工業(yè)微生物代謝途徑調(diào)控的基因敲除策略

于慧敏，馬玉超

1 清華大學(xué)化工系生物化工研究所，北京 100084

2 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083

工業(yè)微生物代謝途徑調(diào)控的基因敲除策略

于慧敏1，馬玉超2

1 清華大學(xué)化工系生物化工研究所，北京 100084

2 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083

基因敲除技術(shù)是一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，在工業(yè)微生物代謝工程中具有廣泛應(yīng)用。以下從基因敲除技術(shù)的遺傳重組原理出發(fā)，總結(jié)了基因敲除策略的類(lèi)型、特征和應(yīng)用，重點(diǎn)介紹了采用線(xiàn)性雙鏈DNA的λ Red同源重組系統(tǒng)、使用環(huán)狀質(zhì)粒載體介導(dǎo)的單交換或雙交換同源重組策略以及采用轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座重組等幾種主要的基因敲除方法，進(jìn)一步展望了基因敲除技術(shù)的發(fā)展前沿和應(yīng)用前景。

基因敲除，λ Red重組系統(tǒng)，單交換和雙交換，同源重組，轉(zhuǎn)座重組

簡(jiǎn)單地說(shuō)，代謝工程就是“一種理解并利用代謝過(guò)程的方法”[3]；具體而言，代謝工程就是利用基因工程技術(shù)或其他物理、化學(xué)方法對(duì)細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行精確地修飾與改造，對(duì)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物質(zhì)的代謝流進(jìn)行擴(kuò)展、減小、阻斷或構(gòu)建新的代謝途徑，從而有目的、有理性地改變微生物原有代謝特性，改進(jìn)或者構(gòu)建新的微生物表型，并與微生物基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，提高目的代謝產(chǎn)物活性或產(chǎn)量、或合成新的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)科學(xué)[1-2]。

由于生物系統(tǒng)的復(fù)雜性以及大量生物學(xué)數(shù)據(jù)的未知性，這種以理論為基礎(chǔ)的系統(tǒng)代謝工程方法的應(yīng)用有時(shí)會(huì)受到限制。在此條件下，以基因組規(guī)模的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工具為基礎(chǔ)的反向代謝工程方法進(jìn)一步發(fā)展起來(lái)。反向代謝工程 (Inverse metabolic engineering，IME) 的概念最初由Jay Bailey于1996年提出[4]。首先，識(shí)別、構(gòu)建或計(jì)算一種目標(biāo)表型；其次，確定形成該表型的基因或環(huán)境因子；最后，通過(guò)直接的基因操作或環(huán)境調(diào)控將該表型轉(zhuǎn)而賦予其他菌株或生物體[5]。簡(jiǎn)單而言，反向代謝工程就是從表型到基因型、再?gòu)幕蛐偷奖硇偷幕蛑亟M策略。

無(wú)論是代謝工程還是反向代謝工程研究，基因敲除都是代謝途徑調(diào)控的主要方法之一?；蚯贸夹g(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，是通過(guò)一定的方法使細(xì)胞中特定的基因失活或缺失的技術(shù)。它具有定位性強(qiáng)、插入基因隨染色體 DNA穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)。利用基因敲除技術(shù)，不僅可以研究被敲除基因的生物學(xué)功能，還可以進(jìn)行功能基因的插入及染色體基因的替換，進(jìn)而可以阻斷微生物細(xì)胞的代謝旁路，減弱毒/副作用，強(qiáng)化目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量或質(zhì)量，從而成為具有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的微生物細(xì)胞工廠研究中的重要內(nèi)容。

1 基因敲除技術(shù)的基本原理

遺傳重組是指不同 DNA配對(duì)后的交換和重排過(guò)程[6]，包括同源重組、位點(diǎn)特異性重組和轉(zhuǎn)座重組 (或異常重組) 等。其中，同源重組是指兩個(gè)DNA分子之間，通過(guò)精確地相互交換片段達(dá)到序列重排的目的。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用 DNA同源重組 (Homologous recombination) 原理，利用限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶以及PCR技術(shù)等對(duì)線(xiàn)性DNA片段或質(zhì)粒等基因工程載體進(jìn)行改造，并導(dǎo)入目標(biāo)宿主中，使宿主完成對(duì)目的基因或基因簇的諸如片段缺失、插入突變、定點(diǎn)突變等一系列的修飾操作。

