AFLP分子標記技術在昆蟲學研究中的應用及展望

李艷梅, 梁革梅, 趙奎軍*, 郭予元

(1.東北農業(yè)大學農學院,哈爾濱 150030;2.中國農業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

近十年來,現(xiàn)代分子生物學技術的迅猛發(fā)展,尤其是PCR的出現(xiàn),引起了DNA遺傳分析的一場巨大革命。以PCR為基礎的DNA指紋技術大大加快了人類研究遺傳多樣性的步伐,為不同來源和不同復雜程度基因組的分析提供了有力的工具。擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)AFLP技術是由荷蘭Keygene公司的兩位科學家Zabeau和Vos于1992年創(chuàng)立的,于1993年獲歐洲專利局專利,該技術以 RAPD和RFLP技術為基礎,用其長,棄其短,從而成為一種精確、有效的分子標記方法。它的基本原理是首先利用可產(chǎn)生黏性末端的限制性內切酶酶切研究對象的基因組序列,產(chǎn)生不同長度的酶切片段。然后,將這些酶切片段與含有與其有共同黏性末端的人工接頭連接,形成模板。為達到選擇擴增的目的,再按照模板序列,在引物中添加具有選擇性的核苷酸(1～3個),然后PCR擴增,結果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對的酶切片段被擴增。最后擴增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離,根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無來檢出多態(tài)性,也可以通過自顯影技術或者熒光的方法來檢測。

AFLP標記與其他標記如 RAPD、RFLP、SSR(微衛(wèi)星)相比具有許多優(yōu)點。相對于其他技術,在整個基因組水平上,AFLP技術不僅具有高重復性,高分辨率,高靈敏性[1],而且它能夠一次同時擴增50～100條帶。另外,擴增不需要預先知道序列信息[2]。因此,雖然該技術自創(chuàng)立開始首先運用于植物分子生物學的研究中,但因其具有上述優(yōu)點,同時還易于標準化,很快被推廣到生物學的各個領域,如遺傳圖譜的構建,遺傳多樣性分析、基因或基因組區(qū)域特異性標記的篩選和定位、細菌鑒定及疾病診斷和腫瘤研究等。近年來該技術又在酶切、擴增體系、檢測和分析方法等方面不斷得到改進,更為廣泛地應用于多種生物的不同研究領域。

近十年來,AFLP技術受到了昆蟲學研究人員的青睞,已在昆蟲學多個研究領域得到了較為成功的應用,主要用于生物多樣性、種群遺傳分析、連鎖圖譜構建等方面。本文簡要介紹了AFLP分子標記技術在有益昆蟲、重要農業(yè)害蟲、檢疫害蟲等研究中的應用,并對該技術在昆蟲學研究中應用的前景進行了展望。

1 AFLP技術在有益昆蟲中的應用

1.1 種質資源鑒定以及系統(tǒng)進化研究

家蠶(Bombyx mori L.)是重要的經(jīng)濟昆蟲,作為分類學上的一個物種,從地理來源上分為中國系統(tǒng)、日本系統(tǒng)、歐洲系統(tǒng)和亞熱帶及熱帶系統(tǒng)等4大系統(tǒng),有500多個品種,其生態(tài)和經(jīng)濟性狀各具特征。研究家蠶不同地理品種分類、進化、親緣關系和遺傳差異是家蠶種質資源鑒定、保存和利用的依據(jù),也是品種培育和推廣的理論基礎。近年來,DNA分子標記技術的迅速發(fā)展為家蠶品種遺傳多樣性的評價提供了新的途徑。其中,AFLP分子標記技術具有多態(tài)性檢出能力強和結果穩(wěn)定可靠的特點,非常適合品種多樣性檢測和品種鑒定。

魯成等[3]利用AFLP分子標記技術,對我國不同地區(qū)野桑蠶、家蠶和柞蠶進行了系統(tǒng)學研究和品種遺傳多樣性研究,對33個具有代表性的家蠶不同地理品種,以及浙江、陜西、重慶、江蘇、湖北、湖南、遼寧等10個地區(qū)的野桑蠶和5個柞蠶品種進行了DNA多態(tài)性分析和分子系統(tǒng)學研究。

