泌尿道感染動物模型制作研究現(xiàn)狀

顧向晨，王 怡，邵汀汀

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200437； 2.浙江大學生物醫(yī)學工程系，杭州 310027）

泌尿道感染是臨床常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率根據(jù)我國普查統(tǒng)計，占到人口0.91％，在婦女、兒童和老年人、HIV感染者、糖尿病及腫瘤等患者中均有很高的發(fā)病率。盡管當今抗菌藥物研究迅猛發(fā)展，品種不斷更新?lián)Q代，泌尿道感染的發(fā)病率仍居高不下，且不斷面臨新的挑戰(zhàn)，抗菌素的濫用、免疫抑制劑的應用等導致一些原來非致病菌引起的感染不斷增加。泌尿道感染按照解剖部位的不同，分為尿道炎、膀胱炎和腎盂腎炎。反復不斷感染，病情遷延，可發(fā)展為慢性腎盂腎炎，是一種較嚴重的形式，除尿道刺激癥狀外，還出現(xiàn)全身癥狀，而且常常由于用藥不規(guī)則，細菌極易產(chǎn)生多重耐藥性。晚期出現(xiàn)腎功能不全，可危及患者生命。據(jù)歐洲透析中心統(tǒng)計資料表明，慢性腎盂腎炎占整個慢性尿毒癥的19.8％～21.2％。

制作與人類泌尿道感染相似的動物模型，對探討本病的發(fā)病機制和研究的治療方法十分必要。但是對于泌尿道感染模型的研究仍較少，目前已有一小部分動物實驗展開，現(xiàn)將近年來國內(nèi)外泌尿道感染動物模型制作的研究情況綜述如下。

1 模型類型

1.1 急性腎盂腎炎模型

小鼠、大鼠、兔、狗、猴、豬等都可作為制作急性腎盂腎炎模型動物［1］。急性腎盂腎炎是較易制作的模型，包括經(jīng)尿道逆行性腎盂腎炎，血源性腎盂腎炎等，國內(nèi)外報道較多。

1.1.1 豬：國外 Majd［2］等運用約克郡豬作為急性腎盂腎炎模型，比較CT、MR、多普勒超聲、SPECT在診斷急性腎盂腎炎的差異。其制作方法首先切開輸尿管肌層縫至輸尿管膀胱交界處，手術后5 d持續(xù)予抗生素預防感染，再經(jīng)皮注入E.choli至膀胱，并注入異物石蠟油1～2 mL來保持感染狀態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)該模型有典型急性腎盂腎炎病理表現(xiàn)。豬個體較大，術中易于辨認輸尿管，且便于術后不同時期采集血液和尿標本進行觀察，是較理想的動物，但價格較貴，不易進行大批試驗。

1.1.2 小鼠：小鼠個體小，手術操作及辨認輸尿管較困難，不易建立重復性高的逆行性腎盂腎炎動物模型，常作為血源性腎盂腎炎的模型動物［3］。近年有人用小鼠制作逆行性腎盂腎炎模型［1］。Hagberg等［4］，首先報告將病原菌直接注入小鼠膀胱內(nèi)即可制備成小鼠上行性腎盂腎炎模型，該模型己成為研究泌尿道感染的病理機制和篩選有效藥物的重要工具。王旭丹等［5］利用小鼠制作上行性腎盂腎炎模型，研究柴芩通淋片對泌尿道感染的防治作用，模型制作結果示，腎臟和膀胱中均有大量大腸桿菌定居。1.1.3 大鼠：大鼠個體適中，在模型制作過程中，一般多從尿道或直接腹腔內(nèi)注射，注入各種菌種，并注入異物于膀胱中，而且手術中易于辨認輸尿管，特別是大鼠泌尿道解剖特點，容易發(fā)生尿液自發(fā)性輸尿管膀胱反流，注入0.5～1.5 m L細菌懸液，并利用尿道口鉗夾的方法制作成機械性的膀胱內(nèi)靜水壓增高，來造成逆行性感染，與人類腎盂腎炎的感染方式接近［6］。國外于20世紀70年代制作了大鼠急性腎盂腎炎模型，用于該病發(fā)病學和治療學研究，其后國內(nèi)亦復制成功并進行了改良［7］。所以急性腎盂腎炎模型［6、8］目前多采用將大鼠單側輸尿管“半結扎”并同時向膀胱內(nèi)注射大腸桿菌的方法造成病理改變。