關(guān)于同源重組的分子機(jī)制，目前普遍接受的有3種模型，即 Holliday雙鏈侵入模型、Meselson-Radding單鏈侵入模型和 Szostak雙鏈斷裂修復(fù)模型[6-7]。其中，Holliday模型中提出的Holliday連接體 (Holliday junction) 結(jié)構(gòu)是 3個(gè)模型所共有的重組中間體。越來(lái)越多的研究證明，這 3種模型實(shí)際上是相互聯(lián)系和相互補(bǔ)充的，而雙鏈斷裂引發(fā)的同源重組是生物體內(nèi)更為普遍的遺傳現(xiàn)象[6]。

以大腸桿菌為例，大腸桿菌同源重組過(guò)程可分為 4個(gè)主要階段：起始、同源配對(duì)和鏈交換、異源雙鏈擴(kuò)展 (分支遷移) 以及 Holliday連接體的解離[6-7]。在這一過(guò)程中，至少有 25種不同的蛋白質(zhì)參與作用。其中，除最基本的 DNA解旋酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等之外，具有特殊作用的包括RecBCD、RecA、SSB、RuvAB、RuvC以及順式作用重組熱點(diǎn)χ，也叫Chi位點(diǎn)等，最重要的是RecBCD和RecA蛋白。

同源重組的起始最突出的特點(diǎn)就是單鏈 DNA的產(chǎn)生，它是同源重組的底物。RecBCD酶是一種多功能的酶，它同時(shí)具有解旋酶、外切核酸酶、單鏈內(nèi)切酶活性，并能以相當(dāng)高的頻率啟動(dòng)含有 Chi位點(diǎn)的DNA重組。Chi位點(diǎn) (5′-GCTGGTGG-3′) 天然存在于大腸桿菌的染色體DNA中，約5 kb長(zhǎng)的序列中出現(xiàn)一次。這些Chi位點(diǎn)與RecBCD酶作用，能夠促進(jìn)具有3′-OH末端的單鏈DNA的產(chǎn)生。如圖1所示，由RecA蛋白促進(jìn)的同源配對(duì)和鏈交換是同源重組的核心。RecA蛋白是單鏈結(jié)合蛋白，是同源重組過(guò)程中最重要的蛋白質(zhì)之一，它大量地結(jié)合于單鏈DNA上 (SSB蛋白輔助)，并迅速啟動(dòng)與之結(jié)合的單鏈DNA尋找同源雙鏈DNA，實(shí)現(xiàn)同源配對(duì)。該過(guò)程也稱(chēng)為聯(lián)會(huì) (Synapsis)。同源配對(duì)后，單鏈DNA便能侵入雙鏈DNA將其中的同源單鏈置換出來(lái)，自己與互補(bǔ)鏈進(jìn)行堿基配對(duì)，并產(chǎn)生D-環(huán)，最終形成 Holliday連接體；繼而產(chǎn)生異構(gòu)化，形成異源雙鏈。在RuvA、RuvB以及RuvC等蛋白的參與下，異源雙鏈的擴(kuò)展以及 Holliday連接體的解離順利完成，通常會(huì)產(chǎn)生兩側(cè)基因有交換以及兩側(cè)基因無(wú)交換這兩種結(jié)果。

圖1 大腸桿菌同源重組過(guò)程中RecBCD、RecA和SSB蛋白的功能[8]Fig. 1 Function of RecBCD, RecA and SSB during the homologous recombination in Escherichia coli[8]. RecBCD enzyme has helicase and nuclease activities. Unwinding of DNA ahead of the moving RecBCD and slower rewinding behind create single-stranded bubbles. One strand is cleaved when the enzyme encounters a Chi site, forming a single-stranded tail. RecA and SSB coat the tail and promote invasion of another DNA duplex, initiating the homologous recombination.

經(jīng)典的基因敲除策略正是利用上述同源重組基本原理，通過(guò)體外改造一定長(zhǎng)度/形式的基因，與細(xì)胞染色體上的靶基因發(fā)生同源重組 (插入或置換)，從而改變細(xì)胞的遺傳特性。

2 基因敲除策略的類(lèi)型、特征和應(yīng)用

從上述同源重組的基本原理出發(fā)，分別針對(duì)同源重組的底物類(lèi)型 (單鏈/雙鏈、線(xiàn)性/環(huán)狀)、重要蛋白 (RecA酶、RecBCD酶等及噬菌體中具有相似功能的酶) 和功能位點(diǎn) (Chi位點(diǎn)) 等進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，即可開(kāi)發(fā)出各種不同的基因敲除方法，如表 1所示。根據(jù)同源重組載體的不同，可以把基因敲除方法分為線(xiàn)性單鏈 DNA (ssDNA)、線(xiàn)性雙鏈 DNA (dsDNA) 以及環(huán)狀雙鏈DNA (質(zhì)粒載體) 等3類(lèi)。

