野生西瓜抗枯萎病鑒定研究

覃斯華 ，黃金艷 ，洪日新 ，付崗 ，韓金星 ，李文信

（1.廣西農(nóng)科院園藝研究所，廣西南寧，530007；2.廣西農(nóng)科院植物保護(hù)研究所；3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院）

西瓜枯萎病，俗稱死秧、死藤，是由鐮刀菌寄生引起的土傳病害，苗期至收獲期均可發(fā)生，是瓜類蔬菜的重要病害之一，全國各地均有發(fā)生，特別是重茬地區(qū)，發(fā)病情況尤為普遍和嚴(yán)重。目前栽培品種中高抗枯萎病的西瓜材料缺乏，枯萎病主要靠嫁接換根預(yù)防，野生西瓜就是高抗枯萎病的嫁接砧木之一。本試驗主要對從國內(nèi)外收集到的野生西瓜材料進(jìn)行抗枯萎病鑒定，并對西瓜幼苗受到枯萎病病菌侵染后，SOD、POD、CAT酶活性的變化情況進(jìn)行分析測定。以期為深入研究西瓜枯萎病的發(fā)病規(guī)律、有效防治方法及抗性育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西瓜材料均由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供，野生材料分別為1號野生、2號野生、3號野生、4號野生、5號野生，以黑公子（栽培二倍體）、廣西三號（栽培三倍體）、廣西409（栽培四倍體）為對照。

1.2 菌種培養(yǎng)

西瓜枯萎病菌由鄭州果樹研究所、廣西農(nóng)科院植物保護(hù)研究所提供?？菸【N在廣西農(nóng)科院植物保護(hù)研究所微生物研究室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。首先將活化的枯萎病菌種，接種到PDA培養(yǎng)基上，在28℃的恒溫箱中培養(yǎng)10 d，然后加無菌水，經(jīng)4層紗布過濾后配成1×105個/mL的孢子懸浮液，備用。

1.3 試驗方法

西瓜在9月20日進(jìn)行育苗，9月30日移栽至泡沫箱，試驗設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)10株，8個材料，共240株，并對每組材料設(shè)一對照，試驗小區(qū)隨機(jī)排列。

試驗采用浸根法，將株高和長勢一致的西瓜幼苗輕輕拔出，用清水洗凈根部后在孢子懸浮液中浸5 min后取出，重新種入滅菌砂土盤中。從接種之日起，每天觀察幼苗的發(fā)病情況，共調(diào)查25 d，統(tǒng)計總發(fā)病株數(shù)，計算發(fā)病率。 分別在處理后的第 0、2、4、6、8 天，取幼苗根系和生長點(diǎn)下第2片展開葉，測定各項指標(biāo)，每處理分別取5株，對其枯萎病抗性生理進(jìn)行研究。

1.4 抗性分級標(biāo)準(zhǔn)

抗性分級標(biāo)準(zhǔn)按照Elmstron和Hopkins的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級[3]。

1.5 SOD、POD、CAT活性的測定

①POD活性測定方法 POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，按不同部位分別稱取根0.2 g、葉0.3 g，切碎放入研缽中，加1.5 mL pH值6.0的磷酸緩沖液，冰浴中研磨，4℃下以10 000 r/min離心15 min，取上清液待用。在光徑為1 cm的玻璃比色杯內(nèi)，先加入pH值6.0磷酸緩沖液2 mL，0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚1 mL，再加入10 μL酶液，最后加入l mL的2%H2O2迅速顛倒混勻，立即把比色杯插入比色架上。在470 nm波長下每隔30 s測定A470吸光值。每個樣品重復(fù)3次。酶活力計算：以時間為橫坐標(biāo)，A470值（重復(fù)測定的平均值）為縱坐標(biāo)，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，求出圖中所作直線（回歸方程）的斜率，即△A470/min，該斜率代表酶反應(yīng)的初速度，求出樣品中過氧化物酶活性，以△A470·min-1·g-1表示。

表1 抗性分級標(biāo)準(zhǔn)說明

表2 植株病情分類結(jié)果

②SOD酶活性測定方法 SOD酶活性測定參照鄒琦主編的《植物生理學(xué)試驗指導(dǎo)》的方法，即按試驗要求分別稱取根0.2 g、葉0.3 g，加2 mL預(yù)冷提取介質(zhì)冰浴中研磨成勻漿，加入介質(zhì)沖洗研缽，并使終體積為10 mL。取5 mL于4℃10 000 r/min離心15 min，取上清液為酶提取液。一個酶活單位定義為將NBT還原抑制到對照一半（50%）時所需的酶量。

