Meox1在心臟過表達(dá)引起轉(zhuǎn)基因小鼠擴張性心肌病

王書美，呂 丹，陳 煒，張 麗，張 偉，張曉娟，曹興水，張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

研究報告

Meox1在心臟過表達(dá)引起轉(zhuǎn)基因小鼠擴張性心肌病

王書美，呂 丹，陳 煒，張 麗，張 偉，張曉娟，曹興水，張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

目的建立心臟特異表達(dá)Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠，研究Meox1對心臟發(fā)育及心肌病的調(diào)節(jié)作用。 方法

利用心臟特異啟動子α－MHC構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，顯微注射法建立Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型，Western blot檢測Meox1在心臟組織中的表達(dá)，心臟超聲檢測轉(zhuǎn)基因小鼠及野生小鼠的心臟結(jié)構(gòu)和功能。結(jié)果在生理狀態(tài)下，Meox1基因只在幼鼠心臟中表達(dá)，在病理狀態(tài)下，Meox1基因在成年心肌病小鼠的心臟組織表達(dá)升高。通過顯微注射，建立了兩個Meox1基因在心臟組織的表達(dá)水平明顯高于同齡對照小鼠的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。與野生型小鼠相比，兩個Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠品系收縮期左室內(nèi)徑分別增加7.2%、12.8%(P＜0.01，n =16)，舒張期左室內(nèi)徑分別增加15.6%、24.2% (P＜0.01，n=16)，收縮期容積分別增加36.8%、65.7%(P＜0.01，n=16)，舒張期容積分別增加18.2%、33.8%(P＜0.01，n=16)。射血分?jǐn)?shù)分別減小6.6%、9.3%(P＜0.05，n=16)，短軸內(nèi)徑縮短率分別減小9.4%、12.3%(P＜0.05，n=16)。結(jié)論Meox1在心肌病心臟中表達(dá)，其在心臟高表達(dá)引起心臟左室內(nèi)徑增加，收縮期容積和舒張期容積顯著增大，射血分?jǐn)?shù)及短軸縮短率減少等擴張性心肌病表型，是參與心肌病病理發(fā)生的基因之一。

Meox1;轉(zhuǎn)基因小鼠;心臟;心臟超聲

同源盒蛋白是一組調(diào)節(jié)組織生長和發(fā)育的系統(tǒng)發(fā)育保守的轉(zhuǎn)錄因子［1］。同源盒基因(homeobox gene)是控制發(fā)育的主要基因，對動物的器官發(fā)生和細(xì)胞分化調(diào)控起關(guān)鍵作用。脊椎動物中同源盒基因家族很大，按一個基因組中10萬個基因，估計超過0.2%的基因含有同源盒［2］。

Meox基因是一類組成非簇生的、分歧的、控制觸角樣的同源異形盒基因的亞家族，包括 Meox1 (mesoderm/mesenchyme homeobox gene1)和 Meox2 (mesoderm/mesenchyme homeobox gene 2)，在中胚層和間充質(zhì)的大范圍內(nèi)廣泛表達(dá)，編碼的蛋白可能在調(diào)節(jié)體節(jié)發(fā)育的分子信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用［3－7］。Meox1在形成體節(jié)的前體節(jié)中胚層、上皮體節(jié)、發(fā)育中的體節(jié)的生骨節(jié)和生皮肌節(jié)中表達(dá)。但在其他正常組織中也觀察到Meox1的表達(dá)，包括乳腺和卵巢。Meox2在生骨節(jié)，移行至四肢的移行肌原細(xì)胞以及四肢的前肌肉區(qū)表達(dá)［4，7，8］。