表1 基于同源重組的基因敲除策略Table 1 Homologous recombination based gene knockout strategies

線(xiàn)性單鏈 DNA敲除策略不但打靶載體易于構(gòu)建，且其重組效率是雙鏈DNA的10~100倍[9,11]。

采用線(xiàn)性雙鏈DNA進(jìn)行同源重組，是近年來(lái)基因敲除方法的熱點(diǎn)之一。其優(yōu)點(diǎn)是可以避免較為繁瑣的基因克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建步驟，而直接采用PCR方法擴(kuò)增獲得目標(biāo)同源重組片段。然而，線(xiàn)性雙鏈DNA易于被細(xì)胞內(nèi)的RecBCD酶降解，為了解決上述問(wèn)題，可以在線(xiàn)性雙鏈DNA的兩側(cè)引入Chi位點(diǎn)，保護(hù) DNA不被 RecBCD消耗，并能強(qiáng)化RecBCD 介導(dǎo)的同源重組效率[10-11]。在應(yīng)用越來(lái)越廣泛的Red/ET重組系統(tǒng)中，Gam (γ) 蛋白的引入同樣是為了抑制宿主菌的重組蛋白R(shí)ecBCD的線(xiàn)性雙鏈DNA外切酶活性，從而協(xié)助Exo和Beta蛋白完成同源重組[14]。RecA輔助的λ Red重組則可進(jìn)一步提高重組效率[15]。

構(gòu)建環(huán)狀質(zhì)粒載體進(jìn)行目標(biāo)基因敲除的方法，是實(shí)現(xiàn)微生物基因敲除的經(jīng)典策略，主要通過(guò)微生物本身的 RecA重組系統(tǒng) (主要包括 RecA和RecBCD等蛋白) 發(fā)揮作用。RecA蛋白是單鏈結(jié)合蛋白，促進(jìn)各類(lèi)DNA分子間的同源聯(lián)會(huì)、配對(duì)、鏈交換和分支遷移。RecBCD是由RecB、RecC和RecD三個(gè)蛋白組成的復(fù)合體，它能與雙鏈切口結(jié)合使DNA鏈解開(kāi)，并在Chi位點(diǎn)形成單鏈，然后由RecA蛋白促進(jìn)同源重組。由于RecBCD具有核酸外切酶V的活性，所以線(xiàn)性DNA分子在細(xì)菌體內(nèi)會(huì)被降解。因此，必須通過(guò)環(huán)狀質(zhì)粒載體克隆來(lái)完成同源重組片段的分子設(shè)計(jì)和構(gòu)建。通常情況下，實(shí)現(xiàn)同源重組的同源臂長(zhǎng)度都在數(shù)百bp或更長(zhǎng)。插入型敲除可以通過(guò)同源單交換實(shí)現(xiàn)，而置換型敲除則需要通過(guò)同源雙交換來(lái)實(shí)現(xiàn)。在上述過(guò)程中，為了強(qiáng)化同源重組發(fā)生的效率，良好區(qū)分單交換和雙交換型重組菌株，并使發(fā)生交換后的質(zhì)粒從宿主菌中快速去除，可以采用在質(zhì)粒載體上相應(yīng)設(shè)計(jì)兩個(gè)不同的正負(fù)篩選標(biāo)記及構(gòu)建自殺型或溫度敏感型質(zhì)粒載體等策略[16-21]。

隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，位點(diǎn)特異性重組和轉(zhuǎn)座重組引起的基因插入突變也逐漸受到重視。下面就細(xì)菌、放線(xiàn)菌等工業(yè)微生物中應(yīng)用的 3種重要的基因敲除策略進(jìn)行詳細(xì)的介紹和討論。

3 幾種高效的基因敲除策略

3.1 采用線(xiàn)性雙鏈DNA的Red/ET重組系統(tǒng)