SOD 活性=（A0-As）×VT/[A0×0.5×FW×V1]；其中：A0-照光對照管的光吸收值；As-樣品管的光吸收值；VT-樣液總體積 （mL）；V1-測定時樣品用量（mL）；FW-樣品鮮質(zhì)量（g）。

③CAT酶活性測定方法 過氧化氫酶（CAT）活性按郝再彬方法測定，各處理分別取鮮葉和根系0.8 g，加入預(yù)冷的8 mL 50 mmol/L pH值7.8的磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯聚吡咯烷酮PVPP）和少量石英砂，在冰浴上研磨成勻漿，勻漿在4℃12 000 r/min的冰凍離心機(jī)上離心15 min，上清液為粗酶提取液，然后取反應(yīng)液3 mL（2 mL 100 mmol/L pH值7.8磷酸緩沖液，1 mL 0.08%雙氧水）加入粗酶液0.1 mL，迅速搖勻后倒入石英比色皿中，以100 mmol/L pH值7.8磷酸緩沖液為空白，于波長240 nm處測定吸光值，每隔15 s讀一次數(shù)，共3 min。以每1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為一個酶活單位，用U·g-1·min-1FW表示CAT活性。

CAT 活性=△A240×酶提取液總量/（0.1×反應(yīng)吸取的酶液量×樣品鮮質(zhì)量×反應(yīng)時間）。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株病情分類

從表2可看出，野生材料的枯萎病抗性表現(xiàn)均強(qiáng)于栽培材料，其中3號野生高抗枯萎病，5號野生中抗枯萎病，1號野生、2號野生、4號野生輕抗枯萎病，對照（黑公子、廣西三號、廣西409）為感病材料。

2.2 抗病材料與感病材料苗體內(nèi)POD酶活性的動態(tài)變化

由圖1可以看出，西瓜材料間POD活性的差異在正常生長狀態(tài)下，野生材料葉片中POD活性高于栽培材料，但野生材料間葉片中POD活性差異不明顯。根系中POD活性材料間差異明顯。

圖1 接種枯萎病后西瓜苗體內(nèi)POD活性變化動態(tài)

枯萎病病菌侵染后，西瓜幼苗葉片和根系組織中POD活性明顯升高，但表現(xiàn)出不同的動態(tài)?？共〔牧先~片組織中POD活性從接種后第2天就顯著高于對照，而感病材料則表現(xiàn)出不明顯變化，到接種后第4天之后，才明顯高于對照，但其峰值明顯低于抗性材料。根系組織中POD活性在接種后第2天就有明顯變化。而黑公子，廣西三號，廣西409三個材料處理與對照之間差異不顯著，POD活性變化不明顯，野生材料POD含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，但以高抗材料3號野生西瓜表現(xiàn)最為明顯。

抗病材料與感病材料苗體內(nèi)POD酶活性的變化存在明顯差異，但5號野生表現(xiàn)不同于其他野生材料，這可能與其受到枯萎病病菌侵染后，本身自我調(diào)節(jié)能力強(qiáng)弱有關(guān)。

2.3 抗病材料與感病材料苗體內(nèi)SOD酶活性的動態(tài)變化

由圖2可以看出，所有處理的西瓜材料苗體內(nèi)SOD酶活性變化比較復(fù)雜，葉片內(nèi)SOD酶活性的變化整體上呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在苗體接種2 d后，SOD酶活性達(dá)到最高值，隨著時間的推移，SOD酶活性呈下降趨勢，但抗性材料的SOD酶活性下降緩慢，并且保持一定水平，而感病材料的SOD酶活性下降迅速，這表明感病材料在受到枯萎病病菌侵染后，活性細(xì)胞的氧化機(jī)制已被破壞，而抗性材料的自我修復(fù)調(diào)節(jié)能力高于感病材料，故表現(xiàn)比較好。

根系SOD酶活性的變化與葉片SOD酶活性變化相似，抗性材料的變化趨勢相似，且在受到枯萎病病菌侵染后，SOD酶活性迅速升高，隨著時間的推移，SOD酶活性下降明顯，所有材料的處理與對照差異均不顯著，這也說明在受到枯萎病病菌侵染后根系的氧化機(jī)制已被破壞，自我修復(fù)能力弱。

圖2 接種枯萎病后西瓜苗體內(nèi)SOD活性變化動態(tài)

2.4 抗病和感病西瓜材料苗體內(nèi)CAT酶活性的動態(tài)變化

由圖3可以看出，不論在西瓜材料的葉片還是在根系組織中，所有處理西瓜材料的苗體內(nèi)CAT酶活性差異不顯著，感病材料與對照材料相比較，CAT酶活性變化略高，但均呈現(xiàn)出由高到低下降的變化趨勢。

