結(jié)節(jié)性硬化癥基因研究發(fā)展?fàn)顟B(tài)綜述

吳貴賢 崔茂榮 張小德 徐躍文 陳 釗 張學(xué)剛 李 翔

曲靖市第一人民醫(yī)院泌尿外科（655000）

結(jié)節(jié)性硬化癥（tuberous sclerosis，TSC）是以錯(cuò)構(gòu)瘤為主要表現(xiàn)的累及多個(gè)系統(tǒng)和器官的常染色體顯性遺傳性疾病。TSC1和TSC2兩個(gè)腫瘤抑制基因是該病的致病基因，TSC基因除了通過(guò)TSC-Rheb—-TORS6K1/4EBP1途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖外還參與了細(xì)胞黏附、細(xì)胞內(nèi)吞等重要的生物學(xué)功能，其功能除了與TSC綜合征密切相關(guān)外，在其他散發(fā)性腫瘤中的作用也受到越來(lái)越多的重視。調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、表達(dá)產(chǎn)物、TSC 基因具有腫瘤抑制性、TSC蛋白活性的調(diào)節(jié)等。目前以特異性抑制mTOR為主要作用原理的藥物已進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)，TSC基因也有望作為腫瘤發(fā)生和治療研究的新的靶分子。

1 TSC1、TSC2特性

TSC 是以錯(cuò)構(gòu)瘤為主要表現(xiàn)的累及多個(gè)系統(tǒng)和器官的常染色體顯性遺傳性疾病。TSC1和TSC2兩個(gè)腫瘤抑制基因是該病的致病基因。TSC基因含有23個(gè)外顯子，第1、2外顯子不具有編碼功能，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為相對(duì)分子質(zhì)量為8.6的mRNA，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為130×103、由1164個(gè)氨基酸組成的錯(cuò)構(gòu)瘤蛋白。TSC2基因含有41個(gè)編碼外顯子和1個(gè)無(wú)編碼意義的引導(dǎo)外顯子，轉(zhuǎn)錄為相對(duì)分子質(zhì)量為5.5的mRNA，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為190×103，由1807個(gè)氨基酸組成的馬鈴薯球蛋白（tuberin）。上述兩種蛋白可形成一種復(fù)合體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、黏附及囊泡運(yùn)輸?shù)萚1]。Jones等[2]發(fā)現(xiàn)80%的TSC患者可以檢測(cè)到突變，且大部分突變發(fā)生在TSC2基因上，約占總突變檢出率的82%。姚鳳嗚等[3]采用直接測(cè)序法對(duì)2例漢族TSC 患者（一為家系，一為散發(fā)）進(jìn)行突變篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了TSC2基因的1個(gè)無(wú)義突變c.1372 C＞T（p.R458x）和1個(gè)移碼突變5238-5255 del 18bpCATCAAGCGGCTCCGCCA。無(wú)義突變c.1372 C＞T（p.R458X）發(fā)生在TSC2基因第13號(hào)外顯子上，導(dǎo)致TSC2基因翻譯第458位氨基酸蛋白產(chǎn)物時(shí)提前出現(xiàn)終止密碼子，形成1個(gè)截?cái)嗟鞍?。馬鈴薯球蛋白（tuberin）包含7個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，從N端到C端依次為：亮氨酸拉鏈區(qū)（1eucine zipper domain，LZD）、CCD1、CCD2、TAD1、GAPD、TAD2、鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)（calmodulin-binding domain，CaMD）。本突變恰位于馬鈴薯球蛋白CCD1和CCD2兩功能區(qū)之間，導(dǎo)致CCD2、TAD1、GAPD、TAD2和CaMD 5個(gè)功能結(jié)構(gòu)域的丟失，這是導(dǎo)致該患者臨床表型的主要原因。Rose等[4]曾通過(guò)單鏈構(gòu)象分析法檢測(cè)到相同的突變，但在中國(guó)漢族人中屬首次報(bào)道。移碼突變5238-5255 del 18bp CATCAAGCGGCTCCGCCA 1746 del HIKRLR位于TSC2基因40號(hào)外顯子上，Beauchamp等[5]曾于1998年報(bào)道過(guò)此突變，國(guó)內(nèi)也有報(bào)道。該突變位于馬鈴薯球蛋白鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)CaMD。Noonan等[6]研究顯示，CaMD是馬鈴薯球蛋白調(diào)節(jié)甾體激素受體所必需的結(jié)構(gòu)，故發(fā)生于該區(qū)域的突變可能參與了該疾病的發(fā)生。TSC是一種表型多樣的疾病，Dabora等[7]均曾經(jīng)對(duì)224名TSC患者進(jìn)行突變檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TSC2基因發(fā)生突變的患者其臨床表現(xiàn)更嚴(yán)重，較易發(fā)生智力發(fā)育遲緩、癲癇、面部血管纖維瘤及視網(wǎng)膜錯(cuò)構(gòu)瘤等。Zhao等[8]對(duì)國(guó)內(nèi)報(bào)道的20個(gè)TSC基因突變報(bào)道進(jìn)行分析，也支持上述觀點(diǎn)。姚鳳嗚等[3]通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)及DNA直接測(cè)序的方法對(duì)中國(guó)漢族人群中2例TSC患者進(jìn)行突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1個(gè)無(wú)義突變和1個(gè)移碼突變，表明TSC2基因突變是中國(guó)TSC患者的分子發(fā)病機(jī)制，為該病患者進(jìn)行產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢以及進(jìn)一步的蛋白功能學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