Red重組系統(tǒng)原來(lái)是屬于λ噬菌體的重組系統(tǒng)，其編碼基因exo和bet置于PL操縱子的控制之下。exo基因的產(chǎn)物Exo蛋白 (也稱(chēng)為Red α 蛋白) 是λ核酸外切酶，它可將 dsDNA的 5′端切開(kāi)，產(chǎn)生 3′突出端。bet基因編碼的β蛋白，是具有退火和鏈侵入功能的單鏈結(jié)合蛋白。當(dāng)發(fā)生同源重組時(shí)，帶有同源臂的供體 DNA分子首先經(jīng) Exo蛋白 (Red α)作用而使其兩端形成單鏈懸突；之后β蛋白形成環(huán)形結(jié)構(gòu)并結(jié)合到3′突出末端，對(duì)ssDNA進(jìn)行保護(hù)，并依靠被結(jié)合的同源臂進(jìn)行配對(duì)重組。為起到這一作用，β蛋白只需要結(jié)合35 bp的單鏈核苷酸即可。與傳統(tǒng)的大腸桿菌同源重組系統(tǒng)相比，Red α蛋白的功能類(lèi)似于RecBCD，而Red β蛋白的功能類(lèi)似于 RecA[22]。因此，Red 重組系統(tǒng)可以不依賴(lài)于RecA蛋白而完成同源重組。但是，缺失RecA不僅使重組效率下降，而且載體穩(wěn)定性也會(huì)有所下降[15]。

另外，Stewart等在 1998年還報(bào)道了一種通過(guò)在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)Rac噬菌體的RecE和RecT蛋白來(lái)介導(dǎo)同源重組的ET重組系統(tǒng)[23]。其中RecE和Red α蛋白的作用相似，RecT和Red β蛋白的作用相似，所以經(jīng)常和 Red重組一起被稱(chēng)為 Red/ET重組系統(tǒng)。

Datsenko和 Wanner等以Red重組系統(tǒng)為核心開(kāi)發(fā)了一套輔助質(zhì)?；蚯贸绦颍云渲T多優(yōu)點(diǎn)和較為廣泛的普適性被大量運(yùn)用到基因敲除的研究中[13,24]。他們運(yùn)用這套基因敲除程序在大腸桿菌中完成了 40個(gè)以上不同染色體基因的敲除而未產(chǎn)生任何差錯(cuò)。以β-xylosidase 基因yagH的敲除為例，應(yīng)用λ Red質(zhì)粒重組系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除的基本流程如圖2所示，其中，使用的輔助質(zhì)粒共有3個(gè)，一個(gè)是帶有兩個(gè) FRT片段及中間嵌入抗性片段的抗性片段模板質(zhì)粒pKD13；一個(gè)是可以表達(dá)Red重組酶的同源重組輔助質(zhì)粒 pKD46；另外一個(gè)是帶有FLP酶表達(dá)系統(tǒng)的抗性去除輔助質(zhì)粒pCP20。其中，pKD46和 pCP20輔助質(zhì)粒都是溫敏型復(fù)制子，在42℃下質(zhì)粒復(fù)制被抑制并在傳代過(guò)程中丟失。

由圖2可見(jiàn)，使用輔助質(zhì)粒的Red重組系統(tǒng)一般包括4個(gè)主要步驟。第1步，是以pKD13為模板的基因擴(kuò)增，通過(guò)PCR引物設(shè)計(jì)，引入待敲除目標(biāo)基因兩側(cè)的延伸同源序列 (約 50 bp)，獲得中間為Kan抗性基因和FRT標(biāo)記、兩側(cè)為短同源臂的線(xiàn)性同源重組片段。第 2步是核心的同源重組，包括將攜帶Red重組酶的質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)入目標(biāo)細(xì)胞、表達(dá)了Red重組酶的感受態(tài)細(xì)胞的制備、同源片段的電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入及同源重組發(fā)生等幾個(gè)關(guān)鍵步驟。其中，感受態(tài)細(xì)胞的制備一定要在阿拉伯糖誘導(dǎo)質(zhì)粒pKD46的ParaB啟動(dòng)子高效表達(dá)γ、β和α蛋白之后；而質(zhì)粒 pKD46的去除則采用 42℃熱激偶合氨芐青霉素抗性負(fù)篩選的策略。同源重組之后，Kan抗性基因即成功插入染色體，并替代原yagH基因。第3步是成功敲除目標(biāo)基因的陽(yáng)性重組子的菌落PCR篩選和驗(yàn)證。最后一步，是在陽(yáng)性重組子的細(xì)胞中轉(zhuǎn)入表達(dá)FLP重組酶的輔助質(zhì)粒pCP20，F(xiàn)LP重組酶直接作用于抗性基因外延兩端的兩個(gè)對(duì)應(yīng) FRT區(qū)(FLP的識(shí)別目標(biāo)) 并再次發(fā)生同源重組，用一個(gè)FRT片段代替原有的兩個(gè)FRT片段及中間的抗性基因，從而達(dá)到去除抗性基因的目的。質(zhì)粒pCP20的去除則同樣采用42℃熱激偶合抗生素抗性負(fù)篩選的策略。