張金衛(wèi)等[4]利用AFLP分子標記技術對浙江省生產(chǎn)上應用的6個家蠶品種(包括正反交)進行了DNA指紋分析,篩選出5對引物,在6個家蠶品種中擴增出157條帶,其中有多態(tài)性帶54條,且這些條帶組合對特定品種的引物是穩(wěn)定的,試驗具有重演性。建立的方法可準確地將供試的6個家蠶品種全部區(qū)分開來。初步建立起利用DNA指紋來進行家蠶品種鑒別的模型,可為保護家蠶育種產(chǎn)權,登錄新品種,以及鑒定和檢測蠶種的真實性和純度,仲裁蠶種糾紛等提供客觀、科學的技術依據(jù)。

1.2 遺傳圖譜的構建與功能基因標記定位

家蠶不僅是一種重要的經(jīng)濟昆蟲,也是生物學研究的極好材料。家蠶遺傳連鎖圖譜是基礎理論研究和實際應用的中間橋梁,是家蠶資源、育種及分子克隆等許多應用研究的理論依據(jù)和基礎。研究人員利用AFLP標記紛紛建立遺傳圖譜,并對重要經(jīng)濟性狀進行了標記定位。其中 Tan等[5]利用AFLP技術首次對家蠶BC1群體進行了分子連鎖圖譜的構建。用35組引物在家蠶品系782和od100的回交子代中得到了1248個分離位點,其中545個在BC1群體中符合1∶1分離比,構建的AFLP遺傳連鎖圖中含356個標記,構成30個連鎖群,每個連鎖群包含4～36個標記,平均為11.9個標記,每個連鎖群長度為37.4～691 cM之間,總的遺傳圖距為6512 cM,標記間的平均距離為18.2 cM。并對性染色體上的基因od進行了定位。萬春玲等[6]、朱玉芳等[7]也分別利用AFLP標記構建了家蠶分子連鎖圖譜。

魯成等[8]利用AFLP技術,對家蠶品系 C100和大造的回交一代BC1群體進行了連鎖圖譜的構建。構建了一張含有408個標記位點,33個連鎖群,總圖距為3676.7 cM,平均圖距為111.4 cM 的連鎖圖譜,標記間距離為0.0～119.9 cM,平均間距9.1 cM。并將綠繭基因Gc定位在該圖譜的第22連鎖群的L-P4T6-107與 L-P6T4-84之間。在此基礎上分析了影響家蠶的全繭量、繭層量、繭層率和蛹體重4個重要經(jīng)濟性狀的QTL。通過復合區(qū)間作圖分析共檢測到11個QT Ls,其中控制全繭量的QT Ls有2個,分別定位在第6、19兩個連鎖群上;控制繭層量的QTLs有3個,分別定位在第3、14、19連鎖群上;控制繭層率的QTLs有3個,分別定位在第2、11、15連鎖群上;控制蛹體重的 QT Ls有3個,分別定位在第2、14、19連鎖群上。

Sima等[9]以F2代91個個體作為作圖群體,為家蠶繭質性狀的QTLs定位構建了一張較高密度的AFLP分子連鎖圖譜。692個有效位點中的550個構成了a和b亞群,其中a亞群21個連鎖群含233個標記,b亞群為28個連鎖群含317個標記。a、b亞群中各連鎖群上標記數(shù)目變化范圍在4～43個和3～35個,連鎖群總長度為1868.10 cM 和2677.50 cM,連鎖群的長度變化在22.3～424.3 cM和2.4～366.5 cM,標記的平均圖距變化在3.39～17.43 cM和0.80～26.96 cM,位點間的平均距離為8.81 cM和9.26 cM。平均圖距小于10 cM的連鎖群有14個和18個,大于10 cM小于20 cM的連鎖群有7個。連鎖群上位點平均數(shù)為11.1個和11.31個,連鎖群的平均長度為89.0 cM和95.6 cM。a,b亞群平均總長為2272.8 cM,平均圖距9.06 cM。符合QTLs定位的基本要求,為后一步的QTL定位和分子標記輔助選擇(marker-assisted selection,MAS)模型的建立奠定基礎。