Mankoo等［9］報道了同源盒基因 Meox1和Meox2在調(diào)節(jié)體節(jié)形成，圖示發(fā)育和分化的幾種遺傳途徑中的協(xié)調(diào)作用。缺乏Meox1活性的小鼠，其椎骨和肋骨有缺陷，而缺乏 Meox2活性的小鼠，其在四肢肌肉的分化和形態(tài)發(fā)生中嚴(yán)重缺陷。同時缺乏Meox1和Meox2的小鼠缺乏中軸骨骼，并且骨骼肌嚴(yán)重缺陷。這些嚴(yán)重的缺陷表型表明，體節(jié)上皮形成、圖示發(fā)育、邊緣的維持、以及生骨節(jié)和生皮肌節(jié)衍生的細(xì)胞分化均需要Meox1和Meox2。

近年來，關(guān)于同源盒基因的報道日益增多，然而有關(guān)Meox1的研究卻很少，通過組織表達(dá)譜推測其對心臟發(fā)育及心血管系統(tǒng)可能具有重要的生理作用，本文特建立心臟特異表達(dá) Meox1的轉(zhuǎn)基因小鼠，以對其生理功能，特別是其對心臟正常發(fā)育可能存在的作用的進(jìn)行初步研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，康藍(lán)公司XCXK京2004001，ICR小鼠由本實驗室飼養(yǎng)，實驗中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為GC－08－2036。

1.2 實驗儀器與試劑

主要儀器:PCR儀(Effendorf)，電泳儀(ATTA)，凝膠 圖 象 分 析 系 統(tǒng) (Tannon)，循 環(huán) 水 浴(Pharmacia)，顯微注射儀(TE2000U)，電磁攪拌器，低溫高速離心機(Beckman)，紫外分光光度計(Amersham)，自動洗片機(Kodak X－OMAT2000)，小動物超聲影像系統(tǒng)(Vevo770)。

主要試劑:Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物(Invitrogen，美國)，pMD18 T載體、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Sal I和Not I(寶生物工程有限公司，中 國 )，NC 膜 (nitrocellulose membrane，Immobilon NC;Millipore，法國)，羊抗鼠 Meox1蛋白抗體 (Santa Crutz，美國)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊抗體(Pierce Biotechnology，美國)，內(nèi)參HRP－GAPDH康成生物，中國)?；瘜W(xué)發(fā)光試劑(Santa Cruz，美國)。

1.3 模型建立及實驗方法

1.3.1 Meox1表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠的制備:Trizol法提取 C57BL/6J小鼠心臟總 RNA，用RT－PCR法擴增小鼠 Meox1全長 cDNA，將擴增片段插入 pMD18T載體，經(jīng)測序并比對正確無突變堿基后，以 Sal I酶切回收 Meox1片段，并克隆入 α－MHC啟動子下游構(gòu)建心臟特異 Meox1表達(dá)載體。提取并酶切鑒定質(zhì)粒正確后，用 Not I將其線性化，SephedexG50柱純化 DNA片段，獲得 α－MHC啟動的 Meox1基因的轉(zhuǎn)基因片段，注射前將轉(zhuǎn)基因片段的濃度調(diào)整至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中，用 ICR小鼠作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠［10］。

1.3.2 PCR鑒定 Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型:轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法編號，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA［11］，用PCR法對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測。PCR上游引物為:5’－AAAGAGAGGTCAGACAACCAG－3’，下游引物為: 5’－CAGACTTTGACCTGCCGCTC－3’。PCR反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)。Meox1片段為200 bp。

1.3.3 Western Blot:將小鼠脫頸椎處死后，取 100 mg心臟組織加入1 mL預(yù)冷的蛋白裂解液，冰上充分研磨，之后冰上靜置30 min，再將組織勻漿于 4℃12 000 r/min離心 30 min，吸取上清即為心臟組織總蛋白。取50 μg蛋白上樣，12% 的SDS－PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到 0.45 μm硝酸纖維素NC膜上。將NC膜放入5% 脫脂奶粉封閉液，室溫下置搖床上封閉1 h，再用 TBST(1:200)稀釋的羊抗鼠 Meox1蛋白抗體，4℃ 雜交過夜。次日，TBST洗3次，每次5 min。將膜轉(zhuǎn)移到 TBST(1:15000)稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊抗體，室溫雜交1 h，采用HRP－GAPDH作為內(nèi)參，TBST洗3次，每次5 min。將膜置于化學(xué)發(fā)光液中，X－ray膠片曝光、顯影及定影。

