細(xì)胞因子在疫苗中的免疫增強(qiáng)作用

羅滿林,唐明森,魯俊鵬

(1.廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司,廣東新興 527400；2.廣東溫氏食品集團(tuán)研究院,廣東新興 527400；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510642)

細(xì)胞因子(cytokine)是一類由活化的免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等)和相關(guān)細(xì)胞(纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)產(chǎn)生的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的高活性、多功能蛋白質(zhì)多肽分子或糖蛋白,能調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮功能,它們通過與高親和力的特異性受體相互作用,在低濃度下發(fā)揮作用,是機(jī)體發(fā)揮免疫功能不可缺少的成分[1]。在動物體內(nèi),絕大多數(shù)細(xì)胞因子含量很低,其作用主要是提高動物的免疫功能及與動物的生長和代謝有關(guān)。主要包括干擾素(IFN)、白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)等。細(xì)胞因子通過旁分泌或自分泌方式發(fā)揮生物學(xué)作用,它有特定的靶細(xì)胞,并通過靶細(xì)胞膜上的特異性受體發(fā)揮作用。細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤增殖、促進(jìn)造血與組織修補(bǔ)和參與炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)內(nèi)分泌效應(yīng)等多種生物學(xué)功能[2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,對細(xì)胞因子研究的不斷深入,更多的細(xì)胞因子為人們所認(rèn)識,其應(yīng)用也越來越廣泛。多種細(xì)胞因子已被用于作用體內(nèi)免疫活性細(xì)胞,促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,作為佐劑來增強(qiáng)基因疫苗的免疫效果。本文敘述了細(xì)胞因子在免疫增強(qiáng)劑和免疫治療劑、構(gòu)建新型基因工程苗等方面的主要研究進(jìn)展。

1 干擾素

干擾素是一類具抗病毒、抗腫瘤、影響細(xì)胞生長、分化和調(diào)節(jié)免疫功能等活性的蛋白,分為三類：IFN-α、IFN-β、IFN-γ。其中 IFN-α、IFN-β具有相似的生物學(xué)活性,統(tǒng)稱為Ⅰ型干擾素,IFN-γ屬于Ⅱ型干擾素,其生物學(xué)活性與Ⅰ型干擾素有明顯的不同,能誘導(dǎo) Th0細(xì)胞分化成 Th1細(xì)胞,可增加抗原遞呈細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex,MHC)分子的表達(dá),對產(chǎn)生 CTL應(yīng)答和提高 IgG抗體有很大幫助。干擾素是當(dāng)代生物技術(shù)藥品中基礎(chǔ)和臨床研究最為廣泛的生物激活素。

Babiuk等應(yīng)用 rbIFN-α(重組牛干擾素)來防治牛呼吸道疾病,在用牛皰疹病毒攻毒前 2天,犢牛鼻內(nèi)給藥 rbIFN-α,發(fā)現(xiàn)給藥的犢牛呼吸道綜合征顯著少于對照犢牛。同樣,接種溶血性巴氏桿菌4 d后,再注射 rbIFN-α,可以明顯縮短發(fā)病期和減緩肺炎癥狀。IFN-α能直接抑制病毒復(fù)制,激活NK細(xì)胞,增強(qiáng) CTL識別病毒感染細(xì)胞的能力及調(diào)節(jié) MHC分子表達(dá)[3]。同年,Peel等的實(shí)驗(yàn)表明大劑量鼠傷寒沙門氏菌感染犢牛,同時(shí)肌注 rbIFN-γ,可以提高感染犢牛的存活率。Reddy等給母牛注射 rbIFN-γ,和對照組相比,對皰疹性口炎病毒具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用。在牛的哺乳期內(nèi),適量注射 rbIFN-γ或IL-2可以提高淋巴細(xì)胞的殺菌能力,預(yù)防細(xì)菌性乳房炎。IL-12或 IFN-γ與HBV DNA疫苗聯(lián)合免疫小鼠,明顯增強(qiáng)了 TH1型免疫應(yīng)答,提高了抗 HBV的表面 IgG2a抗體的產(chǎn)生,但 TH2型免疫應(yīng)答和 IgG1抗體的產(chǎn)生受到明顯的抑制,CTL活性明顯提高[4]。Sordillio和Babink證實(shí)了大腸桿菌性乳腺炎可以被 rbIFN控制。1987年,Pjagfair等首先發(fā)現(xiàn) rbIFN-γ具有佐劑的效果,其作為免疫佐劑在瘧疾疫苗和水泡性口炎疫苗中有良好的效果。1999年,Plachy等進(jìn)行雞重組干擾素(rChIFN)防治勞氏肉瘤病毒(RSV)腫瘤的研究,獲得了抗病毒的顯著效果。有人發(fā)現(xiàn)rChIFN-γ可以作為抗球蟲制劑和免疫增強(qiáng)劑[5]。目前,已經(jīng)確定 rChIFN-γ作為疫苗佐劑對鴨病毒性肝炎等鴨病進(jìn)行防治,可以明顯提高其效果。