1.3 AFLP用于社會昆蟲行為學研究

社會昆蟲的行為可塑性代表著一個復雜的生物學現(xiàn)象,引起分子生物學家的廣泛關注。蜜蜂成為分子生物學家在分子水平上研究昆蟲社會行為的模式種[10]。AFLP分子標記和微衛(wèi)星技術已被用于研究蜜蜂的保衛(wèi)行為和刺吮行為[11]。Ruppell等[12]研究了蜜蜂的授粉行為,驗證了前人研究的3個QTL標記和1個候選基因,同時采用2個相互回交的種群,每個種群利用400多個AFLP標記,從而標記出2個新的QT Ls。該研究結果表明了蜜蜂食料行為遺傳體系的復雜性,明確地支持了 pln1,pln 2,pln 3,Amf or這4個基因包括在蜜蜂食料行為規(guī)律中的假定,并且增加了某些新的值得以后進一步研究的影響蜜蜂食料喜好行為的因子。

2 AFLP技術在重要農業(yè)害蟲中的應用

2.1 重要害蟲基因標記以及抗藥性研究

害蟲抗藥性是日益緊迫的世界性問題,對一種或多種農藥產(chǎn)生抗藥性的昆蟲及螨類已經(jīng)超過440種。害蟲的抗藥性問題使農業(yè)生產(chǎn)蒙受了巨大的損失,因此,關于抗藥性的監(jiān)測、檢測、機理、評價、治理等越來越得到人們的普遍關注。進入20世紀90年代,隨著分子生物學技術的發(fā)展,在DNA分子水平上,快速簡便地檢測與抗藥性有關的基因突變成為可能,越來越多的抗性相關基因被發(fā)現(xiàn)、測序及克隆,使人們能夠在分子生物學和分子遺傳學的水平上進一步了解害蟲的抗藥性機制,這將對了解害蟲的抗性機制起到極大的推進作用。隨著研究的進一步深入,必將很大程度上增加人們對害蟲抗藥性的預測和預防能力。

AFLP技術是以PCR為基礎的多位點指紋技術[13],具有穩(wěn)定性好和多態(tài)率高等特點,已經(jīng)被成功地應用于多種害蟲基因的標記[14-15]。由于該技術能檢測出較為豐富的多態(tài)性信息,因此在昆蟲學研究中,通常應用于重要農業(yè)害蟲的遺傳作圖,以便定位或發(fā)現(xiàn)一些與抗藥性相關的基因[16-18]。小菜蛾作為一種世界性的蔬菜害蟲,對多種農藥都產(chǎn)生了不同程度的抗藥性,并且它是第1個被發(fā)現(xiàn)在田間對Bt毒素產(chǎn)生抗性的害蟲[19]。Heckle等[20]將AFLP分子標記方法用于小菜蛾對Bt毒素的抗性遺傳研究,以抗性親本和敏感親本回交的后代為作圖群體,構建了含有207個AFLP標記,31個連鎖群的小菜蛾抗性遺傳圖譜,利用鱗翅目遺傳連鎖的雙相特征,將抗性基因BtR-1定位在第7連鎖群上,Heckel所提供的這個有力的工具促進了對Bt抗性的了解、檢測以及治理研究,為研究人員開展鱗翅目害蟲抗性機理研究提供了參照。

