白菜類蔬菜作物離體再生研究進(jìn)展

樊明琴 朱月林 朱茂英 許樹成 李焰焰

（1阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽 236041；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095）

白菜類蔬菜屬于十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）蕓薹種（B.campestris L.）中的栽培亞種群，是我國重要的蔬菜作物。目前，為進(jìn)一步提高白菜類蔬菜的品質(zhì)、抗病蟲性和抗逆性等，采用基因工程技術(shù)將目的基因?qū)氚撞祟愂卟?，在保持其原有?yōu)良性狀的基礎(chǔ)上改良白菜類蔬菜的遺傳特性，為白菜類蔬菜遺傳育種提供了新技術(shù)。但是基因工程技術(shù)的應(yīng)用要求高效的不定芽再生體系，而白菜類蔬菜屬于蕓薹屬離體不定芽再生困難型植物（Lim et al.，1998），這是對其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的主要障礙（張松 等，1997）。隨著人們對離體條件下誘導(dǎo)白菜類蔬菜外植體再生植株的機(jī)理及影響因素等研究的不斷深入，目前，國內(nèi)外不少學(xué)者已有利用白菜類蔬菜的腋芽、子葉、下胚軸、真葉、小孢子以及原生質(zhì)體等（李曙軒和裘文達(dá)，1983；申書興 等，1999；侯喜林 等，2000；成細(xì)華 等，2001；Kang et al.，2002；邢德峰 等，2003）獲得再生植株的報(bào)道。白菜類蔬菜再生體系的建立已經(jīng)取得快速發(fā)展，現(xiàn)將有關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 植物材料基因型

植物材料的基因型對離體培養(yǎng)的效果有重要影響，不同栽培種之間植株再生能力不同。Dietert等（1982）認(rèn)為基因型是限制白菜類蔬菜再生的一個重要因素。Murata和Orton（1987）研究指出，調(diào)控芽形成的基因可能位于C基因組，白菜類蔬菜（AA基因組）由于缺少C基因組而難于再生。Hachey等（1991）研究發(fā)現(xiàn)同屬于Canola型的5個栽培種在同一培養(yǎng)基上的再生頻率相差不大，均大于40%，但非Canola型的R-500的再生頻率不到10%。曹家樹等（2000）以杭州油冬兒等7個白菜類栽培種和1個雜交親本為試材，研究發(fā)現(xiàn)青梗類品種的植株再生頻率明顯高于白梗類品種。張鳳蘭等（2002a）對從中國和日本搜集到的123個大白菜品種和20個普通白菜（小白菜）品種進(jìn)行子葉培養(yǎng)，123個大白菜品種中有8個品種無不定芽再生，其余 115個品種再生頻率為2.5 %～95.0%不等；20個普通白菜品種中有5個品種無不定芽再生，其余15個品種不定芽再生頻率為6.7 %～97.5 %。張松等（2002）以36個不同生態(tài)型的大白菜品種為試材，研究了基因型對芽分化的影響，再生頻率為0～86.67 %。不同品種之間，芽再生頻率差異較大，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道的基因型對植株再生頻率有很大影響的觀點(diǎn)相一致（Jain et al.，1988；李世軍 等，1994）。因此，在試驗(yàn)中應(yīng)盡量選擇植株再生頻率較高的基因型材料。

2 植物外植體

2.1 外植體類型

外植體各部分的再生能力有很大差異，因此外植體的選用是影響白菜類蔬菜離體培養(yǎng)再生頻率的因素之一。白菜類蔬菜用于轉(zhuǎn)化的外植體較常用的為下胚軸、帶柄子葉、子葉等（蔡小寧 等，1995；余小林 等，2001；張鳳蘭 等，2002b；高紅亮 等，2008）。由于具有取材不受季節(jié)限制、誘導(dǎo)再生快、轉(zhuǎn)化突變率低等優(yōu)點(diǎn)，利用這些外植體獲得了多個成功的轉(zhuǎn)化。王凌健等（1999）用普通白菜的子葉和下胚軸作外植體誘導(dǎo)分化，子葉的分化頻率可達(dá)56.3 %，下胚軸為37.0%。其中廣泛采用的是無菌種子苗的帶柄子葉（于占東 等，2005）。杜虹等（2000）在大白菜離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)子葉外植體誘導(dǎo)大白菜芽再生比下胚軸好，而帶有子葉柄的外植體比不帶子葉柄的分化頻率高，很可能是由于這一部分外植體包含分化能力較強(qiáng)的原分生細(xì)胞和子葉塊營養(yǎng)（曹家樹等，2000）。

