冰凍切片的技巧

張麗芳

冰凍切片是目前臨床病理檢查中最常用的快速制片方法。是在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度然后進(jìn)行切片的一種方法，具有速度快、方便的特點(diǎn)。冰凍切片與常規(guī)石蠟切片相比局限性和難度較大。如果出現(xiàn)切片不完整、厚薄不均、刀痕、冰晶等情況常導(dǎo)致細(xì)胞腫脹變形使診斷困難甚至誤診。而冰凍切片病理診斷的重要性是不言而喻的，制作1張優(yōu)良的冰凍切片包含著許多細(xì)節(jié)，為此對(duì)技術(shù)人員的要求很高。通過積極探索和工作實(shí)踐本文就冰凍切片的一些技巧進(jìn)行介紹。

1 取 材

取材須由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師負(fù)責(zé)這樣才能保證取到合適的病變。取材時(shí)盡量保持刀具與臺(tái)面的干燥避免組織與水接觸。如送檢組織內(nèi)含水或血性液，應(yīng)用干燥的紗布或者濾紙把水吸干，可提高切片質(zhì)量，防止空洞、冰晶等現(xiàn)象出現(xiàn)。取材應(yīng)盡量小些一般可切取1.5cm×1.5cm×0.3cm，組織厚度勿超過4mm[1]，這樣有利于組織的速凍及形態(tài)結(jié)構(gòu)保存[2]。因脂肪組織不易切片取材中應(yīng)盡量剔除[3]。

2 速 凍

速凍是冰凍切片的關(guān)鍵，冷凍的速度可有效的減少冰晶的出現(xiàn)。因此冰凍時(shí)間的控制對(duì)切片影響尤為重要。一般較硬組織如子宮肌瘤1～2min，軟組織以及細(xì)胞豐富的組織如肝、脾、淋巴結(jié)等2～4min，脂肪組織5～6min、同時(shí)脂肪組織切片厚度要增加到8～20μm。

3 溫 度

冰凍切片的溫度要適宜，溫度過低、過高會(huì)導(dǎo)致組織過硬或硬度不夠，從而影響切片質(zhì)量，產(chǎn)生搓板狀、梯田狀、厚薄不均、破碎或粉末狀現(xiàn)象。根據(jù)器官組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和組成成分的不同，冰凍組織切片的溫度亦不同推薦未固定的組織：乳腺、卵巢、子宮等：-20～-25℃；胃、腸：-18～- 20℃；甲狀腺、肝、腎、脾等：-15℃左右；脂肪組織一般在-35℃以下。已固定的組織最好選擇-12℃～-17℃[4]。

4 切 片

可提前將鋒利的切片刀調(diào)節(jié)合適的角度安在刀架上，可使切片刀的溫度適宜，防止出現(xiàn)切片粘連。切片時(shí)需注意抗卷板與刀鋒的距離，用力需均勻、柔和，防止污染及切片皺折，先將組織輕修后再觀察切面，盡量修至最大切面，帶包膜的組織一定要切完整小的結(jié)節(jié)或重點(diǎn)病變部位要切到位，必要時(shí)多個(gè)切面貼片。附貼切片時(shí)動(dòng)作需輕巧、快速，用力需均勻，防止切好的組織卷曲出現(xiàn)皺褶。

5 固 定

附貼好的組織切片應(yīng)立刻放入AAF液（95%酒精85mL+甲醇10mL+冰醋酸5mL）中固定。若固定液濃度過低或組織內(nèi)含過多的壞死組織易導(dǎo)致切片脫落。一些含脂肪較多的組織為防止掉片可將切片先用電吹風(fēng)吹干、再經(jīng)切片固定時(shí)間長(zhǎng)些（或經(jīng)95%酒精雙重固定），后再行染色，同時(shí)保持載玻片干凈，應(yīng)定期更換固定液。

6 染色、封固

為提高冰凍診斷的準(zhǔn)確率，對(duì)冰凍切片染色要求較高，要求著色佳，細(xì)胞染色要求核質(zhì)分明、對(duì)比度好。固定好的組織切片經(jīng)水洗后直接入蘇木素1～2min（冬季蘇木素著色較慢，可將蘇木素預(yù)放入37℃溫箱30～60min，或直接將切片置于酒精燈上加熱，由于酒精燈加熱溫度過高，故應(yīng)將切片左右前后移動(dòng)）→充分水洗→鹽酸酒精分化（有一些可省略如纖維較多的組織） →PBS或氨水藍(lán)化→水洗→75%酒精→0.5%伊紅→80%乙醇→95%乙醇→無水乙醇→無水乙醇（或正丁醇易使乙醇與二甲苯的相融性） →二甲苯浸泡兩次→吹干（先用熱風(fēng)吹后用冷風(fēng)吹）→中性樹膠封固。在天氣潮濕時(shí)須及時(shí)更換無水乙醇及二甲苯，否則會(huì)影響脫水易出現(xiàn)切片不透明出現(xiàn)云霧現(xiàn)象，從而影響閱片。封片時(shí)要做到無氣泡、無溢液、標(biāo)簽清楚端正，保證切片的整潔。這樣做出來的組織切片可使切片完整、平坦、厚薄均勻、染色分明、結(jié)構(gòu)清晰，明顯減少細(xì)胞腫脹、收縮，有利于提高診斷的正確率。

總之，冰凍切片是較難掌握的病理實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，只有掌握好技巧才能不斷提高切片質(zhì)量，提高冰凍診斷水平、減少誤差率。

[1]陳潔.制作冰凍切片的幾點(diǎn)體會(huì)[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2001,13(12):614.

[2]田玉旺,丁華野.一種減少冷凍切片組織內(nèi)冰晶的處理方法[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2002,18(5):568.

[3]李梅.提高病理冰凍切片質(zhì)量的體會(huì)[J].醫(yī)學(xué)信息,2009,22(12):2801-2802.

[4]吳艷霞.冰凍切片的制作方法分析[J].吉林醫(yī)學(xué),2009,30(6):493-494.