圖2 應(yīng)用λ Red質(zhì)粒重組系統(tǒng)進(jìn)行yagH基因敲除的流程示意圖Fig. 2 Steps of yagH gene knockout using the plasmid- assistant λ Red recombination. Step 1: preparation of PCR recombination product using pKD13 as template and yagH1/yagH2 as primers. pKD13: Template plasmid. FRT: FLP recombinase recognition target. yagH1, yagH2: yagH extension primers around 50 bp. k1, k2: Kanamycin (Kan) test primers. Step 2: gene knock-out by homogeneous recombination via electroporation, transforming the purified PCR product from step 1 into competent cells of the target strain expressed the Red recombinase (Red α, β and γ proteins) by plasmid pKD46 (Amp). yagG: upstream gene of yagH in chromosome. yagI: downstream gene of yagH in chromosome. Step 3: colony PCR verification of the target recombinant with inserted Kan resistance. Primer-pairs of “Valid sense-k2” and “k1-Valid antisense” were used for target identification. Step 4: removal of the flanked Kan resistance cassette via helper plamsid pCP20 (Amp, Cm). Primer pairs of “Valid sense-k2” and “Valid sense-valid antisense” were used for target strain identification. The positive recombinant with removed Kan gene would show no band via primers “Valid sense-k2”, and 600 bp band via primers “Valid sense-valid antisense”.

這套質(zhì)粒輔助λ Red重組酶基因敲除系統(tǒng)有如下優(yōu)點(diǎn)：操作過(guò)程簡(jiǎn)便，無(wú)須構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒，直接通過(guò)線(xiàn)性片段轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)同源重組，避免了繁瑣的酶切及連接過(guò)程；可去除抗性篩選基因，用同一套抗性輔助質(zhì)粒系統(tǒng)可進(jìn)行多基因疊加敲除；只需很短的同源片段 (30~50 bp) 即可完成同源重組，節(jié)省了人力物力，尤其是在基因序列不很清楚的情況下，可根據(jù)有限的基因序列信息設(shè)計(jì)同源片段實(shí)施基因敲除；同源重組效率高，準(zhǔn)確度高。目前，這套系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大腸桿菌、痢疾桿菌、鏈霉菌等多種微生物的基因敲除中[25-26]。

3.2 使用環(huán)狀質(zhì)粒載體介導(dǎo)的同源單交換和雙交換策略

使用環(huán)狀質(zhì)粒載體進(jìn)行基因敲除的首要條件是要選擇宿主細(xì)胞的自殺質(zhì)粒載體來(lái)攜帶目標(biāo)基因的同源序列。在實(shí)施目標(biāo)基因敲除過(guò)程中，只發(fā)生一次同源重組的，稱(chēng)為同源單交換。該方法簡(jiǎn)單、易行，單交換發(fā)生后整個(gè)質(zhì)粒載體插入到目標(biāo)基因內(nèi)部，同時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)拷貝的無(wú)活性目標(biāo)基因。其示意圖如圖3A所示。

在具體實(shí)施過(guò)程中，需要注意的是構(gòu)建同源重組載體時(shí)，目標(biāo)基因片段要選擇中間一段，即不含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。一般情況下，單交換比較穩(wěn)定，回復(fù)突變的概率僅為 10?4~ 10?5/代[20]。馬玉超等利用此法成功敲除了丙烯酰胺生產(chǎn)菌株紅色紅球菌的副產(chǎn)物基因[27]。

顧名思義，同源重組雙交換就是要通過(guò)兩次單交換才能達(dá)到敲除目標(biāo)基因的目的，又分為缺失突變和插入突變兩種類(lèi)型，如圖3B和圖3C所示。缺失突變是指基因敲除后使基因組上的目標(biāo)基因缺失編碼區(qū)中的某一段而達(dá)到失活目標(biāo)基因的目的；插入突變則是指基因敲除后使基因組上的目標(biāo)基因內(nèi)部插入額外一個(gè)基因而達(dá)到目標(biāo)基因失活的目的。為了便于后期篩選雙交換重組子，額外插入的基因通常為抗生素抗性基因。

圖3 應(yīng)用環(huán)狀質(zhì)粒載體的同源單交換和雙交換策略Fig. 3 Homologous single crossover and double crossover strategies using circular plasmid vector. (A) Gene knockout by homologous single crossover. (B) Gene knockout by homologous double crossover with lost internal sequence of target gene. (C) Gene knockout by homologous double crossover with inserted SAG marker. AG: antibiotic gene. SAG: second antibiotic gene.

