嘌呤核苷酸對(duì)海洛因處理過(guò)大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

李鴻梅 李 昆 何海濤 劉劍凱 洪 敏

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,吉林 長(zhǎng)春 130021)

由于大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜上存在阿片受體,目前已被廣泛用作研究各種阿片類(lèi)藥物作用機(jī)制的模型系統(tǒng)〔1,2〕。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),海洛因不但能夠抑制大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,而且還能使細(xì)胞內(nèi)嘌呤核苷酸分解代謝增強(qiáng)〔3,4〕。已經(jīng)明確的是海洛因?qū)?C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用,但是嘌呤核苷酸對(duì)經(jīng)過(guò)海洛因處理過(guò)的大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖是否有影響并未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在前期研究發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上,以大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞,研究嘌呤核苷酸對(duì)海洛因處理的大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響,探索嘌呤核苷酸治療阿片類(lèi)成癮的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 C6細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞研究所。低溫臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自上海化工機(jī)械廠。倒置顯微鏡購(gòu)自上海蔡康光學(xué)儀器有限公司。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本 SANYO公司。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自

Gibco公司,新生牛血清購(gòu)自天津血液研究所。噻唑藍(lán)(MTT)、一磷酸腺苷 AMP和一磷酸鳥(niǎo)苷 GMP購(gòu)自 Sigma公司。海洛因 (純度為 99%)由吉林省公安廳提供,臨用時(shí)用滅菌三蒸水溶解。

1.2 大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng) C6為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。培養(yǎng)基為 DMEM,每 100 ml培養(yǎng)基含青霉素 1萬(wàn) U,鏈霉素10 mg,新生牛血清 15 ml,用滅菌的 5.6%NaHCO3溶液調(diào)p H7.2,置于 CO2孵箱,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)時(shí),用 0.25%胰酶消化傳代,每周 2～3次。

1.3 MTT比色法檢測(cè)海洛因?qū)?C6細(xì)胞增殖的影響及最佳藥物劑量篩選 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用 0.25%胰酶消化,用吸管將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù);將細(xì)胞以 1×104個(gè)/cm2的濃度接種到 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每組均設(shè) 3個(gè)平行孔。以生理鹽水作對(duì)照,加入海洛因使其終濃度分別為 10、40、80和 120 mg/L,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后加入 20μl濃度為 5 g/L的 MTT,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h;棄培養(yǎng)基,每孔加入 DMSO 200μl,室溫振蕩 10 min后,用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 490nm處測(cè)定吸光度值,計(jì)算細(xì)胞的生存率 (%)=(各實(shí)驗(yàn)組 OD值/對(duì)照組 OD值)×100%,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.4 MTT比色法測(cè)定嘌呤核苷酸對(duì)海洛因處理細(xì)胞增殖的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化,用吸管將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù);將細(xì)胞以 1×104個(gè)/cm2的濃度接種到 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每組均設(shè) 3個(gè)平行孔。對(duì)照組為海洛因處理組,加入海洛因使其終濃度為120mg/L;嘌呤核苷酸處理組在加入 120 mg/L海洛因的同時(shí),加入等摩爾混合的嘌呤核苷酸,使嘌呤核苷酸終濃度分別為10、40、80和 120 mg/L,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后加入 20μl濃度為 5g/L的 MTT,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h;每孔加入 DMSO 200μl,室溫振蕩 10min后,用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 490nm處測(cè)定吸光度值,計(jì)算細(xì)胞生存率(%)=(各實(shí)驗(yàn)組 OD值/對(duì)照組 OD值)×100%,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及成組設(shè)計(jì)資料 t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 海洛因?qū)6細(xì)胞增殖的影響及最佳藥物濃度 MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低劑量 (10 mg/L)的海洛因?qū)Υ笫?C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用并不明顯,490 nm處吸光度值為 1.393±0.084,其抑制率僅為 7%,與對(duì)照組(1.497±0.091)比較差異不顯著 (P＞0.05)。當(dāng)海洛因的濃度達(dá)到 40 mg/L時(shí),490nm處吸光度值為 0.967±0.097,對(duì) C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制率為 35%;海洛因濃度為 80mg/L時(shí),490 nm處吸光度值為0.777±0.067,抑制率為 48%;海洛因濃度為 120 mg/L時(shí),490nm處吸光度值為 0.713±0.068,抑制率為 52%;與對(duì)照組比較,差異均有顯著性 (P＜0.05)。因此本文選擇 120mg/L的海洛因作為最佳藥物劑量。

