周圍神經(jīng)損傷后軸突再生的分子機(jī)制研究進(jìn)展

高潔,劉良明,伍亞民

周圍神經(jīng)是連接中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周靶組織器官信號通路的中介結(jié)構(gòu)。周圍神經(jīng)損傷后,表現(xiàn)為神經(jīng)元胞體的改變、神經(jīng)纖維變性和微環(huán)境的改變,及靶組織器官的潰變。在損傷信號的傳遞中涉及損傷信號快速傳導(dǎo),并有相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、黏附分子、生長相關(guān)蛋白以及軸突再生的結(jié)構(gòu)成分反應(yīng)。成年哺乳動物的周圍神經(jīng)表現(xiàn)出旺盛的再生能力,而中樞軸突損傷,無論其胞體是否在中樞,一般情況下皆無法再生。從神經(jīng)的發(fā)育看,神經(jīng)軸突沿特定的路徑延伸,到達(dá)將與它建立突觸聯(lián)系的靶細(xì)胞的胞體、樹突或軸突。在神經(jīng)突起末端存在一個扇形結(jié)構(gòu)——生長錐(axonal growth cone),它表面的受體能選擇性識別胞外環(huán)境中的導(dǎo)向信號,經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制引起自身的伸展和回縮反應(yīng),從而指導(dǎo)軸突生長[1-3]。當(dāng)周圍神經(jīng)損傷后,神經(jīng)纖維和周圍結(jié)締組織發(fā)生損傷反應(yīng),相應(yīng)神經(jīng)元依次發(fā)生神經(jīng)元胞體腫脹,尼氏體消失,細(xì)胞核偏移,突觸終端減少;遠(yuǎn)端軸突和靶組織器官發(fā)生華勒氏(Waller)變性而崩解,施萬細(xì)胞增殖,胞體軸突產(chǎn)生生長錐,開始在多因素調(diào)控下的再生過程。破解軸突再生障礙的分子、細(xì)胞機(jī)理業(yè)已成為近來神經(jīng)再生研究的重點(diǎn)。目前認(rèn)為,決定周圍神經(jīng)軸突再生的策略主要包括:①神經(jīng)軸突變性和再生信號通路的調(diào)控;②神經(jīng)再生微環(huán)境的維持;③神經(jīng)元軸突結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。

1 周圍神經(jīng)損傷后的軸突反應(yīng)及信號通路

周圍神經(jīng)損傷后,損傷神經(jīng)局部主要產(chǎn)生3種明顯的反應(yīng)。

1.1 神經(jīng)支配靶器官的逆行性傳導(dǎo)受阻 神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子之一,從周圍逆向運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體。坐骨神經(jīng)損傷去軸突后,逆向運(yùn)輸減少到近1/10,雖然持續(xù)時間僅為48 h,呈3倍性減少并一直持續(xù)到再生發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)室在研究大鼠坐骨神經(jīng)損傷時發(fā)現(xiàn),聯(lián)合應(yīng)用NGF和睫狀神經(jīng)生長因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)營養(yǎng)支持,對周圍神經(jīng)的軸漿運(yùn)輸功能的恢復(fù)優(yōu)于NGF[4-5]。通過特異性抗體限制NGF內(nèi)在活性可導(dǎo)致去軸突樣變化;其他如 c-jun,神經(jīng)肽,包括 galanin、血管活化性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)和神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)等[6]也有類似作用。

1.2 施萬細(xì)胞、炎性反應(yīng)的分泌介質(zhì)改變微環(huán)境 損傷軸突和靶組織及周圍非神經(jīng)細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)含有眾多神經(jīng)生長誘導(dǎo)和營養(yǎng)分子,包括CNTF、神經(jīng)營養(yǎng)素3(neurotrophin-3,NT-3)以及成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors,FGFs)皆可于損傷后分泌。CN TF和核轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription-3,STAT3),即活化后CNTF受體的下游靶點(diǎn),都有廣泛的信號調(diào)控作用。STAT3剔除可以增強(qiáng)傷后細(xì)胞死亡,提示STAT3具有神經(jīng)營養(yǎng)性作用。敲除CNTF可延遲STAT3的磷酸化和神經(jīng)細(xì)胞核轉(zhuǎn)位[7]。施萬細(xì)胞受損釋放CNTF,并作用于鄰近軸突局部,STAT軸突內(nèi)磷酸化并逆向運(yùn)輸至損傷神經(jīng)元胞體。后期,軸突損傷后白細(xì)胞募集,炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生和鄰近非神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子、趨化因子、胞外大分子和合成蛋白水解酶,損害軸突致胞外環(huán)境改變。繼而是胞內(nèi)信號分子活化,特別是控制細(xì)胞周期、分化、軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)分子和細(xì)胞骨架成分合成,及各種生長因子和細(xì)胞因子的分泌,此外,還有調(diào)控能量、氨基酸和脂質(zhì)代謝的分子[8-10]。