同源雙交換的難點(diǎn)之一是如何提高第二次同源重組的效率。針對(duì)該問(wèn)題，可以采用合適的負(fù)篩選標(biāo)記，使含載體序列的細(xì)胞對(duì)某些特殊的培養(yǎng)條件敏感，從而促進(jìn)同源重組的發(fā)生和載體序列丟失，極大地提高篩選效率。SacB是Bacillus subtilis的果聚糖蔗糖酶[28]，可轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)生果糖并合成果聚糖，在革蘭氏陰性菌中，果聚糖在細(xì)胞周質(zhì)空間大量積累，會(huì)堵塞周質(zhì)空間而使細(xì)菌致死。當(dāng)以SacB為負(fù)篩選標(biāo)記時(shí)，在添加蔗糖條件下，只有發(fā)生同源重組雙交換的細(xì)胞才能夠存活。由于較為普遍的適用性和篩選方法的簡(jiǎn)單性，許多革蘭氏陰性細(xì)菌均采用sacB基因作為負(fù)篩選標(biāo)記。另外，也有此系統(tǒng)成功應(yīng)用于革蘭氏陽(yáng)性菌的報(bào)道[29]，此系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是可以在不引入抗生素抗性的基礎(chǔ)上連續(xù)高效地敲除多個(gè)基因。

目前，除了大腸桿菌、酵母菌等一些模式菌株的遺傳轉(zhuǎn)化效率較高、方法簡(jiǎn)便外，其他一些菌株的遺傳背景不是很清楚，需要用電轉(zhuǎn)化儀才能將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞。所以，同源重組的另一個(gè)難點(diǎn)是如何用簡(jiǎn)便的方法將質(zhì)粒導(dǎo)入目標(biāo)基因的宿主細(xì)胞。針對(duì)該難點(diǎn)，研究者可以將可移動(dòng)原件mob引入載體，從而使載體能夠通過(guò)簡(jiǎn)單的細(xì)菌接合實(shí)驗(yàn)高效地導(dǎo)入細(xì)胞中。

3.3 采用轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座重組

基因轉(zhuǎn)座子 (Transposon，Tn) 是一種DNA序列單元。它能夠隨機(jī)插入到細(xì)菌染色體的許多位點(diǎn)上，使得插入位置的基因失活或突變[6-7]。轉(zhuǎn)座子能夠啟動(dòng)不同類(lèi)型的重組事件發(fā)生，還可從插入位點(diǎn)脫落下來(lái)。在脫落時(shí)，可攜帶宿主基因組的一部分DNA片段，造成基因缺失。利用該特性，轉(zhuǎn)座子被廣泛應(yīng)用于基因敲除研究中，成為改良菌種的新技術(shù)。典型的轉(zhuǎn)座子其兩端多為兩個(gè)顛倒重復(fù)序列(IS序列)，在重復(fù)序列之間有編碼抗生素的基因及轉(zhuǎn)座酶。常見(jiàn)的轉(zhuǎn)座子有 Tn5、Tn10、Tn916等。其中，Tn916具備廣泛的寄主范圍，可以應(yīng)用于多種革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌。轉(zhuǎn)座子插入后穩(wěn)定性好，不容易發(fā)生回復(fù)突變。

采用基因轉(zhuǎn)座子對(duì)目標(biāo)基因組進(jìn)行隨機(jī)敲除，構(gòu)建基因敲除突變庫(kù)，然后對(duì)目標(biāo)突變庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，獲得所需要的表型，是近來(lái)反向代謝工程的研究熱點(diǎn)之一，其示意圖如圖4所示[30]。

圖4 采用基因轉(zhuǎn)座子進(jìn)行基因組隨機(jī)敲除突變庫(kù)構(gòu)建和目標(biāo)表型篩選示意圖[30]Fig. 4 Construction of the transposon random gene knockout library and selection or screening of the target phenotype[30].