2.2 嘌呤核苷酸對(duì)海洛因處理的 C6細(xì)胞增殖的影響 海洛因?qū)φ战M 490 nm處OD值為 0.847±0.081,與海洛因組比較,嘌呤核苷酸的濃度為 10和 40 mg/L時(shí),490 nm處OD值分別為(0.573±0.077,0.803±0.098),對(duì)大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用并不明顯 (P＞0.05)。嘌呤核苷酸的濃度達(dá)到80 mg/L時(shí),490 nm處 OD值為 1.037±0.059,細(xì)胞增殖率為22%;嘌呤核苷酸的濃度為 120 mg/L時(shí),490 nm處 OD值為1.097±0.114,細(xì)胞增殖率為 30%;與海洛因組比較,差異均有顯著性 (P＜0.05)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn),海洛因能夠抑制體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞增殖,其機(jī)制是海洛因誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡〔5〕。阿片類(lèi)藥物嗎啡對(duì)去甲基丙咪嗪 (抗抑郁藥)和內(nèi)皮素等藥物處理后的大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用〔6〕。除此之外,本研究還發(fā)現(xiàn),嗎啡對(duì)沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何藥物處理的大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖也有抑制作用〔7〕。海洛因抑制大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,其機(jī)制是海洛因使大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)減少〔3,4〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò) MTT比色法也證實(shí)了海洛因濃度達(dá)到 40mg/L時(shí),以劑量依賴(lài)的方式抑制大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)通過(guò) MTT比色法證明,嘌呤核苷酸的濃度達(dá)到 80 mg/L時(shí),以劑量依賴(lài)的方式促進(jìn)大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果表明,嘌呤核苷酸能夠?qū)购Ｂ逡驅(qū)Υ笫驝6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用,其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

1 Bohn LM,Belcheva MM,Coscia CJ.Evidence for kappa-and mu-opioid receptor expression in C6 glioma cells〔J〕.J Neurochem,1998;70(5):1819-25.

2 Hauser KF,Houdi AA,Trubek CS,et al.Opioid intrinsically inhibit the genesis of mousecerebellar granule neuron precursors in vitro:differential impact of mu and delta receptor activation on proliferation and neurite elongation〔J〕.Eur JNerosci,2000;12(4):1281-93.

3 遲秀梅,張紀(jì)周,闞慕杰,等.海洛因?qū)?C6細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原基因表達(dá)的影響〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008;34(6):949-51.

4 遲秀梅,闞慕杰,李 奇,等.海洛因?qū)?C6細(xì)胞嘌呤核苷酸分解代謝基因表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2008;12(5):589-91.

5 劉小山,臧林泉,蒿自睿,等 .海洛因誘導(dǎo)大腦神經(jīng)元凋亡的研究〔J〕.法醫(yī)學(xué)雜志,2007;23(1):14-7.

6 Bohn LM,Belcheva MM,Coscia CJ.Mu-opioid agonist inhibition of kappa-opioid receptor-stimulated extracellular signal-regulated kinase phosphorylation is dynamic-dependent in C6 glioma cells〔J〕.J Neurochem,2000;74(2):574-81.

7 姚路禹,洪新雨,洪 敏,等.嗎啡對(duì)培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)細(xì)胞瘤 C6細(xì)胞增殖的抑制作用〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2002;28(6):594-6.