不理想的是大鼠不便于在術后不同時間采集血、尿標本，進行病程觀察，用代謝籠收集大鼠尿液進行細菌培養(yǎng)，但由于糞便污等原因，收集的尿液細菌培養(yǎng)假陽性率很高。同時注菌量與大鼠體重關系密切，體重較小的大鼠越容易死亡，注菌量越多可引起敗血癥或血源性腎盂腎炎。

亦有國外報道 Gorur S等［9］采用不結扎單側輸尿管，單純膀胱內(nèi)注射大腸埃希氏菌，制作方法如下，排空膀胱，用22G靜脈留置針通過尿道，往膀胱內(nèi)直接注射大腸埃希氏菌0.4 mL（109/m L CFU），拔除留置針后，予火膠棉迅速封閉尿道口，4 h后予丙酮去除火膠棉，結果發(fā)現(xiàn)可成功研制急性腎盂腎炎模型。

何立群、龔學忠等［10］也采用不結扎單側輸尿管、單純膀胱內(nèi)注射一定量大腸桿菌 O111B4的方法，成功制備了急性腎盂腎炎大鼠模型。同時他們［11］又比較了與單側輸尿管結扎模型的異同，研究結果發(fā)現(xiàn)，前種模型病理改變相對較輕，不會出現(xiàn)明顯化膿灶，但急性腎盂炎癥過程典型。后種模型均可產(chǎn)生單側腎實質(zhì)化膿性病變；常伴有腎小管毀損、并可有腎小球累及；同時，前種模型未顯示有某一側腎臟易感性，而后種模型病變主要在結扎側。

亦有國外學者Ichino M等［12、13］直接打開腹腔，予0.1 m L 109/m L大腸埃希氏菌懸液，通過26G針頭，單次直接注射至大鼠雙側腎臟皮質(zhì)制作急性腎盂腎炎，病理提示術后3-4周出現(xiàn)腎臟損傷。此模型主要適用于研究腎間質(zhì)損害，與單側輸尿管“半結扎”同時膀胱內(nèi)灌注細菌大樹相比，操作方法簡單，病理顯示感染表現(xiàn)較恒定，可復制性強，但其缺陷為不能真實模擬人類上行性腎盂腎炎。

1.2 慢性腎盂腎炎模型

國外研究證實，有多種方法能夠造成慢性腎盂腎炎動物模型，但有些方法周期太長，或者為豬、兔，比較昂貴［14］。

1.2.1 大鼠：王俊生等［15］在國內(nèi)首先利用尿道直接接種細菌的方法，報道了CPN大鼠模型，該方法并不能誘導腎臟外觀出現(xiàn)瘢痕和固縮，嚴格講并不成功。龔學忠等［16］按照Bitz等的方法，延長觀察時間創(chuàng)建一種慢性腎盂腎炎大鼠模型，用不同濃度致病性大腸桿菌株膀胱內(nèi)注射，并短暫結扎左側輸尿管，觀察90天內(nèi)腎臟形態(tài)學動態(tài)變化，結果發(fā)現(xiàn)隨著感染性炎癥的修復，左腎外觀有皮質(zhì)瘢痕及相關腎乳頭收縮和腎盞的擴張，鏡下慢性腎間質(zhì)性腎炎改變和纖維化；細胞培養(yǎng)陽性結果主要在左腎和尿； 1.2.2 小鼠：孫建實、栗德林等［17］運用 C57BL小鼠模型制作慢性腎盂腎炎模型，進一步證實上述方法。結果發(fā)現(xiàn)尿細菌培養(yǎng)從6 h起即為陽性，持續(xù)到30天轉(zhuǎn)為陰性，以后一直未培養(yǎng)出細菌。但在腎臟病理學上有明顯變化，在第90天時患腎極度萎縮，腎組織持續(xù)破壞。

