跡。在此基礎(chǔ)上計(jì)算WHO手冊(cè)規(guī)定精子曲線運(yùn)動(dòng)速度（VCL）、直線運(yùn)動(dòng)速度、精子密度、精子活率等參數(shù)[6]。通過多元方差分析獲知精子活動(dòng)的模式、活力和耐力的綜合情況。

CASA方法測(cè)量結(jié)果受系統(tǒng)參數(shù)[7]、圖像采集時(shí)閾值設(shè)定[8]、圖像采集卡性能[9]、圖像處理算法[10]等因素的影響，采用該方法進(jìn)行測(cè)量需要建立嚴(yán)格的取樣、操作流程，測(cè)試時(shí)溫度嚴(yán)格保持在25～35℃，精子計(jì)數(shù)板深度為8～10μ m。

為了對(duì)CASA方法客觀評(píng)價(jià)，進(jìn)行了一系列對(duì)比試驗(yàn)。宋傳琳等采用CASA方法與激光散射方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩種方法測(cè)量結(jié)果有很高的相關(guān)性[11]。Rajinder S. Sidhu[12]采用CASA方法與人工觀測(cè)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明：當(dāng)精子濃度低于20×106/mL時(shí)，CASA方法和人工檢測(cè)的結(jié)果偏差較大；當(dāng)樣本經(jīng)過冷凍復(fù)蘇， CASA檢測(cè)結(jié)果偏低。Mathew James Tomlinson[13]對(duì)已知濃度的模擬介質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：CASA檢測(cè)結(jié)果比人工檢測(cè)精度和準(zhǔn)確性要好。因此該方法為醫(yī)學(xué)臨床和科研提供了一種客觀、定量、準(zhǔn)確的測(cè)試手段[14,15]。此外，該技術(shù)還在各類動(dòng)物檢測(cè)中有廣泛運(yùn)用[16]。

CASA系統(tǒng)包括顯微成像部分、光電圖像轉(zhuǎn)化部分和圖像處理及分析部分。前兩部分技術(shù)較為成熟，目前研究工作主要集中在精子目標(biāo)追蹤算法及目標(biāo)識(shí)別[17]。其中，雜質(zhì)的有效識(shí)別和精子密集區(qū)的多精子跟蹤是難點(diǎn)。CASA系統(tǒng)使用時(shí)，雜質(zhì)包括小氣泡、環(huán)境的固態(tài)雜質(zhì)和精液自身雜質(zhì)。環(huán)境的固態(tài)雜質(zhì)和精液自身雜質(zhì)，和精子面積差別大，容易篩除，而小氣泡和精子不論面積還是圖像灰度十分接近，難于區(qū)分，最好的解決方法是采用熒光標(biāo)記的方法來區(qū)分。

CASA系統(tǒng)總體來說技術(shù)較為成熟，目前處于產(chǎn)品研發(fā)階段。各機(jī)構(gòu)在產(chǎn)品的易用性和智能性方面進(jìn)行了深入研究。

4 發(fā)展展望

分子生物學(xué)研究深入和檢測(cè)技術(shù)發(fā)展，使精子檢測(cè)從宏觀向微觀發(fā)展。光譜檢測(cè)技術(shù)為監(jiān)測(cè)精子內(nèi)部成分變化提供了手段，Aleksander Giwercman[18]研究了精子活力和染色體結(jié)構(gòu)的關(guān)系，徐德祥[19]采用原子吸收光譜檢測(cè)血清和精液中硒濃度。

隨著人工授精技術(shù)發(fā)展，單個(gè)精子質(zhì)量評(píng)價(jià)越來越受矚目，采用光鑷技術(shù)[20]結(jié)合拉曼光譜對(duì)單個(gè)精子進(jìn)行操控和進(jìn)行分子層面的檢測(cè)成為該領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

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