賈立軍等[6]提出利用共表達(dá) γ干擾素和新城疫病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶基因的重組雞痘病毒 rFPV-NDV免疫 17日胚齡火雞胚,在 NDV強(qiáng)毒株攻擊后,保護(hù)率顯著高于 rFPV-NDV單獨(dú)免疫,表明 γ干擾素具有免疫增強(qiáng)作用。彭大新等[7]利用適當(dāng)劑量組合的表達(dá)馬立克氏病病毒 gB基因的重組雞痘病毒(rPPV-MDV-gB)和 rPPV-INF-γ聯(lián)合免疫 SPF雞,保護(hù)指數(shù)也高于 rPPV-MDV-gB單獨(dú)免疫。

馬鳳龍[8]實(shí)驗(yàn)證明了不同劑量的豬重組 γ干擾素分別與豬瘟兔化弱毒苗、豬藍(lán)耳病弱毒苗和偽狂犬弱毒疫苗聯(lián)合應(yīng)用,可提高血清抗體水平,增強(qiáng)疫苗的免疫效果。與此相反,Xiang等報(bào)道了在DNA疫苗中共免疫 IFN-γ的效應(yīng),在狂犬病病毒感染的鼠模型中,共表達(dá) IFN-γ出現(xiàn)了對疫苗免疫原性輕微的負(fù)效應(yīng),主要表現(xiàn)為抑制輔助性細(xì)胞增殖反應(yīng)和降低狂犬病病毒特異性的中和抗體水平。Leong等以共表達(dá) IFN-γ和流感病毒血凝素的重組雞痘病毒免疫鼠時(shí)發(fā)現(xiàn),γ干擾素雖不影響細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),但會顯著抑制針對 HA的抗體。孫永科在用雞傳染性支氣管炎(IB)弱毒苗與 rFPV-IFN-γ聯(lián)合免疫,以及用共表達(dá) IBVS1和雞 IFN-γ的重組雞痘病毒(rFPV-IFN-γ-S1)免疫雞時(shí)也發(fā)現(xiàn)這兩組雞的抗體水平均低于IB弱毒苗單獨(dú)免疫組。但胡慧瓊研究證實(shí),菌苗接種前注射 γ干擾素,抑制特異性抗體的產(chǎn)生,而接種后使用則可逆轉(zhuǎn)對抗體的抑制作用。我們推測造成這種差異的原因之一可能是疫苗免疫時(shí),應(yīng)用 IFN-γ的時(shí)間不同和干擾素或疫苗的差異造成的。其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

2 白細(xì)胞介素

白介素是由各種白細(xì)胞產(chǎn)生的、介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用的細(xì)胞因子,在細(xì)胞的活化、增殖和分化中起調(diào)節(jié)作用。至今得到公認(rèn)的白介素有 18個(gè),分別命名為 IL-1～I(xiàn)L-18。其中,IL-3又稱多能集落刺激因子,可刺激多能造血干細(xì)胞和各系祖先細(xì)胞的分化和增殖,表現(xiàn)為對淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等的分化和成熟皆有一定促進(jìn)作用。