1.3 腺性膀胱炎模型

腺性膀胱炎是一種在膀胱粘膜和粘膜下層發(fā)生粘液腺增生的疾病，是由膀胱尿路上皮受慢性刺激誘導產(chǎn)生的一種化生性改變。位志峰及易憬等［18-19］先后選取 SD 雌性大鼠，往膀胱內(nèi)灌注DH5α大腸埃希氏菌（濃度為108～109CFU/μL）或脂多糖（1μg/μL），然后用無菌硬膜外導管用無菌液體石蠟潤滑后，提起尿道外口的皮膚，沿尿道后壁插入尿道3 cm以上，用1 m L注射器注入0.2 m L左右，2～3 d注射一次，持續(xù)6周左右。研究表明膀胱內(nèi)灌注大腸桿菌或脂多糖均可導致腺性膀胱炎，證實了大腸桿菌和脂多糖的慢性感染是導致腺性膀胱炎的病因之一。但是此種動物模型制作時間較長，對于導尿管留置也需要一定技術，反復操練，否則易引起尿道損傷，同時需反復麻醉，安全性較低，較易引起大鼠死亡。

1.4 糖尿病大鼠泌尿道感染模型

國外有學者［20］研究制作糖尿病合并泌尿道感染大鼠模型，利用鏈尿菌素腹腔內(nèi)注射誘導經(jīng)典糖尿病大鼠模型，再經(jīng)尿道至膀胱內(nèi)灌注菌液，結果發(fā)現(xiàn)膀胱和腎臟均有菌群生長，成功制成泌尿道感染模型，與人類糖尿病患者合并泌尿道感染特點基本符合，并通過該模型進一步闡釋糖尿病患者易患泌尿道感染因素。

1.5 尿路異物相關泌尿道感染大鼠模型

有國外學者 Kurosaka及 Mikuniya等［21，22］通過非手術法，將螺旋聚乙烯管經(jīng)尿道置于大鼠膀胱中，同時注入綠膿桿菌，制成非手術異物相關泌尿道感染大鼠模型。與未置入聚乙烯管大鼠相比較，前者感染維持時間較長，在感染早期，PT聚乙烯管周圍包裹較多細菌，同時細菌從膀胱上行至腎臟，病理早期表現(xiàn)為急性腎盂腎炎，后期為慢性腎盂腎炎，以及持續(xù)中性粒細胞浸潤，伴盆腔及周圍組織充血。該模型能夠較好模擬人類導尿管留置相關泌尿道感染。

1.6 解脲棒狀桿菌介導的泌尿道感染合并鳥糞結石形成模型

Reyes L等［23］研究發(fā)現(xiàn)鳥糞結石雖只組成了所有結石成分的2％～3％，但與其他結石相比會導致更加嚴重并發(fā)癥，例如嚴重敗血癥及腎臟疾病等。作者認為產(chǎn)尿素酶的棒狀桿菌、克雷伯氏桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌，是易于引起鳥糞結石等常見細菌，但不同品系的大鼠對解脲棒桿菌的易感性有很大差別。通過此研究表明鳥糞結石生成是機體的炎癥應激反應，可進一步加重周圍組織的損傷。

2 不足與展望

目前研究較多側重于腎盂腎炎模型的研究，例如運用大鼠單側輸尿管“半結扎”并向膀胱內(nèi)注射大腸桿菌制作急性腎盂腎炎模型方法已十分成熟，模型制作過程簡單，重復性尚可，是研究人類腎盂腎炎合適的動物模型。也有運用單純膀胱內(nèi)注射不結扎輸尿管制備急性腎盂腎炎大鼠模型，方法較簡單，但穩(wěn)定性較差。對于腺性膀胱炎以及其他類型的泌尿道感染模型也在進一步研究中。

