中藥指紋圖譜的研究進(jìn)展

唐興剛,李 雪,李盛強(qiáng),郭世寧

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州510642)

中藥生產(chǎn)的原材料,因土壤、氣候等環(huán)境因素及采收加工的不同,實(shí)際使用時(shí)不能保證藥材質(zhì)量的穩(wěn)定,經(jīng)加工提取得到的中間體,每個(gè)批次在成分含量、成分組成及各成分比例方面都不能保持一致。因此對(duì)中藥原材料、中間體及成方制劑的質(zhì)量控制在中藥的應(yīng)用上占據(jù)著很主要的位置。中藥指紋圖譜借用了法醫(yī)學(xué)上指紋鑒定的概念,對(duì)中藥的化學(xué)信息以現(xiàn)代分析技術(shù)給予表征并加以描述,全面反映中藥內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量,對(duì)判斷中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣,控制中藥原材料、中間體及成品的質(zhì)量,減少批間差異,并最終控制成品的質(zhì)量起到了極其重要的作用。

1 色譜指紋圖譜

1.1 薄層色譜(T LC)指紋圖譜 薄層色譜法(TLC)一開始以簡(jiǎn)單快速的鑒別為起點(diǎn),20世紀(jì)60年代以后很快取代了紙色譜技術(shù),至今在中藥鑒別中其應(yīng)用頻率仍然最高,近年來發(fā)展的T LC自動(dòng)掃描儀,用固定波長對(duì)薄層的各個(gè)斑點(diǎn)作掃描的圖譜比目測(cè)的層析圖譜更為客觀準(zhǔn)確,也具有更好的指紋鑒別意義。李彩君等[1]以高良姜素為對(duì)照品,建立了高良姜藥材的薄層色譜定性鑒別,發(fā)現(xiàn)高良姜素、山柰素等8個(gè)特征熒光斑點(diǎn)構(gòu)成了高良姜乙酸乙酯提取部位的薄層色譜指紋圖譜。劉和平等[2]以柴胡正品北柴胡為基礎(chǔ)建立柴胡皂苷高效薄層熒光色譜指紋圖譜,并對(duì)同屬品種南柴胡、錐葉柴胡、多枝柴胡、三島柴胡、西藏柴胡等的指紋圖譜進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)北柴胡指紋圖譜由19個(gè)特征熒光條斑組成。熒光色譜圖像與輪廓掃描圖譜結(jié)合分析比較,可分為北柴胡指紋圖譜模式、錐葉柴胡模式及大葉柴胡模式。北柴胡、南柴胡、多枝柴胡、三島柴胡雖然總皂苷含量相互有別,但指紋圖譜彼此相似。

1.2 毛細(xì)管電泳(CE)和高效毛細(xì)管電泳(HPCE)指紋圖 在指紋圖譜研究中毛細(xì)管電泳(CE)是一種較新的方法,它是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,以毛細(xì)管為分離管道,依據(jù)樣品中各組分之間電泳速度或分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離的液相分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳用于檢測(cè)中藥指紋圖譜,其優(yōu)點(diǎn)在于:(1)柱效高。(2)分析速度快,進(jìn)樣體積小(納升級(jí))。(3)適于直接分析水溶液,可直接分析“臟”樣品。(4)大小分子可同時(shí)分析,毛細(xì)管極易清洗。(5)開發(fā)新方法較快,儀器維護(hù)簡(jiǎn)單等。胡坤等[3]以槲皮素為內(nèi)標(biāo),采用毛細(xì)管電泳法,對(duì)不同批次、不同品種和不同儲(chǔ)存時(shí)間羅漢果的毛細(xì)管電泳指紋圖譜進(jìn)行了比較,建立了羅漢果的毛細(xì)管電泳指紋圖譜。