自從1996年轉Bt基因棉花在我國推廣種植以來,棉花上的主要害蟲—棉鈴蟲的危害得到了有效的控制,雖然到目前為止還未發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲在田間對Bt毒素產(chǎn)生抗性,但是梁革梅等[21]報道,通過室內篩選可以獲得棉鈴蟲對Bt殺蟲劑、Bt毒蛋白和轉Bt基因棉的抗性種群。隨著轉基因植物在世界各地種植面積的日益增長,深入研究昆蟲對Bt的抗性機制,對于運用Bt制劑和Bt作物進行害蟲綜合治理以及延長轉Bt基因作物的使用壽命尤為重要。中國農業(yè)科學院植物保護研究所棉蟲組經(jīng)過多年的實驗室內篩選獲得了對Bt毒素和Bt殺蟲劑具有高抗性的棉鈴蟲種群,在此基礎上,2007年張少平等以2971倍抗性品系BtR棉鈴蟲(室內用BtCry1Ac原毒素篩選75代)及敏感品系96S棉鈴蟲為材料,運用cDNA-AFLP技術篩選其差異表達基因,共得到201個cDNA差異片段,37個與已知功能基因表達了同源性,包括氨肽酶N、鈣粘蛋白、堿性磷酸酶等,以及一些可能是棉鈴蟲抗Bt有關的新受體和蛋白酶[22]。2008年李艷梅等參照Heckel的方法,以高抗品系BtR及敏感品系96S回交的后代為作圖群體,進一步利用AFLP標記技術構建了一張含有49個AFLP標記,13個連鎖群的棉鈴蟲基因組抗性遺傳圖譜,將抗性基因BtR-gene定位在第4連鎖群上(文章正在整理之中),這將為制定棉鈴蟲對轉Bt基因棉的抗性治理方案,延長Bt棉的使用壽命、促進我國棉鈴蟲綜合治理和棉花生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

2.2 害蟲近緣種的鑒定以及遺傳分化

DNA分子標記適合鑒定形態(tài)上具有姊妹種特征昆蟲的遺傳差異[23-25]。近年來,AFLP技術已經(jīng)被用于近緣種的鑒定以及遺傳分化的研究[26-27]。

棉鈴蟲和煙青蟲在中國是同域分布、形態(tài)相似的兩個煙夜蛾屬近緣種害蟲。在卵、幼蟲、蛹期,甚至在成蟲期通過外部形態(tài)特征區(qū)分它們都很困難也不可靠。Ming等[28]利用AFLP分子標記來研究棉鈴蟲和煙青蟲這兩個近緣種實驗室種群的種間和種內遺傳距離和遺傳分化。結果表明,在利用9個引物對擴增的總共1963個AFLP分子標記中,777個(39.6%)是棉鈴蟲種特異性標記,602個(30.7%)是煙青蟲種特異性標記,584個(29.7%)是2個近緣種的共有標記;棉鈴蟲和煙青蟲平均每個引物對擴增的DNA多態(tài)性片段數(shù)差異不顯著(p＞0.05),但棉鈴蟲平均每個引物對擴增的種特異性標記數(shù)卻顯著多于煙青蟲(p＜0.05);棉鈴蟲和煙青蟲的種內遺傳距離分別為0.1230和0.1107,其種間遺傳距離為0.1783;聚類分析表明AFLP分子標記完全能區(qū)分棉鈴蟲和煙青蟲;另外,還通過計算多態(tài)位點百分率和預期平均雜合度估計了棉鈴蟲和煙青蟲實驗室群體的遺傳多樣性。本研究表明,AFLP是用來研究棉鈴蟲和煙青蟲兩個近緣種害蟲遺傳分化和遺傳關系的可靠方法和技術,它能用來進行種的鑒定、分化性狀基因的定位和克隆。

2.3 AFLP用于害蟲種群基因流動研究

利用分子標記技術研究害蟲種群之間是否發(fā)生基因流動對于農業(yè)害蟲防治工作具有實際應用價值。對害蟲種群遺傳學知道得越多,就越能更好地回答所使用的防治方法是對整個種群都有作用還是只對種群的一小部分起作用的問題。AFLP分子標記數(shù)據(jù)衡量的昆蟲種內或種間的基因流動和遺傳變異對明確闡述種群結構和動力學是至關重要的[29-33]。

草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)是西半球一些國家玉米上重要的經(jīng)濟害蟲,具有遷飛習性。Clark等[34]采用AFLP標記技術研究了較廣地理范圍內草地貪夜蛾的遺傳變異水平。試驗種群分別為玉米上20個種群,毛泡桐樹上1個種群,檸檬樹上1個種群,狗牙根草上1個種群,共23個種群。采集地為墨西哥、美洲大陸、波多黎各、巴西以及阿根廷5個地區(qū)。AFLP結果表明大部分遺傳變異發(fā)生在種群內部而非種群之間,這說明種群之間存在微效基因流動,進而闡明西半球國家的草地貪夜蛾是雜種繁殖種群。