1.3.4 超聲檢查Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠:選用3月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同窩陰性小鼠，用三溴乙醇(0.2 mL/ 10g體重)麻醉，脫去心前區(qū)的被毛，選用30 Hz的探頭，按 Zhou報道的方法進(jìn)行心臟超聲影像分析［12］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)SPSS統(tǒng)計軟件處理。先進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗，組間比較采用獨立性 t檢驗。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 Meox1基因在小鼠心臟組織中的表達(dá)

分別提取出生1周，1月，3月齡野生型小鼠，以及3月齡 cTnTR92Q和 cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠［13，14］的心臟組織總蛋白，用Meox1多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析，Meox1僅在1周齡幼鼠心臟中表達(dá)，成年小鼠心臟中不表達(dá)(圖1A)，而在心肌病小鼠模型的心臟中表達(dá)(圖1B)。

圖1 Meox1基因在小鼠心臟組織中的表達(dá)A:Expression of Meox1 gene in the heart of wild type mice at different ages detected by Western blot;B:Expression of Meox1 gene in the heart of cTnTR92Qand cTnTR141Wtransgenic mice detected by Western blotFig.1 Expression of Meox1 gene in the heart tissues

2.2 Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及基因型檢測

用 RT－PCR法克隆的小鼠 Meox1基因，測序結(jié)果表明克隆的 cDNA同已報道的 Meox1序列完全一致(GenBank No.NM_010791.3)，將 Meox1基因插入心臟特異表達(dá)的 α－MHC啟動子下游，構(gòu)建 α－MHC－Meox1轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體(圖2A)。用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入受體假孕 ICR小鼠中，小鼠出生14 d提取基因組 DNA，用PCR擴增 Meox1基因200 bp的片段，鑒定Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型(圖2B)，共得到7只首建鼠，且均可傳代。

圖2 Meox1轉(zhuǎn)基因載體和轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定圖A:Meox1 transgenic expression construct;B:Genotyping of Meox1 transgenic mice with PCR.Note:M:DL2000 DNA marker;P:positive control using α－MHC－Meox1 plasmid;N:negative control;W:blank control;1－10:genomic DNA samples from transgenic mice.Fig.2 Meox1 transgenic construct and genotyping of Meox1 transgenic mice with PCR

2.3 Meox1基因在轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中的表達(dá)

分別提取 Meox1首建鼠的 F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡陰性對照小鼠心臟組織總蛋白，用 Meox1多克隆抗體進(jìn)行 Western blot分析，結(jié)果顯示42號和46號轉(zhuǎn)基因陽性小鼠系心臟組織內(nèi) Meox1蛋白表達(dá)量明顯高于同齡陰性對照小鼠(圖3)。這2個系的小鼠用于繁殖并進(jìn)行心臟功能分析。

圖3 Meox 1在轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中的表達(dá)Note:WT:The wild type mouse control;F042 and F046:The two transgenic lines;GAPDH:Loading normalization.Fig. 3 Expression of Meox1 gene in the heart of transgenic mice

2.4超聲檢查 Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟幾何構(gòu)型及心功能

將3月齡的Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性小鼠進(jìn)行心臟超聲影像分析(表1)，結(jié)果顯示，Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠(Founder 42，F(xiàn)ounder 46)收縮期左室內(nèi)徑(LVID，systolic)分別增加7.2%(P＜0.01，n= 16)和12.8%(P＜0.01，n=16)，舒張期左室內(nèi)徑(LVID，diastolic)分別增加15.6%(P＜0.01，n= 16)和24.2%(P＜0.01，n=16)，收縮期容積(LV volume，systolic)分別增加36.8%(P＜0.01，n= 16)和65.7%(P＜0.01，n=16)，舒張期容積(LV volume，diastolic)分別增加18.2%(P＜0.01，n= 16)和33.8%(WTBX?P＜0.01，n=16)，射血分?jǐn)?shù)EF(ejection fraction)分別減小6.6%(P＜0.05，n =16)和9.3%(P＜0.01，n=16)，短軸內(nèi)徑縮短率 FS(fraction shortening)分別減小 9.4%(P＜0.05，n=16)和12.3%(P＜0.05，n=16)。