同時許多學者發(fā)現(xiàn)在泌尿道感染模型制作與動物的品系，細菌菌種及濃度更是密切相關，并對此進行了深入研究。例如 Schaeffer等［25］發(fā)現(xiàn)不同品系小鼠泌尿道感染的易感性不同，細菌清除率也不同。常規(guī)小鼠膀胱內(nèi)注入細菌，其感染時間一般持續(xù)在14 d之內(nèi)。但結果發(fā)現(xiàn)，在 BALB/c、C3H/HeN、C57BL/6、DBA.1、DBA.2、以及AKR小鼠可觀察到中等程度感染，在14天內(nèi)緩解，而在SWR和SJL小鼠可觀察到較低程度感染，在C3H/HeJ和C3H/OuJ小鼠可觀察到較高程度感染，多持續(xù)在14 d以上。該作者認為在絕大多數(shù)小鼠品系感染可自行緩解，但是由于某些小鼠特殊遺傳背景，導致泌尿道感染可持續(xù)更長時間。亦有學者［23］比較F344、LEW，SD及W IS大鼠對解脲棒狀桿菌的易感性及結石生成情況，予膀胱內(nèi)注入解脲棒狀桿菌，2周后處死，發(fā)現(xiàn)100％F344大鼠合并下尿路感染，64％F344大鼠膀胱內(nèi)產(chǎn)生鳥糞結石及嚴重感染，而其他品系大鼠感染緩解，并無鳥糞結石形成。以上研究也提示在泌尿道感染造模過程中，不同模型可表現(xiàn)出不同易感性，品系選擇十分重要。

Hopkins和Schaeffer等［26，27］在研究小鼠泌尿道感染模型制作中，還關注了不同劑量與濃度的細菌和不同大小和材質(zhì)的插管，并經(jīng)不同途徑（尿道內(nèi)或經(jīng)尿道至膀胱內(nèi)）注入細菌懸液對模型制作的影響。結果發(fā)現(xiàn)除了小劑量尿道內(nèi)注入細菌懸液不易引起感染外，其他均可引起膀胱及腎臟的感染，濃度越高，感染程度越重。在前人的工作基礎上，Hung等［28］對小鼠泌尿道感染模型制作步驟及各種條件進行探討，詳細記錄小鼠泌尿道感染模型制定過程，通過細化菌群濃度及調(diào)整觀察時間，研制出可定量調(diào)控泌尿道感染模型。所以在泌尿道感染模型制作中，菌種濃度的選擇和材質(zhì)選擇亦十分重要，甚至細節(jié)可決定成敗。

因為引起泌尿道感染的常見病菌為大腸埃希氏菌，目前用于模型制作的菌種主要為大腸埃希氏菌。但很多研究也涉足了其他各種菌種，也包括其他常見細菌及微生物等，例如綠膿桿菌、克雷伯桿菌、變形桿菌、解脲支原體［25］。而大腸埃希氏菌種最常見選用大腸桿菌O111B4標準菌株［6-8，10］，或者有從臨床泌尿道感染患者身上分離獲得的大腸桿菌菌株［5］，亦有選用DH-5α［19］大腸桿菌克隆菌株作為菌株。所目前就有研究對不同菌株對模型的上行感染性差異進行了探討。例如鄭鈴、洪新如等［24］比較2株具有不同P菌毛粘附素的同血清型UPEC和1株無菌毛大腸埃希菌對小鼠泌尿道上行感染性的差異，結果發(fā)現(xiàn)具有P菌毛的UPEC菌株感染之小鼠，病理表現(xiàn)感染較重；無菌毛大腸埃希菌感染之小鼠，病理表現(xiàn)感染較輕。由此可以發(fā)現(xiàn)在泌尿道感染模型制作中，菌種及菌株選擇也十分重要，不同菌種及菌株種類，感染程度也不相同。

綜上所述，目前對于泌尿道感染模型制作的研究已全面展開，尤其國外的研究十分深入，運用不同模型制作與人類相似的泌尿道感染模型，并進一步探討了品系、菌種以及濃度等模型制作細節(jié)探討。但是目前缺乏成熟的慢性膀胱炎制作模型，作者正嘗試改良腺性膀胱炎的模型制作過程，來探討單純慢性膀胱炎制作，為下一步實驗打下基礎。

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