在基因工程疫苗研制中,常把細(xì)胞因子基因(例如,IL-2、IL-1、GM-CSF等 )和保護(hù)抗原基因連接在一起,構(gòu)成融合蛋白,以增強(qiáng)疫苗的抗體產(chǎn)生和細(xì)胞免疫水平。IL-2在體內(nèi)的半衰期也因此而延長約四倍。采用此種方式獲得 IL-2抗原重組蛋白,是研制新一代基因工程疫苗的一種有效途徑。僅以氫氧化鋁為佐劑的傳統(tǒng)方法,對含IL-2的重組糖蛋白不能起到保護(hù)作用[9]。

Nanberg等報(bào)道,以 IL-2和狂犬病滅活苗聯(lián)合應(yīng)用,攻毒后,疫苗對試驗(yàn)鼠的保護(hù)作用至少提高 25倍。Reddy等報(bào)道,將低劑量(2.5～0.25 IU/kg)重組牛 IL-2與牛皰疹病毒 I型活苗(BHV21)聯(lián)合使用[10],血清中和抗體滴度比單獨(dú)使用疫苗組提高 6倍,攻毒后病毒排毒減少 4倍。

李震等[11]分別利用巴馬小型豬和杜長上雜交肉豬(斷奶初期)進(jìn)行了豬藍(lán)耳病弱毒疫苗和 IL-2接種牛的試驗(yàn),證明 rb IL-2可有效促進(jìn)試驗(yàn)豬血液中藍(lán)耳病毒中和抗體水平的提高,一致表現(xiàn)在促進(jìn)初免的抗體水平迅速上升,疫苗劑量相對較低時(shí),促進(jìn)二免中和抗體水平的上升。

Grakoui A等發(fā)現(xiàn)將包含 HCV-C蛋白的基因片段插入真核表達(dá)載體 pcDNA3.1中,構(gòu)建重組質(zhì)粒 pcDNAHCV-C。將此重組質(zhì)粒單獨(dú)或與包含鼠IL-2或 IL-12基因的表達(dá)質(zhì)粒共免疫 BALB/c小鼠,可增強(qiáng)基因疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度,可能有利于機(jī)體優(yōu)先誘導(dǎo) CTL免疫應(yīng)答,清除病原體。Weinberg等發(fā)現(xiàn) IL-2可提高單純皰疹病毒粗提物或其糖蛋白亞單位苗的免疫效果[12]。Ram等[13-15]先后報(bào)道將小鼠或人 IL-2 cDNA與含禽流感病毒血凝素(HA)基因的痘病毒重組,獲得可以表達(dá) IL-2的重組病毒,將這種重組病毒與不含IL-2基因的痘病毒同時(shí)接種裸鼠,結(jié)果顯示,IL-2的插入并不影響 HA的表達(dá)水平及免疫原性,但可以防止對裸鼠的致死性攻擊,說明插入細(xì)胞因子可以大大提高活病毒載體的安全性[16]。此后,又將 IFN等基因插入痘病毒,也取得了同樣的結(jié)果。Hazama等將 IL-2基因與牛單純性皰疹病毒糖蛋白 K基因融合,真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)融合蛋白,免疫小鼠后攻毒,結(jié)果該融合蛋白可以完全保護(hù)小鼠免受病毒的攻擊。Yanira等發(fā)現(xiàn)重組雞痘病毒(rFPV)表達(dá)的 IL-1β和 IL-2在一定的劑量下可以增強(qiáng)La Sota疫苗的免疫效果,具有免疫增強(qiáng)作用[17]。Schijns等報(bào)道了重組 TNF-α、IL-1α、IL-2和IFN-γ對狂犬病滅活苗的增強(qiáng)效果[18]。表明重組IL-2和 IFN-γ的作用相當(dāng),可使疫苗達(dá)到 50%保護(hù)的稀釋倍數(shù)提高 50倍。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)疫苗做1∶10 000稀釋時(shí),仍可提高保護(hù)性免疫。