2.2 外植體的生理狀態(tài)

外植體的生理狀態(tài)對白菜類蔬菜離體再生及轉(zhuǎn)化頻率也有很大影響。不同生長期的無菌苗明顯影響外植體不定芽再生能力。一般情況下，幼嫩組織比老化組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力。如普通白菜，3～4 d苗齡的無菌苗，其子葉和下胚軸作外植體，不定芽、苗的再生能力遠(yuǎn)大于其他苗齡。Zhang等（1998）、張智奇等（1998）、曹家樹等（2000）都以4 d苗齡的普通白菜外植體作為試驗(yàn)對象。謝建坤等（2000）認(rèn)為5～9 d苗齡的外植體可以獲得較高的不定芽再生頻率，但對于不同基因型、不同的外植體來說，其最佳苗齡也有不同，杭州油冬兒普通白菜以7 d苗齡的子葉對不定芽的誘導(dǎo)效果最佳；高華普通白菜為7 d；香港菜薹為9 d。其機(jī)理可能是苗齡短的外植體切面薄壁細(xì)胞具有較高的再生能力，而苗齡較長的外植體，其切面細(xì)胞已開始分化，細(xì)胞分裂能力逐漸降低，故不定芽再生頻率低。由此看來，不同品種，不同外植體類型具有不同的最適取材時間。

2.3 外植體接種方式

張松等（2001）發(fā)現(xiàn)接種方式對大白菜子葉不定芽再生起著重要作用。朱麗華等（2006）以大白菜的下胚軸為材料，研究了3種不同接種方式對不定芽發(fā)生的影響，結(jié)果表明，與反插和平放的外植體相比，形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基的正插方式明顯有利于不定芽的再生。接種方式的不同使外植體所處環(huán)境不同，可能是插植較平放更能使子葉柄切口端充分接觸培養(yǎng)基，吸收外源激素，同時亦能吸收子葉內(nèi)源激素，有利于芽的再生。

3 培養(yǎng)基及其添加物

3.1 培養(yǎng)基

白菜類蔬菜離體培養(yǎng)中普遍用MS為基本培養(yǎng)基。王凌健等（1999）研究發(fā)現(xiàn)，降低培養(yǎng)基中濃度有利于減少普通白菜外植體分化過程中愈傷組織的形成。侯喜林和曹壽椿（1994）報(bào)道MS培養(yǎng)基中鹽濃度降低至原來的1/2倍，蘇州青普通白菜外植體的分化率由31.1 %提高到36.7 %。

3.2 瓊脂

劉凡等（1997）在大白菜小孢子胚培養(yǎng)中把培養(yǎng)基瓊脂含量由0.8 %提高到1.2 %，可以明顯促進(jìn)胚的正常發(fā)育，減少畸形玻璃苗和二次分化成苗數(shù)量，大大提高成苗率。Zhang等（1998）用不同瓊脂濃度的培養(yǎng)基處理大白菜外植體，發(fā)現(xiàn)瓊脂濃度為1.2 %或1.6 %的培養(yǎng)基比濃度為0.8 %的培養(yǎng)基不定芽再生頻率高2～3倍。這可能是高濃度的瓊脂含量改變培養(yǎng)基中水分的存在狀態(tài)，同時培養(yǎng)基中濕度下降，改變了離體再生的小氣候從而使再生頻率提高。

3.3 植物激素組成

在白菜類蔬菜離體再生培養(yǎng)中，影響外植體再生頻率的主要因素是外源激素的含量（張鳳蘭等，2002a）。目前在建立白菜類蔬菜不定芽再生體系的報(bào)道中，6-BA與NAA的組合最多。高紅亮等（2008）在普通白菜兩個品種的帶柄子葉離體培養(yǎng)中用6-BA 4 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，不定芽再生頻率為81.7 %。很多試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，BA和NAA結(jié)合使用優(yōu)于單獨(dú)使用的效果。張鵬和凌定厚（1995）在進(jìn)行菜薹離體植株再生頻率研究時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中分別使用BA和NAA時，植株再生頻率分別為7.8 %和5.5 %，兩者同時使用再生頻率提高4倍，與前人在蕓薹屬其他作物的外植體誘導(dǎo)芽器官發(fā)生取得的結(jié)果類似（Bhalla & Smith，1998）。