HPCE技術(shù)在中藥材鑒別中的應(yīng)用是近幾年發(fā)展起來的,它具有高效、快速、分辨力強(qiáng)、重現(xiàn)性好的特點(diǎn),在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂方面的優(yōu)勢(shì)越來越明顯。王鋼力等[4]對(duì)11種卷柏屬藥用植物進(jìn)行了HPCE指紋圖譜研究,建立了18個(gè)樣品的毛細(xì)管電泳的指紋圖譜。結(jié)果顯示,各主要色譜峰均顯示黃酮特征,說明卷柏屬植物在黃酮類成分上既有共性,也存在差別,這種差別對(duì)于藥材品種的鑒別有著一定的意義。1.3 高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜 高效液相色譜法(HPLC)作為最常用的指紋圖譜研究方法,具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。中藥樣品中含有的成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測(cè),方法成熟,是目前指紋圖譜研究應(yīng)用最多的一項(xiàng)技術(shù)。付紹平等[5]利用反相高效液相色譜法分析了10個(gè)不同產(chǎn)地的北五味子樣品,建立了由26個(gè)指紋峰和19個(gè)共有峰組成的北五味子指紋圖譜,確定了5個(gè)主要的指紋峰,為科學(xué)評(píng)價(jià)及有效控制北五味子質(zhì)量提供了新方法。所建立的指紋圖譜可以用來區(qū)別不同產(chǎn)地北五味子藥材的優(yōu)劣,為進(jìn)一步控制北五味子的質(zhì)量提供依據(jù)。黃月純等[6]以廣東新會(huì)產(chǎn)廣陳皮(茶枝柑)指紋圖譜為基礎(chǔ)建立共有模式,可鑒定市場(chǎng)陳皮是否為廣陳皮,為廣陳皮質(zhì)量控制與鑒定提供了參考。費(fèi)陳忠等[7]采用高效液相色譜法(HPLC)以內(nèi)標(biāo)物香蘭素、總峰面積以及峰面積最大的9個(gè)共有峰為評(píng)價(jià)指標(biāo),建立了新型抗球蟲中藥復(fù)方TF-103的指紋圖譜,并采用“中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)”軟件進(jìn)行了相似度計(jì)算。結(jié)果表明,該法操作簡(jiǎn)單,精密度和穩(wěn)定性良好,有助于該中藥復(fù)方的質(zhì)量控制和譜效關(guān)系的研究。

1.4 氣相色譜指紋圖譜(GC)氣相色譜法(GC)主要用于分析氣體、揮發(fā)性和半揮發(fā)性液體以及能夠產(chǎn)生足夠蒸汽壓的固體,或者沸點(diǎn)在500℃以下,相對(duì)分子質(zhì)量400以下的物質(zhì)。在中藥質(zhì)量控制中主要用于揮發(fā)油、極性較小的成分或衍生化后的可揮發(fā)性成分(如脂肪酸的酯)。GC的特點(diǎn)是靈敏度高、分離度好、分析速度快,定量分析的精密度優(yōu)于1%。梁倩等[8]采用水蒸氣蒸餾法提取了7個(gè)產(chǎn)地的丹參花揮發(fā)油,對(duì)揮發(fā)油的主要成分進(jìn)行了GC分析。GC法分析對(duì)比7個(gè)產(chǎn)地丹參花揮發(fā)油的相似性,結(jié)果7批丹參花的揮發(fā)油相似度較高,可作為控制丹參花成分的方法之一。

1.5 高速逆流色譜技術(shù)(HSCCC)高速逆流色譜技術(shù)(HSCCC)是當(dāng)前國際上較新型的液-液分配技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用動(dòng)態(tài)液-液分配原理,利用相對(duì)移動(dòng)的互不混溶的兩相溶劑,在處于動(dòng)態(tài)平衡的兩相中將具有不同分配比的樣品組分離。它不使用固相載體作固定相,克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染、峰型拖尾等缺點(diǎn)。近年來,國內(nèi)已報(bào)道將高速逆流色譜技術(shù)應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離、分析及建立指紋圖譜。如將高速逆流色譜和質(zhì)譜(HSCCC-Ms)聯(lián)用,分析鑒定生物堿、木脂素及三菇類化合物等,均取得了滿意的結(jié)果。顧銘等人[9]利用HSCCC分離純化雪蓮、丹參并成功制訂了其中藥指紋圖譜,也很好的說明了HSCCC在指紋圖譜方面的應(yīng)用。