另外,魏曉麗等[19]報(bào)道 IFN-γ、TNF-α等Th1型細(xì)胞因子接種孢球蚴后水平均上升,而IL-4、IL-10等 Th2型細(xì)胞因子相對維持較低水平,這表明細(xì)胞因子在宿主對孢球蚴的免疫應(yīng)答中可能起重要作用。據(jù)此,楊梅等[20]將重組 Bb2EmⅡ/32Em142323疫苗分別通過皮下注射、肌肉注射、鼻腔黏膜接種和口服接種法免疫 BALB/c小鼠12周后,用 50個(gè)多房棘球絳蟲原頭蚴腹腔注射進(jìn)行攻擊,攻擊感染后 18周剖殺小鼠,取脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液體外培養(yǎng),分別以多房棘球絳蟲抗原(EmAg)、刀豆素 A(ConA)刺激誘導(dǎo)白細(xì)胞介素 12(IL-12)、白細(xì)胞介素 10(IL-10)和干擾素γ(IFN-γ)；以脂多糖(LPS)刺激誘導(dǎo)腫瘤壞死因子 α(TNF2α),常規(guī) ELISA測定脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 IL-12、IL-10、IFN-γ和 TNF-α水平。結(jié)果表明與對照組相比,疫苗免疫組 IFN-γ、IL-12、TNF-α水平增加,IL-10水平降低,EmAg刺激組和 ConA或 LPS刺激組細(xì)胞因子水平明顯高于相應(yīng)的原疫苗組?？梢姸喾考蚪{蟲重組 Bb2EmⅡ/32Em142323疫苗可誘導(dǎo)攻擊感染小鼠產(chǎn)生 Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答,增強(qiáng)宿主抗多房棘球絳蟲感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。

3 展 望

目前,免疫抑制性的動物傳染病日漸增多,急需免疫增強(qiáng)型的新型疫苗,或加強(qiáng)傳統(tǒng)疫苗的免疫效果。以重組干擾素、白介素等作為免疫佐劑可能是解決目前眾多疫苗,特別是寄生蟲疫苗效果不良或不穩(wěn)定問題的有效途徑之一,是被人們普遍看好并具有廣闊應(yīng)用前景的新型佐劑。利用細(xì)胞因子增強(qiáng)或調(diào)節(jié)機(jī)體的非特異性免疫,多種新型重組細(xì)胞因子,可以明顯增強(qiáng)疫苗的抗體產(chǎn)生和細(xì)胞免疫水平,有效防治禽畜疾病,而且將在畜牧業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。雖然目前對細(xì)胞因子如何參與免疫系統(tǒng)調(diào)控,增強(qiáng)重組疫苗的免疫應(yīng)答有一定的認(rèn)識,但仍存在較多問題。問題之一是對保護(hù)性免疫應(yīng)答的本質(zhì)尚不甚清楚。在哺乳動物,對病原的獲得性保護(hù)通常是由于細(xì)胞免疫或體液免疫在起作用,然而,細(xì)胞免疫、體液免疫以及先天性免疫應(yīng)答會在感染的不同階段產(chǎn)生,要確定何種應(yīng)答對保護(hù)起決定作用非常困難。另一個(gè)問題是由于重組細(xì)胞因子蛋白被直接注射到體內(nèi)后會被迅速降解和清除,因此,如何優(yōu)化免疫程序還有大量探索性工作要做。在某些情況下,免疫途徑會影響細(xì)胞因子佐劑的效果。此外,能否將幾種細(xì)胞因子聯(lián)合使用也是人們感興趣的問題。例如,IL-12與GM-CSF組合,以及 IL-4或 IL-2與 GM-CSF組合即將用于臨床?？傊?隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展,對細(xì)胞因子的研究將不斷深入,細(xì)胞因子更多的生物學(xué)功能被人們所認(rèn)識,其應(yīng)用范圍也越來越廣泛。

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