近年來有些報(bào)道苯基脲型的細(xì)胞分裂素TDZ等對誘導(dǎo)不定芽或胚狀體的形成比BA有更好的效果（馬光 等，2008；李玉玲 等，2008）。盧永恩等（2003）以兩種大白菜子葉為外植體，發(fā)現(xiàn)TDZ具有比BA更高的細(xì)胞分裂素活性，0.25 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1NAA組合促進(jìn)作用比2 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA組合還要好，且子葉再生頻率高、出芽迅速、芽點(diǎn)多。朱月林和李式軍（2001）報(bào)道在2個日本普通白菜品種中的子葉不定芽再生頻率最高，為96.7 %。樊明琴等（2005）對結(jié)球大白菜的子葉離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，TDZ的不定芽分化率為75 %，6-BA的分化率僅為58.3 %。但是TDZ的濃度不是越高越好，高濃度的TDZ有一定的毒害作用，導(dǎo)致愈傷組織褐化，誘導(dǎo)的不定芽多呈叢生狀，不易分離，且芽成苗較困難，出現(xiàn)矮化、葉片卷曲、玻璃化等現(xiàn)象。高濃度BA也不利于植株再生。這表明，特定基因型的特定外植體對不同的細(xì)胞分裂素的要求都有一定濃度范圍，濃度過高和過低都影響其再生。另外，細(xì)胞分裂素必須與一定濃度的生長素配合，生長素濃度過高和過低均不利于植株再生。

3.4 AgNO3

在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，篩選培養(yǎng)基中加入AgNO3作為乙烯抑制劑促進(jìn)AA基因組作物再生的報(bào)道較多（Chi & Pua，1989；張鵬和凌定厚，1995；張松 等，1997；Zhang et al.，1998；吳昌銀 等，1999；曹家樹 等，2000）。據(jù)Zhang等（1998）報(bào)道，大白菜離體培養(yǎng)中添加適量的AgNO3能有效促進(jìn)不定芽的發(fā)生，并提高正常不定芽的比率。杜虹等（2000）研究表明，大白菜離體不定芽再生頻率從無添加AgNO3的28.2 %提高到添加的71.7 %。吳昌銀等（1999）的研究表明，AgNO3在普通白菜子葉的離體再生中是必須的。大多數(shù)研究認(rèn)為AgNO3之所以促進(jìn)植物培養(yǎng)物的再生，可能是由于 Ag+競爭性結(jié)合位于細(xì)胞間膜的乙烯受體部位從而抑制乙烯活性，并且干擾乙烯信號傳遞途徑，減輕培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的乙烯對不定芽發(fā)生及形態(tài)建成的抑制作用，從而促進(jìn)器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生（Chi et al.，1991）。

但當(dāng)AgNO3濃度超過某一臨界值時，對外植體分化反而有抑制作用，導(dǎo)致外植體形成畸形芽，不定芽分化率急劇下降。高武軍等（2002）在油菜離體培養(yǎng)上也有類似報(bào)道。這可能是由于 Ag+是重金屬，濃度太高時會對植物產(chǎn)生毒害作用（Mckeron & Yang，1989）。因而關(guān)于AgNO3的作用機(jī)理有待深入研究。

4 結(jié)束語

影響白菜類蔬菜作物離體再生的各種因素是相互作用的，通過選擇適宜的外植體類型和最佳生理時期，改良培養(yǎng)條件等方式，誘導(dǎo)控制其分化和發(fā)育的分子開關(guān)（molecular switch）的開放等，綜合所有的因素進(jìn)行優(yōu)化才能獲得高效的白菜類蔬菜離體培養(yǎng)再生體系（邢德峰 等，2003）。從總體研究來看，白菜類蔬菜離體再生系統(tǒng)仍不完善，再生頻率普遍不高，有關(guān)提高白菜類蔬菜離體再生頻率和遺傳轉(zhuǎn)化率的生理生化機(jī)制研究仍需進(jìn)一步加強(qiáng)。

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