1.6 色譜聯(lián)用技術(shù)

1.6.1 高效液相/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC/MS)指紋圖譜液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)被測(cè)化合物的確認(rèn)有很高的可信度,具有靈敏度高、選擇性好、精密度高等優(yōu)點(diǎn),而且HPLC/MS有易于操作和自動(dòng)化的特點(diǎn)。目前此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成為制藥業(yè)、藥物分析與研制領(lǐng)域十分重要的分析方法。張尊建等[10]采用HPLC-UV-MS法對(duì)丹參藥材、丹參注射液中間體及丹參注射液進(jìn)行指紋圖譜的研究,得到分離度較好的丹參藥材、中間體及注射液的 HPLC-UV及HPLC-MS指紋圖譜,為丹參藥材、中間體及注射液的質(zhì)量控制提供全面、可靠的依據(jù)。劉訓(xùn)紅等[11]用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地太子參進(jìn)行分析,測(cè)定其總離子流指紋圖譜,確定共有峰,并對(duì)部分色譜峰進(jìn)行了初步歸屬。發(fā)現(xiàn)少數(shù)產(chǎn)地太子參HPLC-MS指紋圖譜差異顯著,可作為太子參內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)。

1.6.2 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)指紋圖譜氣相色譜作為進(jìn)樣系統(tǒng),將待測(cè)樣品進(jìn)行分離后直接導(dǎo)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè),既滿足了質(zhì)譜分析對(duì)樣品單一性的要求,還省去了樣品制備、轉(zhuǎn)移的繁瑣過程,不僅避免了樣品受污染,對(duì)于質(zhì)譜進(jìn)樣量還能有效控制。質(zhì)譜作為檢測(cè)器,檢測(cè)的是離子質(zhì)量,獲得化合物的質(zhì)樸圖,解決了氣相色譜定性的局限性。王儒靜等[12]對(duì)靈芝建立GC-MS指紋圖譜,并對(duì)靈芝硅烷化衍生物進(jìn)行質(zhì)譜定性分析,運(yùn)用模式識(shí)別對(duì)不同產(chǎn)地的不同品質(zhì)的靈芝進(jìn)行鑒別分類,為進(jìn)一步開發(fā)、利用靈芝資源、探索靈芝品質(zhì)鑒別提供了線索。

2 光譜指紋圖譜

2.1 紅外光譜(IR)指紋圖譜 近年來,用紅外指紋圖譜法鑒別中藥的研究較多,在中藥標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)建中也發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用,尤其是這一技術(shù)作為中藥鑒別的輔助手段,發(fā)展較快。紅外光譜的優(yōu)點(diǎn)是"多快好省"、是一種綠色分析技術(shù);缺點(diǎn)是這種方法不是"原始方法",很難作為標(biāo)準(zhǔn)方法,且需要大量代表性樣品進(jìn)行化學(xué)分析建模。田進(jìn)國等[13]測(cè)試了大量中藥的紅外光譜,初步建立起對(duì)植物藥、礦物藥進(jìn)行鑒別的紅外光譜分析法。徐永群等[14]首次運(yùn)用紅外指紋圖譜對(duì)18個(gè)產(chǎn)地的中藥材赤芍進(jìn)行了藥用部分全組份的快速分析,為赤芍道地商品的鑒別及質(zhì)量控制提供了可靠的依據(jù)。