1.3 細(xì)胞電位平衡改變 損傷信號源相互協(xié)同或者分別作用活化核定位信號(nuclear localization signal,NLS)序列的軸漿蛋白,引發(fā)創(chuàng)傷信號擴(kuò)布[11-13]。

除上述損傷神經(jīng)局部發(fā)生病理反應(yīng)外,相應(yīng)的神經(jīng)元會發(fā)生跨突觸的變性,主要表現(xiàn)為神經(jīng)元的變性壞死和/或凋亡。有研究證實(shí),損傷神經(jīng)細(xì)胞可出現(xiàn)包括fas和腫瘤壞死因子受體1和2(tumor necrosis factor receptors 1,2,TNFR-1,2)。除了TNFR-2,受體攜帶一種胞漿死亡區(qū)域,這種區(qū)域可以通過fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)蛋白(fas-assocaiated protein domain,FADD)釋放一種促凋亡信號。調(diào)控FADD可通過fas和TNFR去除后的細(xì)胞死亡信號。此外,實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn),敲除Bax或抑制細(xì)胞凋亡蛋白酶3(caspase-3)或者caspases整個家族,可以阻止細(xì)胞死亡,多種caspase抑制因子中唯caspase-3作用強(qiáng)而持久。盡管目前的研究還有爭議,但總體而言,TNF及其受體、促凋亡的caspase-3等因素對周圍神經(jīng)損傷后的跨神經(jīng)元變性壞死和/或凋亡具有重要作用。下位靶組織器官也發(fā)生相應(yīng)的潰變,一般認(rèn)為,其機(jī)制與此類似。

軸突損傷后,除產(chǎn)生上述變性反應(yīng)外,隨后也產(chǎn)生再生性改變,在形態(tài)上表現(xiàn)為生長錐的形成,相應(yīng)神經(jīng)元胞體及近端軸突合成代謝增強(qiáng),如多胺生成酶(鳥氨酸谷胺酰轉(zhuǎn)胺脫羧酶)暫時上調(diào),從而使腐胺、精胺、亞精胺促進(jìn)在體和離體軸突生長[14]。絲裂原活化蛋白(mitogen-associated protein,M AP)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)級聯(lián)反應(yīng)抑制 Raf、Ras、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-associated protein kinase kinase,MEK)、胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase 1,2,Erk1,2)等信號分子均參與了上述再生性反應(yīng)[15],Ras/Raf/MEK-PI3K信號通路被認(rèn)為具有十分重要作用[16-17]。無論周圍神經(jīng)損傷引起的變性改變還是隨后的再生性反應(yīng),都離不開神經(jīng)元相應(yīng)的基因表達(dá)變化,目前認(rèn)為其最終影響核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及活性,包括轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化和核轉(zhuǎn)位,這些轉(zhuǎn)錄因子主要包括 c-jun、junD、激活性轉(zhuǎn)錄因子 2、3(activating transcription factor,ATF)、P311、Sox11、STAT3 以及 islet-1、核因子κ B等,可能存在調(diào)控再生神經(jīng)元基因表達(dá)的開關(guān)信號[18]。

2 周圍神經(jīng)軸突的再生微環(huán)境及重要調(diào)控分子

正常神經(jīng)元胞體及其軸突結(jié)構(gòu)和功能由穩(wěn)定的微環(huán)境來保障和維持。神經(jīng)損傷后,周圍神經(jīng)纖維內(nèi)環(huán)境隨之變化,各種局部因素,包括神經(jīng)膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等重要的細(xì)胞成分,以及由各種細(xì)胞表達(dá)和分泌的眾多具有生物活性分子炎性介質(zhì)、黏附分子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等對軸突再生、趨化生長、髓鞘再形成和突觸重建調(diào)控具有一定作用。

2.1 炎性分子 軸突損傷后,神經(jīng)遠(yuǎn)端和損傷神經(jīng)元胞體周圍發(fā)生急性炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為以白細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞遷入,以協(xié)助清除胞體周圍變性壞死的施萬細(xì)胞及髓鞘碎片。這些局灶性炎癥細(xì)胞很快被激活,移入后直接接觸胞體,與監(jiān)測損傷神經(jīng)組織的T細(xì)胞相互作用。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)缺乏導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞增生以及早期淋巴細(xì)胞重新募集減少,但不影響軸突再生速度;同樣,基因變異小鼠軸突損傷后,敲除神經(jīng)營養(yǎng)因子受體P75NTR或者含SH結(jié)合域的酪氨酸蛋白磷酸化酶(SH-domain-containing protein tyrosine phosphates,SHP-1)可見炎性反應(yīng)增強(qiáng),無神經(jīng)再生現(xiàn)象[19]。然而,一些研究顯示輕度正相關(guān)。