3 AFLP技術在檢疫害蟲中的應用

由于AFLP技術信息含量大,多態(tài)性豐富,所以能夠為分類學家提供準確的、分子水平的分類依據(jù),解決了形態(tài)分類所不能解決的問題。利用AFLP等分子標記方法對檢疫性害蟲的DNA信息進行鑒定,具有準確、客觀的特點,鑒定周期短,對截獲的早期昆蟲如卵、幼蟲、蛹,不具有明顯形態(tài)特征時,無需將昆蟲培養(yǎng)至成蟲,即可直接提取其DNA用于鑒定。從而大大縮短鑒定周期,提高通關速度和檢驗檢疫的效率。

地中海實蠅(Ceratitis capitata)為重要檢疫性害蟲。Corsini等[35]采用AFLP技術分析了智利不同地區(qū)地中海實蠅的遺傳多樣性,并且克隆了3個片段,結果表明,其均可以作為鑒別地中海實蠅與Ceratitis屬其他種類以及果蠅屬(Drosophila)昆蟲的分子探針。Kakouli-Duarte等[26]應用AFLP技術成功地對實蠅科的地中海實蠅和納塔爾小條實蠅進行了分離和鑒定。

4 AFLP應用前景

AFLP分子標記在昆蟲學研究中最吸引人的應用可能是在昆蟲-植物交互作用方面。分子標記在靶標和定位重要抗蟲植物的抗蟲基因方面具有非常好的功效,同時在定位與作物相互作用的昆蟲無毒基因方面也非常有價值[36]。

標記數(shù)據(jù)產(chǎn)生的分子遺傳信息被用來描述害蟲侵害特定植物種類的表型能力特征。這方面應用的例子是水稻和小麥上的重要害蟲癭蚊,稻癭蚊(Orseolia oryzae Wood-Mason),是亞洲南部以及東南部水稻上的主要害蟲,由于種群出現(xiàn)不同的生物型,克服了寄主植物的抗性基因,每年造成約5億美元的損失。類似地,小麥癭蚊(Mayetiola destructor Say)在小麥上也造成嚴重的經(jīng)濟損失。在北美洲,盡管小麥育種領域已經(jīng)開發(fā)了32個抗性基因以防治小麥癭蚊,但是與小麥抗性基因相對抗的不同的有毒癭蚊種已經(jīng)進化,導致小麥作物每年平均損失約1億美元。當前還沒有合適的化學以及物理防治法來防治這類害蟲,在這種情況下,研究人員采取的策略是使用分子遺傳工具,弄清楚昆蟲與寄主植物之間的相互作用。這有助于鑒定互作中的特定基因,開發(fā)出抗性基因,應用到抗蟲植物開發(fā)中,以發(fā)展抗蟲植物治理策略。

Behura等[37]采用AFLP分子標記,利用BSA(bulked segregant analysis)方法探索出一個AFLP標記,這個標記與和水稻抗性基因Gm2相互作用的稻癭蚊 vGm2無毒基因相連鎖。類似地,利用RAPD和AFLP技術結合BSA分析方法,還鑒定出幾個重要的小麥癭蚊無毒基因,這些基因與美國種植的小麥品種的抗性緊密相關[15,38-40]。這些研究工作有力地說明了AFLP分子標記方法有助于更好地了解害蟲與寄主植物遺傳交互作用機制理論以及進化基礎。

5 展望

AFLP技術自20世紀90年代發(fā)明以來引起了研究人員極大的興趣,它在種群遺傳學,生態(tài)學以及進化學研究中成為一個非常重要的分子標記系統(tǒng)。近十年來,AFLP分子標記技術在有益昆蟲、重要農業(yè)害蟲以及檢疫害蟲等昆蟲學研究領域已得到應用。然而,這項技術在昆蟲學研究中的應用還處于初步階段。由于AFLP標記通常是作為顯性標記,因此,它很難區(qū)分雜合子和純合子,所以除了盡快建立起該技術在昆蟲學研究中的應用平臺,對該技術進行不斷地完善,減少人為誤差之外,更應該深入學習AFLP數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法,使其能夠更加真實地反映基因組遺傳信息,可能的話,可以結合多種分子標記方法,以期達到在分子水平上更好地了解昆蟲的遺傳、進化等方面信息的目的。

[1] Mueller U G,Wolfenbarger L L R.AFLP genotyping and fingerprinting[J].T rends in Ecology&Evolution,1999,14(10):389-394.