2.2 紫外光譜(UV)指紋圖譜 紫外光譜能夠給出藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)信息,但所給出的信息是所有化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的加和,不具備指紋特征,但可作為中藥指紋圖譜研究的輔助方法。鄒華彬等[15]采用共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法對(duì)不同產(chǎn)地、不同采集年份的白芍樣品及相近植物赤芍、丹皮樣品進(jìn)行了定量評(píng)價(jià)。該法可以對(duì)至少2個(gè)樣品進(jìn)行定量評(píng)價(jià),克服了多種中藥鑒別方法只能進(jìn)行真?zhèn)舞b別、產(chǎn)地鑒別的局限性,為中藥質(zhì)量的準(zhǔn)確定量評(píng)價(jià)提供了一種新方法。刁云鵬等[16]通過研究得出了紫穗槐果實(shí)和葉的紫外光譜指紋圖譜能夠準(zhǔn)確鑒別紫穗槐果實(shí)和葉及其混淆品的結(jié)論。

3 其他研究方法

3.1 核磁共振氫譜(HNMR)指紋圖譜 核磁共振氫譜(HNMR)是鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的重要方法之一,可以獲得化合物中包括各類質(zhì)子的化學(xué)位移、數(shù)量、偶合關(guān)系等多個(gè)結(jié)構(gòu)信息。植物類中藥的特征性化學(xué)成分的含量是相對(duì)固定的,在規(guī)范的提取分離條件下,植物類中藥的HNMR圖譜與植物品種則存在著嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系,沒有混淆的可能性,圖譜中的信號(hào)強(qiáng)弱反映了混合物中各組分的相對(duì)含量,在對(duì)特征性提取物進(jìn)一步分離得到單體后,通過結(jié)構(gòu)鑒定和HNMR研究,可以對(duì)指紋圖譜中的各特征譜線進(jìn)行歸屬。HNMR指紋圖譜以其良好的單一性、全面性、定量性、易辨性、明顯的特征性和良好的重現(xiàn)性,預(yù)示了其在中藥鑒定中的應(yīng)用前景。陳波等[17]用1HNMR分析測(cè)定35種從福建、云南、廣州、江西等地采集及購買的不同種類的茶葉。檢測(cè)出包括多種氨基酸在內(nèi)的20種物質(zhì)。所得譜圖經(jīng)主要成分分析,實(shí)現(xiàn)了不同種類的茶葉以及鐵觀音產(chǎn)地的區(qū)分,并且發(fā)現(xiàn)了引起區(qū)分的化學(xué)成分。3.2 X-射線衍射(XRD)指紋圖譜 中藥材的XRD圖譜是藥材中所含各種成分的衍射譜的疊加,從整體上反映一般成分和主要成分的分布概況,從而可能提供較全面的有鑒別意義的數(shù)據(jù)。20世紀(jì)80年代末,X線衍射法在我國開始用于中藥鑒定。目前,我國要求一類和二類中藥新藥要附有粉末X線衍射譜。吳云山等[18]應(yīng)用粉末X線衍射Fourier圖譜鑒定法對(duì)5個(gè)白芍中藥材樣品進(jìn)行了分析,獲得了白芍的標(biāo)準(zhǔn)X線衍射Fourier圖譜及特征標(biāo)記峰值,顯示了X線衍射Fourier圖譜鑒定分析方法在中藥指紋圖譜建立的應(yīng)用中同樣具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 DNA指紋圖譜 DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)具有快速、微量、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),且不受生長發(fā)育階段、供應(yīng)部位、環(huán)境條件的影響,已在中藥鑒定學(xué)研究中展示了良好的應(yīng)用前景,并保持了強(qiáng)勁的發(fā)展勢(shì)頭。羅聯(lián)忠[19]等收集了23株靈芝栽培菌種為材料,從DNA水平上探討不同產(chǎn)地的靈芝菌種的差異。最后得到了兩條進(jìn)行擴(kuò)增分析可以有效鑒別大部分栽培菌種,作為分子標(biāo)記的隨機(jī)引物。