在受到枯萎病病菌侵染后，西瓜材料苗體葉片內(nèi)CAT酶活性立即升到最大，野生抗性材料高于感病材料。在接種后第2天，抗病材料葉片內(nèi)CAT酶活性變化基本保持不變，并且隨著侵染時間的推移，下降趨勢緩慢，而感病材料則表現(xiàn)為迅速下降，但表現(xiàn)不穩(wěn)定，在接種后第8天，西瓜感病材料苗體內(nèi)CAT酶活性達(dá)到最小值，以廣西三號表現(xiàn)最突出。

在受到枯萎病病菌侵染后，西瓜材料苗體根系組織內(nèi)CAT酶活性和葉片的相似，但是各個處理的CAT酶活性均小于葉片，且野生材料表現(xiàn)好于栽培材料，這也與前面進(jìn)行的抗性鑒定試驗結(jié)果相吻合。

圖3接種枯萎病后西瓜苗體內(nèi)CAT活性變化動態(tài)

3 小結(jié)與討論

西瓜在逆境脅迫的條件下，體內(nèi)會產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基、活性氧等，造成細(xì)胞膜的傷害，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等屬于細(xì)胞膜保護(hù)酶，在清除活性氧中有重要功能。

POD參與木質(zhì)素和植保素的合成，在植物抵抗病原物的侵入中起作用。有關(guān)過氧化物酶與植物抗病性的關(guān)系研究比較多，大多數(shù)研究結(jié)果表明，在植物與病原物互作中，不同類型的材料POD活性變化均表現(xiàn)出一定的差異，通?？共〔牧系腜OD活性水平比感病材料POD活性水平高。本研究發(fā)現(xiàn)，在西瓜枯萎病的侵染病程中，野生材料葉片組織中POD活性從接種后第2天就顯著高于對照，而感病材料則表現(xiàn)不顯著，其峰值明顯低于野生抗病材料。根系組織中POD活性在接種后第2天就有明顯變化。這一試驗結(jié)果說明POD在西瓜對枯萎病的抵抗中具有重要作用。在受枯萎病菌侵染后，抗病材料立即高效表達(dá)與POD相關(guān)的基因，合成POD及相關(guān)的酶系，因此POD的活性高峰到來得早，且峰值高、持續(xù)時間長，在宏觀上表現(xiàn)為抗病。

超氧化物歧化酶（SOD）是需氧生物中普遍存在的一種含金屬酶。它與過氧化氫酶、過氧化物酶等酶協(xié)同作用防御活性氧或其他過氧化物自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害；超氧化物歧化酶可以催化氧自由基的歧化反應(yīng)，生成過氧化氫，過氧化氫又可以被過氧化氫酶轉(zhuǎn)化成無害的分子氧和水。從結(jié)果中可以看出，在抗、感病材料中酶活性的變化及酶活性數(shù)量的增減，SOD酶和CAT酶并不相同，這說明植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除是受SOD酶和CAT酶在內(nèi)的多種酶的控制，而且不同酶間相互協(xié)調(diào)對植物的抗性反應(yīng)起著十分重要的作用。

綜合各種酶的變化規(guī)律，可以看出，在接種2 d后，POD酶、SOD酶和CAT酶活性變化，中抗材料在受到枯萎病病菌侵染后，比感病材料表現(xiàn)穩(wěn)定。輕抗材料介于二者之間，相對于中抗材料，它的酶活性變化幅度要大，相對于感病材料，它恢復(fù)正常的時間要短。這也可能是由于抗病材料能盡快地接受病菌侵染信號并迅速傳遞、及時啟動防衛(wèi)反應(yīng)的結(jié)果。

野生抗性材料在受到病原菌的侵染后，SOD酶和CAT酶活性的大小，均能在短時間內(nèi)（接菌后2 d左右）基本恢復(fù)到原來的正常狀態(tài)，而感病材料則發(fā)生恢復(fù)慢，甚至難以恢復(fù)到原來的正常狀態(tài)，這說明材料是否抗病，POD、SOD和CAT酶活性的大小固然可以作為參考，但更為重要的是應(yīng)看寄主在受到病原菌侵染后，POD、SOD和CAT酶活性能否通過自我調(diào)節(jié)而恢復(fù)到正常狀態(tài)能力的大小，有關(guān)其自我調(diào)節(jié)、維持動態(tài)平衡的抗性機(jī)制有待作進(jìn)一步的探討。

[1]王金勝.農(nóng)業(yè)生物化學(xué)技術(shù)[M].太原：山西科學(xué)技術(shù)出版社，1997.

[2]鄒琦.植物生理學(xué)實(shí)驗指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[3]Elmstron G W，Hopkins D L.Resistance of water melon cultivars toFusarium wilt[J].Plant disease，1981(65):825-827.