[2] Meudt H M,Clarke A C.Almost forgotten or latest practice?AFLP applications,analyses and advances[J].T rends in Plant Science,2007,12(3):106-117.

[3] 魯成,萬春玲.中國野桑蠶和家蠶的AFLP分析[J].蠶業(yè)科學,2001,27(4):243-252.

[4] 張金衛(wèi),鐘伯雄,丁農,等.應用AFLP分子標記對6個家蠶品種的鑒定[J].蠶業(yè)科學,2004,30(2):137-141.

[5] Tan Y D,Wan C L,Zhu Y F,et al.An amplified fragment length polymorphism map of the silkworm[J].Genetics,2001,157:1277-1284.

[6] 萬春玲,譚遠德,朱玉芳,等.利用AFLP標記構建家蠶分子連鎖圖譜[J].中國農業(yè)科學,2001,34(3):338-341.

[7] 朱玉芳,譚遠德,萬春玲,等.家蠶AFLP連鎖框架圖譜的構建[J].昆蟲學報,2001,44(4):483-493.

[8] 魯成,李斌,趙愛春,等.家蠶重要經(jīng)濟性狀的 QT L定位研究[J].中國科學G輯:生命科學,2004,34(3):236-242.

[9] Sima Y H,Li B,Chen D X,et al.Construction and analysis of an AFLP molecular linkage map of the silkworm(Bomby x mori)[J].Chinese Journal of Agricultural Biotechnology,2006,3(1):25-31.

[10]Robinson G E,Grozinger C M,Whitfield C W.Sociogenomics:social life in molecular terms[J].Nature Reviews Genetics,2005,6:257-270.

[11]Arechavaleta Velasco M E,Hunt G J,Emore C.Quantitative trait loci that influence the expression of guarding and stinging behaviors of individual honeybees[J].Behavioral Genetics,2003,33:357-364.

[12] Ruppell O,Pankiw T,Page R E.Pleiotropy,epistasis and new QT L:the genetic architecture of honeybee foraging behavior[J].Journal of Heredity,2004,95:481-491.

[13]Vos P,Hogers R,Bleeker M,et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Res,1995,23:4407-4414.

[14]Zhong D,Pai A,Yan G.AFLP-based genetic linkage map for the red flour beetle(Tribolium castaneum)[J].Journal of Heredity,2004,95:53-61.

[15]Behura S K,Valicente F H,Rider S D Jr,et al.A physically anchored genetic map and linkage to avirulence reveals recombination suppression over the proximal region of Hessian fly chromosome A2[J].Genetics,2004,167:343-355.

[16]羅倩,馮夏,呂利華,等.小菜蛾對阿維菌素抗性基因的 AFLP連鎖圖譜的構建[J].昆蟲學報,2007,50(5):474-480.

[17]Hawthorne D J.AFLP-based genetic linkage map of the Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata:sex chromosomes and a py rethroid-resistance candidate gene[J].Genetics,2001,158(2):695-700.

[18]Hawthorne D J.Quantitative trait locus mapping of pyrethriod resistance in Colorado potato beetle,Leptinotarsa decemlineata(Say)(Coleoptera:Chry somelidae)[J].J Econ Entomol,2003,96(4):1021-1030.

[19]Tabashnik B E.Evolution of resistance to Bacillusthuringiensis[J].Annual Review of Entomology,1994,39:47-79.

[20]Heckel D G,Gahan L J,Liu Y B,et al.Genetic mapping of resistance to Bacillus thuringiensis toxins in diamondback moth using biphasic linkage analysis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:8373-8377.

[21]梁革梅,譚維嘉,郭予元.棉鈴蟲對Bt的抗性篩選及交互抗性研究[J].中國農業(yè)科學,2000,33(4):46-53.