表1 野生型小鼠和Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟功能和結(jié)構(gòu)的分析Tab.1 The cardiac structure and function analysis of the wild type and transgenic mice

3 討論

同源盒蛋白是一組調(diào)節(jié)組織生長和發(fā)育的系統(tǒng)發(fā)育保守的轉(zhuǎn)錄因子［1］。1984年，McGinnis和Scott等在果蠅控制發(fā)育的基因中發(fā)現(xiàn)有一些高度保守的序列，這一序列為180 bp，編碼的60個氨基酸被稱為同源結(jié)構(gòu)域 (Homeodomain)，有螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋(helix－turn－h(huán)elix)基序(motif)，具有轉(zhuǎn)錄因子特征。這些基因因此被稱為同源盒基因。隨后，從動物和菌物中又陸續(xù)克隆了許多含有同源盒并且與發(fā)育有關(guān)的基因，這些基因既可以是同源盒基因(結(jié)構(gòu))，也可以被稱為同源異型基因(功能)。同源盒基因(homeobox gene)是控制發(fā)育的主要基因，對動物的器官發(fā)生和細(xì)胞分化調(diào)控起關(guān)鍵作用。

脊椎動物中同源盒基因家族很大，按一個基因組中10萬個基因，估計超過0.2%的基因含有同源盒［2］。傳統(tǒng)上同源盒基因分為兩個亞家族，一類是成簇排列在染色體上，并按前后軸(antero－posterior，A－P)方式表達(dá)，稱之為 A－P型，即 Hox基因或I類同源盒基因。HOX基因以4個染色體簇為一系列，各個成員有高度的相似性，胚胎發(fā)育中這些基因可能在軀體發(fā)育模式中發(fā)揮作用。另一類是非 A－P型同源盒基因，非成簇排列，而是散布于不同的染色體上，基于序列的相似性分為一系列組(group)，例如:Emx家族、Pax、Msx和 Otx家族的同源盒基因［3］，一般可能參與特異的器官發(fā)生。中胚層/間充質(zhì)同源盒基因Meox1屬于后者。

Meox1是轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)于發(fā)育中的體節(jié)，對細(xì)胞向骨骼肌系分化起重要作用。Helen等［15］在 P19胚胎癌細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)Gli2、Meox1、Pax3的調(diào)節(jié)環(huán)對中胚層細(xì)胞向肌肉細(xì)胞分化是必需的，并且對肌形成調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors，MRFs)的表達(dá)及向骨骼肌定性是必需的。

心臟中 Meox1首先在10.5 d.p.c心臟的局部區(qū)域表達(dá)，這些區(qū)域包括軀干動脈(其為大動脈和肺動脈的前身)，以及房室墊(形成隔和瓣膜)［3］。這一器官正在復(fù)合生長和重組。Meox1雜交信號未在后期妊娠胚胎成型的心臟中發(fā)現(xiàn)。在出生后的小鼠中，Meox1基因也在心臟神經(jīng)嵴衍生的主動脈升部和主動脈弓表達(dá)［16］，也在可能在來源于次級心臟區(qū)的主動脈根，肺動脈干以及心瓣膜平面結(jié)構(gòu)表達(dá)［17］.我們的結(jié)果也顯示 Meox1僅在1周齡幼鼠心臟中表達(dá)，成年小鼠心臟中不表達(dá)(圖1A)。