對(duì)于敲除基因的篩選與鑒定，Badarinarayana在2001年報(bào)道了一種應(yīng)用轉(zhuǎn)座子和自殺質(zhì)粒進(jìn)行基因插入敲除的新方法[31]。Hal Alper等利用類(lèi)似的方法，成功篩選并鑒定了在重組大腸桿菌中高產(chǎn)番茄紅素所必須敲除的 3個(gè)負(fù)調(diào)控基因；將這 3個(gè)基因與理論預(yù)測(cè)的 4個(gè)基因偶合起來(lái)進(jìn)行不同組合突變，獲得了64株敲除不同基因的突變株。全局最優(yōu)突變株的番茄紅素的產(chǎn)率較原始菌株提高了9倍[30]。

然而，由于轉(zhuǎn)座子自身編碼轉(zhuǎn)座酶，從而遺傳穩(wěn)定性存在問(wèn)題；轉(zhuǎn)座子片段過(guò)大，插入后對(duì)受體菌株帶來(lái)負(fù)擔(dān)，以及需要構(gòu)建自殺質(zhì)粒作為載體等問(wèn)題，近年來(lái)進(jìn)一步發(fā)展了EZ-Tn5TMInsertion Kits轉(zhuǎn)座敲除系統(tǒng)[32]。可以通過(guò)體外反應(yīng)，使得Tn5轉(zhuǎn)座酶與線(xiàn)性DNA形成聯(lián)合復(fù)合體，繼而電轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行高效的基因隨機(jī)插入敲除。線(xiàn)性DNA聯(lián)合復(fù)合體的中間部分是抗生素抗性基因，兩端各含有19 bp的反向重復(fù)序列 (ME)，是Tn5轉(zhuǎn)座酶的結(jié)合位點(diǎn)。研究表明，上述轉(zhuǎn)座體系在多種革蘭氏陰性或陽(yáng)性細(xì)菌中均適用。

采用TAIL-PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR) 方法[33]或EZ-Tn5? Insertion Kits中專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的測(cè)序定位引物，還可特異性地?cái)U(kuò)增轉(zhuǎn)座子IS序列的側(cè)翼被敲除基因，從而鑒別或發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)表型特征相關(guān)的功能基因，并構(gòu)建或重構(gòu)基因敲除前后各表型相關(guān)的代謝途徑。根據(jù)這些新的基因型和代謝途徑信息，反過(guò)來(lái)又可進(jìn)一步提出理性設(shè)計(jì)策略，構(gòu)建性能更加優(yōu)越的重組菌株。

轉(zhuǎn)座子基因敲除系統(tǒng)的缺陷是，基因插入過(guò)程基本上是隨機(jī)的，一般不能用于某一特定基因的敲除，也很難在基因組范圍內(nèi)突變所有的基因。因此，通常將轉(zhuǎn)座子突變系統(tǒng)與直接突變的方法進(jìn)行互補(bǔ)。

4 基因敲除技術(shù)的發(fā)展及展望

綜上所述，根據(jù)重組位點(diǎn)特征的不同，基因敲除技術(shù)可以分為依賴(lài)于較長(zhǎng)同源序列的同源重組、依賴(lài)于短同源序列的位點(diǎn)特異性重組以及不依賴(lài)于同源序列的轉(zhuǎn)座敲除等 3種主要類(lèi)型。其中，位點(diǎn)特異性重組主要在酵母菌等真核生物中應(yīng)用。

隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)理論的發(fā)展，新的基因敲除原理也在不斷的發(fā)掘和發(fā)現(xiàn)。最具代表性的就是RNA干擾 (RNA interference，RNAi) 技術(shù)[34]。RNAi是指通過(guò)利用短片段的雙鏈RNA促使特定基因的mRNA降解來(lái)高效、特異地阻斷特定基因的表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因沉默的表型。由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達(dá)，并且這種效應(yīng)可以傳遞到子代細(xì)胞中，所以 RNAi的反應(yīng)過(guò)程也可以用于基因敲除。到目前為止，RNAi技術(shù)作為基因沉默的工具，被研究人員廣泛應(yīng)用到真核生物細(xì)胞的功能基因組學(xué)、藥物靶點(diǎn)篩選、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路分析、疾病治療等研究領(lǐng)域[34]。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有投入少、周期短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，具有良好的發(fā)展前景。

總結(jié)了細(xì)菌、放線(xiàn)菌、酵母菌和霉菌等幾種重要工業(yè)微生物中已經(jīng)成功應(yīng)用的基因敲除策略，見(jiàn)表2。

表2 幾種重要工業(yè)微生物中成功應(yīng)用的基因敲除策略Table 2 Feasible gene knockout strategies applied in some important industrial microbes