4 展望

中藥建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜必須立足于中藥的特色,即中藥的整體作用特點(diǎn)。這就決定了中藥指紋圖譜研究的復(fù)雜性。目前國際上已普遍認(rèn)可中藥指紋圖譜作為中藥質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。美國FDA、WHO都已規(guī)定如果草藥的活性成分不明,可以提供色譜指紋圖譜以證明產(chǎn)品質(zhì)量。在歐共體藥品申請(qǐng)注冊(cè)表格中植物藥制品要求對(duì)原料、中間體及成品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化控制,即要建立指紋圖譜。

目前中藥指紋圖譜的研究多集中于單味藥化學(xué)成分的研究,以后對(duì)于中藥中間體、成品藥的研究應(yīng)該加強(qiáng)。尤其是注射用藥物,因其直接進(jìn)入血液,其質(zhì)量控制更為重要,應(yīng)作為主要指紋圖譜研究方向。

[1]李彩君,林巧玲,謝培山,等.高良姜中黃酮類成分薄層色譜指紋圖譜鑒別[J].中藥新藥與臨床藥理,2001,12(3):183-187.

[2]劉和平,謝培山,田潤濤.柴胡屬藥材皂苷高效薄層色譜指紋圖譜的研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2008,19(1):38-42.

[3]胡坤,趙書林,李舒婷,等.羅漢果的毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,26(1):84-87.

[4]王鋼力,戴忠.11種卷柏屬藥用植物HPCE指紋圖譜的研究[J].中成藥,2002,24(7):489-491.

[5]付紹平,楊博,陳彤,等.北五味子的液相色譜指紋圖譜的建立[J].色譜,2008,1:64-67.

[6]黃月純,魏剛.廣陳皮HPLC指紋圖譜的建立及在藥材鑒定中的應(yīng)用研究[J].中草藥,2008,39(2):275.

[7]費(fèi)陳忠,薛飛群,張麗芳.抗球蟲中藥復(fù)方T F-103指紋圖譜的建立[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2006,2:8-12.

[8]梁倩,王俊儒,梁宗鎖.丹參花揮發(fā)油GC指紋圖譜的建立[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2008,23(4):152-155.

[9]顧銘,蘇志國.高速逆流色譜用于天然產(chǎn)物分離和指紋圖譜構(gòu)建[J].生物加工過程,2003,1(2):59.

[10]張尊建,李茜,王偉,等.丹參及丹參注射液指紋圖譜的HPLC-MS研究[J].中草藥,2002,33(12):1074-1076.

[11]劉訓(xùn)紅,居文政,蔡寶昌,等.太子參HPLC-MS指紋圖譜的初步研究[J].中成藥,2008,30(2):160-163.

[12]王儒靜,王志軍,朱仲良.靈芝GC-MS指紋圖譜的建立及其聚類分析的研究[C].第九屆全國計(jì)算機(jī)化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集,2007:152-154.

[13]田進(jìn)國,許欣榮.紅外光譜法鑒別中藥材的初步探討[J].中草藥,1989,20(5):29.

[14]徐永群,黃昊,周群,等.紅外指紋圖譜和聚類分析法在赤芍產(chǎn)域分類鑒別中的應(yīng)用[J].分析化學(xué),2003,31(1):5-9.

[15]鄒華彬,袁浩,王愛武,等.白芍紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2007,27(9):1815-1819.

[16]刁云鵬,舒曉宏,甄宇紅,等.紫穗槐果實(shí)和葉子的紫外光譜指紋圖譜研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,7(7):1091-1092.

[17]陳波,張巍,康海寧,等.茶葉的1HNM R指紋圖譜研究[J].波譜學(xué)雜志,2006,23(2):169-180.

[18]吳云山 ,王樹春.中藥材白芍的X射線衍射 Fourier譜鑒定[J].中草藥,2002,33(10):939-941.

[19]羅聯(lián)忠,林樹錢,謝寶貴,等.23株靈芝栽培菌種的DNA指紋鑒別[J].海峽藥學(xué),2005,17(5):82-85.