Peter等［18］于 P19胚胎癌細(xì)胞建立Meox1過表達(dá)的細(xì)胞系，研究發(fā)現(xiàn) Meox1可誘導(dǎo)心臟的形態(tài)發(fā)生。

盡管有關(guān)Meox1的研究已有數(shù)篇，但其心臟及心血管系統(tǒng)的生物學(xué)功能還是所知甚少。我們發(fā)現(xiàn)胚胎期表達(dá)的基因Meox1在肥厚型心肌病HCM模型中表達(dá)上調(diào)(圖1B)，因此建立了心臟特異的Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠。

首建鼠 Founder 42和 Founder 46的后代小鼠PCR檢測結(jié)果顯示外源基因能穩(wěn)定地傳遞到下一代。Western blot結(jié)果顯示Meox1基因的表達(dá)量在Founder 42和Founder 46轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中與野生型小鼠的相比顯著增高，表明成功建立了心臟特異高表達(dá)的α－MHC－Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠，Meox1過表達(dá)可使心臟發(fā)生心腔變大，室壁不變，心臟收縮功能減弱等改變，對心臟的生長發(fā)育有影響。因此，心臟特異表達(dá)的 Meox1轉(zhuǎn)基因小鼠的建立，為進(jìn)一步與心肌病小鼠模型雜交，研究該基因在心肌病發(fā)病中的作用提供了工具，為進(jìn)一步對Meox1在心臟發(fā)育和心肌病的發(fā)生過程中的生物學(xué)功能及可能的機制加以研究，為臨床心血管疾病的治療提供實驗依據(jù)。

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Over-Expression of Meox1 in Heart Tissue Causes Dilated Cardiomyopathy in the Transgenic Mouse

WANG Shu－mei，LV Dan，CHEN Wei，ZHANG Li，ZHANG Wei，ZHANG Xiao－juan，CAO Xing－shui，ZHANG Lian－feng
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，and Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo establish heart－specific Meox1 expression transgenic mice and to investigate its regulatory effect on the development of heart and cardiomyopathy. MethodsThe transgenic plasmid was constructed by inserting the mouse Meox1 gene into the down－stream of α－MHC promoter.The transgenic mice were generated by microinjection.The genotype of transgenic lines was identified by PCR，and the expression levels of the Meox1 gene were detected by Western blot.The pathologic and functional changes of the heart were analyzed by echocardiography. Results The results of Western blot showed that the expression of Meox1 was only detected in the heart of one－week old wide－type mice，but its expression was up－regulated in the adult mice with hypertrophic cardiomyopathy(HCM).The heartspecific transgenic C57BL/6J mice were established and used to analyze its effect on heart byechocardiography.Compared with the wild type mice，both of the two lines of Meox1 transgenic mice showed significantly heart remodeling with increased left ventricular systolic diameter(7.2%or 12.8% ，P＜0.01，n=16)，increased left ventricular diastolic diameter(15.6%or 24.2%，P＜0.01，n= 16)，increased systolic volume(36.8%or 65.7% ，P ＜0.01，n=16)，and increased diastolic volume(18.2%，33.8% ，P ＜0.01，n=16).Compared with the wild type mice，both of the two lines of Meox1 transgenic mice showed weaker heart function with decreased ejection fraction(6.6%or 9.3% ，P＜0.05，n=16)，and decreased fraction shortening(9.4%，or 12.3% ，P＜0.05，n= 16)。Conclusions The Meox1 is expressed during the pathogenesis of cardiomyopathy.Over－expression of Meox1 in the heart of the transgenic mice causes dilated cardiomyopathy.It suggests that Meox1 may be one of modifier genes which enhances pathogenesis of cardiomyopathy.

Meox1;Transgenic Mouse;Heart;Echocardiography

R－33

A

1671－7856(2010)04－0009－05

2009－12－25

衛(wèi)生部項目，實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501－026)。

王書美(1985－)，女，碩士生。E－mail:xiaomeiwang6@163.com.。

張連峰，E－mail:zhanglf@cnilas.org