白細(xì)胞介素(IL)-6基因敲除明顯減少運(yùn)動神經(jīng)元去軸突后的炎癥反應(yīng),但也引起軸突再生速度的輕度下降。IL-6和其受體聯(lián)合過度表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)再生增強(qiáng);反之,面神經(jīng)壓迫性損傷時,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)測定發(fā)現(xiàn),遺傳性IL-6基因缺乏導(dǎo)致軸突再生速度減少15%,與坐骨神經(jīng)壓迫損傷后的功能性行走實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果類似[14]。與周圍神經(jīng)系統(tǒng)相比,IL-6對中樞的作用爭議很大。IL-6缺乏被認(rèn)為可減少面運(yùn)動核損傷模型中膠質(zhì)疤痕形成,提高中樞軸突發(fā)芽;可加快脊髓損傷后的功能恢復(fù),但條件性損傷誘導(dǎo)的脊髓軸突再生下降。這些研究提示,由炎性細(xì)胞和炎性因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)損傷后的再生微環(huán)境的調(diào)控可能具有不同的作用及不同的分子機(jī)制。

2.2 黏附分子 在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中,細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecule,CAM)是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互識別、黏附和信號傳導(dǎo)的重要信號分子。最近的在體研究比較關(guān)注層粘連蛋白α 7β1整合素受體和半乳糖凝集素(galectin)的作用。研究顯示,敲除編碼α 7整合素亞單位基因?qū)е旅嫔窠?jīng)軸突切割后運(yùn)動軸突再生速度下降及周圍神經(jīng)靶點(diǎn)重新支配約40%。同樣,jun基因缺陷小鼠損傷后,α 7并不上調(diào),這似乎與這些動物軸突再生反應(yīng)較弱有關(guān)。缺乏層粘連蛋白,即α 7整合素的配體會產(chǎn)生同樣但更顯著而持久的作用。γ 1層粘連蛋白鏈細(xì)胞的特異基因缺乏,即周圍神經(jīng)施萬細(xì)胞中α、β、γ三聯(lián)體必要成分的缺乏,導(dǎo)致坐骨神經(jīng)壓迫損害后進(jìn)入末梢神經(jīng)軸突的成分大量減少,持續(xù) 30 d;而α 7缺陷動物末梢神經(jīng)軸突成分呈暫時性缺少。研究還注意到,α 7缺陷小鼠神經(jīng)損傷后,β整合素上調(diào)非常顯著,與中樞軸突發(fā)芽明顯增長相對應(yīng)。損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)軸突發(fā)芽后,細(xì)胞黏附分子如免疫球蛋白超家族成員 L1(l immunoglobulin-1,L1)和其高同源體(close homologue of L1,CHL1)與β 1整合素功能相關(guān)[20],而且可能與α 7缺陷小鼠在損傷中作用相同。

各種黏附分子包括整合素、半乳糖凝集素/CD46、67 kDa層粘連蛋白受體、細(xì)胞外基質(zhì)受體α-dystroglycan(α-DG)1,4半乳糖轉(zhuǎn)化酶可能作為不同受體的配體過量表達(dá)。比如應(yīng)用外源性galetin-1可以提高神經(jīng)突生長速度;以抗體中和內(nèi)源性galetin使其失效或者基因敲除降低速度。氧化型galetin-1也可刺激施萬細(xì)胞由近端向遠(yuǎn)處殘端遷移,輔助橋接細(xì)胞,促進(jìn)軸突向損傷神經(jīng)末梢長入[21],提示其可能在周圍神經(jīng)損傷后的軸突的生長、突觸的可塑性、神經(jīng)纖維的成束發(fā)揮有意義的作用。

2.3 神經(jīng)營養(yǎng)因子 很多研究已表明神經(jīng)營養(yǎng)因子有一定的保護(hù)作用[22]。但也有一些研究證實(shí),應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子減少細(xì)胞存活。王永堂注意到,NGF毒性作用依賴于普通神經(jīng)營養(yǎng)因子受體P75NTR。同樣,P75NTR的毒性作用也見于坐骨神經(jīng)軸突再生[19],但未見于面運(yùn)動神經(jīng)。應(yīng)用不同神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子和細(xì)胞因子已顯示出促進(jìn)軸突跨越斷端空間的遠(yuǎn)端和近端軸突生長。