然而，盡管基因敲除技術(shù)的原理在發(fā)展，應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但基因敲除技術(shù)始終存在著一個(gè)難以克服的缺點(diǎn)，即敲掉一個(gè)基因并不一定就能獲知該基因的功能，也不一定能夠顯著改變細(xì)胞的代謝途徑，從而獲得預(yù)期的表型。這是由于，一方面，許多基因在功能上經(jīng)常是冗余的，敲掉一個(gè)在功能上冗余的基因，并不能造成容易識(shí)別的表型，因?yàn)榛蚣易宓钠渌蓡T也可以提供同樣的功能；另一方面，對(duì)于某些必需基因，敲除后又會(huì)造成細(xì)胞的致死性，也就無(wú)法對(duì)這些必需基因進(jìn)行相應(yīng)的研究了。此外，對(duì)于一個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物合成的代謝途徑，產(chǎn)物 (或副產(chǎn)物) 的增多 (或減少) 通常需要眾多基因的協(xié)同作用，只針對(duì)單個(gè)基因的敲除研究有時(shí)不容易獲得很好的結(jié)果。

針對(duì)這一現(xiàn)象，Hal Alper等提出了全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程 (Global transcriptional machinery engineering，gTME) 的新思路[49-51]。以基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器——RNA聚合酶 (RNA polymerase，RNAP) 為對(duì)象，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)眾多不同基因的轉(zhuǎn)錄抑制、轉(zhuǎn)錄強(qiáng)化以及轉(zhuǎn)錄不變，進(jìn)而在細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)目標(biāo)表型的全局優(yōu)化。

2009年，Wang等進(jìn)一步報(bào)道了運(yùn)用多元自動(dòng)基因組工程 (Multiplex automated genome engineering，MAGE) 加速進(jìn)化重組細(xì)胞的新方法[52]。他們通過(guò)λ-Red β蛋白輔助重組，在單鏈寡核苷酸中大規(guī)模引入番茄紅素合成途徑的 24個(gè)目標(biāo)基因的插入和敲除突變，建立了多元復(fù)合基因突變庫(kù)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)的同時(shí)定位、突變。進(jìn)而通過(guò)自動(dòng)化裝置的設(shè)計(jì)和構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞代謝途徑的連續(xù)、自動(dòng)控制改造。在3 d之內(nèi)，Wang等就篩選得到了番茄紅素產(chǎn)量提高5倍的重組突變株。

綜上所述，微生物基因敲除技術(shù)是遺傳工程研究的重大飛躍之一。它為定向改造細(xì)菌、放線(xiàn)菌、酵母菌、霉菌等工業(yè)微生物、培育微生物新品種提供了重要的技術(shù)支持。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)以及各種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的日益進(jìn)步，基因敲除技術(shù)作為一種強(qiáng)而有力的工具，必將繼續(xù)在生物能源、生物材料、生物法化學(xué)品以及環(huán)境保護(hù)等重要領(lǐng)域作出重大貢獻(xiàn)。

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Gene knockout strategies for metabolic pathway regulation in industrial microbes

Huimin Yu1, and Yuchao Ma2

1 Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China
2 College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

Gene knockout, an important technology in molecular biology, has been broadly applied in industrial microbial metabolic engineering. From the basic mechanism of DNA recombination, we summarized and compared in this review different gene knockout strategies. Three most hot and important approaches, including the λ Red recombination system using the linear dsDNA as recombination substrate, the single or double crossover homologous recombination using the circular plasmid DNA as substrate, and the transposase mediated transposition recombination, were summarized in detail. Developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.

gene knockout, λ Red recombination system, single or double crossover, homologous recombination, transposition recombination

生命的代謝活動(dòng)是通過(guò)活細(xì)胞和細(xì)胞群的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行的，后者由一系列酶催化反應(yīng)以及特異性的膜轉(zhuǎn)移系統(tǒng)構(gòu)成。然而，細(xì)胞自身固有的這種代謝網(wǎng)絡(luò)相對(duì)于實(shí)際應(yīng)用而言，其遺傳特性通常并非最佳，這就需要對(duì)細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行有目的的修飾與調(diào)控。1991年，Bailey和Stephanopoulos在Science上分別發(fā)表重要文章[1-2]，提出了“Metabolic Engineering”的概念，綜述了代謝工程的應(yīng)用實(shí)例，指出了存在的問(wèn)題及發(fā)展的方向，被認(rèn)為是代謝工程向一門(mén)系統(tǒng)的學(xué)科發(fā)展的起點(diǎn)。

May 11, 2010; Accepted: August 2, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program (863 Program) (No. 2007AA02Z201), National Basic Research Program (973 Program) (No. 2007CB714304), National Natural Science Foundation of China (No. 20976094).

Huimin Yu. Tel: +86-10-62795492; E-mail: yuhm@tsinghua.edu.cn

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2007AA02Z201)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2007CB714304)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 20976094) 資助。