[22]張少平.棉鈴蟲Bt抗性基因表達差異及抗性受體APN1功能驗證[D].北京:中國農業(yè)科學院,2007.

[23] Heckel D G.Comparative genetic linkage mapping in insects[J].Annual Review of Entomology,1993,38:381-408.

[24]Heckel D G,Gahan L J,Daly J C,et al.A genomic approach to understanding Heliothis and Helicoverpa resistance to chemical and biological insecticides[J].Philosophical Transactions of the Royal Society of London-Series B,1998,353:1713-1722.

[25]Heckel D G.Genomics in pure and applied entomology[J].Annual Review of Entomology,2003,48:235-260.

[26]Kakouli-Duarte T,Casey D G,Burnell A M.Development of a diagnostic DNA probe for the fruit flies Ceratitis capitata and Ceratitisrosa(Diptera:Tephritidae)using amplified fragmentlength polymo rphism[J].Journal of Economic Entomology,2001,94(4):989-997.

[27]Salvato P,Battisti A,Concato S,et al.Genetic differentiation in the winter pine processionary moth(Thaumetopoea pityocampawilkinsoni complex),inferred by AFLP and mitochondrial DNA markers[J].Molecular Ecology,2002,11:2435-2444.

[28]Ming Q L,Wang C Z.Genetic differentiation of Helicoverpa armigera(Hübner)and H.assulta(Guenée)(Lepidoptera:Noctuidae)based on AFLP markers[J].Journal of Insect Science,2006,13:437-444.

[29]Cervera M T,Cabezas J A,Simón B,et al.Genetic relationships among biotypes of Bemisia tabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)based on AFLP analysis[J].Bulletin of Entomological Research,2000,90(5):391-396.

[30]Wong A,Forbes M R,Smith M L.Characterization of AFLP markers in damselflies:prevalence of codominant markers and implications for population genetic applications[J].Genome,2000,44:677-684.

[31] Takami Y,Koshio C,Ishii M,et al.Genetic diversity and structure of urban populations of Pieris butterflies assessed using amplified fragment length polymorphism[J].Molecular Ecology,2004,13:245-258.

[32]Busato G R,Grützmacher A D,de Oliveira A C,et al.Analysis of the molecular structure and diversity of Spodoptera f rugiperda(J.E.Smith)(Lepidoptera:Noctuidae)populations associated to the corn and rice crops in Rio Grande do Sul State,Brazil[J].Neotropical Entomology,2004,33:709-716.

[33]Mendelson T C,Shaw K L.Use of AFLP markers in surveys of arthropod diversity[J].Methods in Enzymology,2005,395:161-177.

[34] Clark P L,M olina-Ochoa J,Martinelli S,et al.Population variation of the fall army wo rm,S podoptera f rugiperda,in the western hemisphere[J].Journal of Insect Science,2007,7(5):1536-2442.

[35] Corsini G,Manubens A,Lladser M,et al.AFLP analysis of the fruit fly Ceratitis capitata[J].Ag ricultural Bio-technology,1999,21(3):72-73.

[36] Harris M O,Stuart J J,M ohan M,et al.G rasses and gall midges:plant defense and insect adaptation[J].Annual Review of Entomology,2003,48:549-577.

[37]Behura S K,Nair S,Sahu S C,et al.An AFLP marker that differentiates biotypes of the Asian rice gall midge(Orseolia oryzae,Wood-Mason)is sex-linked and also linked to avirulence[J].M olecularand General Genetics,2000,263:328-334.

[38]Stuart J J,Schulte S J,Hall P S,et al.Genetic mapping of Hessian fly avirulence gene v H6 using bulked segregant analysis[J].Genome,1998,41:702-708.

[39] Schulte S J,Rider S D J,Hatchett J H,et al.Molecular genetic mapping of three X-linked avirulence genes,vH6,v H9 and v H13,in the Hessian fly[J].Genome,1999,42:821-828.

[40] Rider S D Jr,Sun W,Ratcliffe R H,et al.Chromosome landing near avirulence gene v H13 in the Hessian fly[J].Genome,2002,45:812-822.