影響神經(jīng)末梢軸突再生速度主要是3組因子:①胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1);②神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors,NTFs),包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)超家族成員、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial-cell derived neurotrophic factor,GDNF);③白血病抑制因子(LIF)。應(yīng)用增強(qiáng)型外源性生長因子IGF-1、IGF-2和抗體可減少軸突再生速度。我們課題組觀察到,大鼠坐骨神經(jīng)損傷后以IGF-1配合幾丁糖,傷后1個月治療組感覺功能恢復(fù)明顯(實(shí)驗(yàn)資料整理中)。文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)BDNF和GDNF在周圍神經(jīng)損傷末梢被活躍誘導(dǎo)時,去軸突的神經(jīng)元受體表達(dá)隨著慢性離斷過程逐漸減少。應(yīng)用BDNF和GDNF不能使損傷后軸突很快再生,卻可提高損傷后慢性去軸突的運(yùn)動神經(jīng)元軸突再生,BDNF/GDNF量如果不足可能導(dǎo)致慢性去軸突效應(yīng)[23]。抑制內(nèi)源性BDNF和GDNF也減少軸突損傷后周圍神經(jīng)再生。

3 神經(jīng)元軸突再生骨架結(jié)構(gòu)的重建

細(xì)胞骨架成分的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)是神經(jīng)生長錐形成和延伸的重要條件。神經(jīng)損傷后再生也面臨骨架成分的變化,軸突完全再生常伴隨大量功能各異的分子家族出現(xiàn),以調(diào)控細(xì)胞表面相互作用。生長相關(guān)蛋白43(growth associated protein-43,GAP-43)、丙氨酸烷化C激酶基質(zhì)(myristoylated alanine rich C kinase substrate,ARCKS)、皮質(zhì)細(xì)胞骨架伴隨蛋白 23(cortical cytoskeleton-associated protein,CAP-23)與磷酸共同分布于細(xì)胞表面的raft區(qū)域。這些分子結(jié)構(gòu)多變,只結(jié)合于磷脂酸如PI-(4,5)-P2、鈣/鈣調(diào)節(jié)蛋白、蛋白激酶C和肌絲蛋白,并調(diào)節(jié)raft重新募集信號分子如非受體類酪氨酸激酶(sarcoma kinase,Src),調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架聚合、再分布和降解。鈣調(diào)節(jié)蛋白含鈣和不含鈣成分與上述分子相互作用,對于受體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流調(diào)控生長錐的活性有重要的連接作用;以尼莫地平抑制鈣內(nèi)流可明顯增加軸突再生。神經(jīng)損傷后,微管降解分子如SCG10、微管調(diào)控蛋白 stathmin、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白3(retinoblastoma protein-3,RB3)和相關(guān)配合物皆是生長錐發(fā)育相關(guān)蛋白[22],例如萎陷反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白-2(collapsin response protein-2,CRMP-2),形成第2個軸突適應(yīng)分子微管靶向群,在神經(jīng)損傷后表達(dá)上調(diào)。CRMP-2神經(jīng)過度表達(dá)可改善軸突再生[9]。微管相關(guān)蛋白1b(microtubule associated protein 1b,MAP1b)業(yè)已證實(shí)可直接介導(dǎo)感覺神經(jīng)元再生時定向性生長錐遷移和軸突分枝。

在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、動力學(xué)和細(xì)胞黏附等方面需要關(guān)注Rho GTP酶,其主要成員為 RhoA、Rac、Cdc42和 TC10,可作為分子開關(guān)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架再生構(gòu)建[3]。GTP酶的活化是由與細(xì)胞表面受體連接的適應(yīng)分子,如導(dǎo)向遷移分子slit-robo GTP酶活化酶蛋白 2介導(dǎo)。軸突損傷致 RhoA、Rac、Cdc42輕度上調(diào)和TC10的大幅增加。在體RhoA抑制激發(fā)中樞無軸突再生的正常誘導(dǎo)過程[1,4]。周期素依賴性激酶抑制劑 P21(Cip1/WAF1)與Rho激酶結(jié)合為復(fù)合體并抑制其活性,也促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生和功能恢復(fù)。促進(jìn)P21表達(dá)的分子如核蛋白P311,也促進(jìn)損傷運(yùn)動神經(jīng)再生,加速周圍神經(jīng)靶點(diǎn)再分布[9]。并非每個周期素依賴性激酶都抑制再生,可能存在周圍神經(jīng)損傷病灶軸突再生延長的屏障。

4 結(jié)論

研究周圍神經(jīng)損傷后的損傷反應(yīng)和成功再生反應(yīng)的信號分子,重點(diǎn)探討相關(guān)信號通路及其調(diào)控機(jī)制,將有助于揭示促進(jìn)軸突再生的內(nèi)源性分子作用機(jī)制。目前開展的關(guān)于P75NTR和神經(jīng)營養(yǎng)分子的系列研究結(jié)果提示,從分子信號通路入手有可能幫助我們解析修復(fù)損傷的周圍神經(jīng)乃至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜過程。

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