2 TSC 的遺傳異質(zhì)性

TSC1 基因定位于第9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上（9q34），與AKI和ABO血型基因有連鎖關(guān)系，其蛋白產(chǎn)物被稱為hamartin[9]，TSC2 基因定位于第16號(hào)染色體短臂上（16p13.3），與Ⅰ型多囊腎（PKD）基因近端的DNA標(biāo)記有連鎖，其蛋白產(chǎn)物被稱為tuberin。由于TSC有遺傳異質(zhì)性，故由2個(gè)不同基因型引起的臨床表現(xiàn)是否一致值得進(jìn)一步研究。在某些情況下，遺傳異質(zhì)性有助于解釋諸如多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤等臨床的不同形式。然而，除了鄰近基因缺失綜合征，TSC1和TSC2基因異常都可引起所有的TSC并發(fā)癥，由這2個(gè)基因或特異性突變引起的表現(xiàn)型也許有輕微的不同。有證據(jù)表明，TSC2突變引起的疾病較TSC1更嚴(yán)重，但這一點(diǎn)仍需要進(jìn)一步證實(shí)[10]。最近有研究發(fā)現(xiàn)hamartin和tuberin的細(xì)胞內(nèi)作用途徑相同，因此認(rèn)為兩者的臨床表現(xiàn)無(wú)明顯差異[11]。

3 基因的功能

已知TSC 的兩個(gè)基因都是抑癌基因，它們的功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。當(dāng)兩個(gè)基因發(fā)生突變時(shí)，它們對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)失控，致使腫瘤形成。一些TSC的錯(cuò)構(gòu)瘤患者顯示了雜合性的丟失，TSC患者中9q34或16p13的標(biāo)記是雜合性的，但在腫瘤中則是純合性的[12,13]。雜合性的丟失說(shuō)明TSC患者通過(guò)遺傳或胚胎早期的基因突變?cè)斐?個(gè)基因復(fù)本的缺失，且僅在以前正常的復(fù)本有1個(gè)體細(xì)胞的突變時(shí)才會(huì)發(fā)病。最近對(duì)Eker小鼠（TSC動(dòng)物模型） 和turbin 蛋白細(xì)胞內(nèi)功能的研究進(jìn)一步支持了腫瘤抑制假說(shuō)。Eker小鼠在TSC2基因有一個(gè)突變時(shí)，可發(fā)生顯性遺傳的腎細(xì)胞癌、室管膜下和皮質(zhì)下錯(cuò)構(gòu)瘤。重新誘導(dǎo)一個(gè)野生型TSC2基因可抑制該模型中腎腫瘤的發(fā)展[14]。同源性序列研究發(fā)現(xiàn)tuberin和GTP酶激活蛋白GAP3具有部分同源性[15]，已知GTP酶參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的調(diào)節(jié)，因此認(rèn)為tuberin也許有調(diào)節(jié)這一活性的作用。

4 TSC的鄰近基因缺失

多囊腎在TSC 中較常見(jiàn)，其發(fā)病與TSC1和TSC2基因有關(guān)。一些多囊腎病發(fā)病較早，臨床癥狀較重，多由一個(gè)鄰近基因缺失所致，同時(shí)影響TSC2和PKD1基因[16]。對(duì)診斷TSC 的患兒若懷疑合并多囊腎，應(yīng)進(jìn)行雙腎超聲檢查。

5 TSC的鑲嵌性

TSC2和PKD1鄰近基因缺失的患者其臨床表現(xiàn)較輕，這是由于他們的鄰近基因缺失是體細(xì)胞鑲嵌體的，即體細(xì)胞后天自發(fā)的突變。體細(xì)胞鑲嵌體有兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞系，但只有2個(gè)等位均發(fā)生突變的細(xì)胞系，才會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)和分化的紊亂。體細(xì)胞鑲嵌體在伴有或不伴有鄰近TSC2-PKD1 綜合征的TSC1和TSC2患者都被報(bào)道過(guò)[17,18]。鑲嵌型疾病的病情程度差異很大，有的也可以很嚴(yán)重。一般情況下，如果細(xì)胞系的異常被確定在性腺（性腺鑲嵌體），那么表現(xiàn)型正常的父母所生子女受影響的危險(xiǎn)性就較高，但在TSC 時(shí)并不發(fā)生這種情況，研究證實(shí)父母未受影響?zhàn)B育一個(gè)TSC小兒后，下一胎受影響的風(fēng)險(xiǎn)率僅為2%～3%[19]。

6 TSC蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)

當(dāng)細(xì)胞環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，tuberin被磷酸化，改變對(duì)mTOR的抑制作用。參與tuberin磷酸化的信號(hào)通路主要包括PI3K/Akt、ERK/RSK1、LKB1-AMPK等。在有絲分裂期間，PI3K/Akt磷酸化tuberin，降低其GAP活性，負(fù)性調(diào)節(jié)hamartin/tuberin復(fù)合體的腫瘤抑制功能[20]。最近發(fā)現(xiàn)ERK（extracellular signa1-regulated kinase）活化靶基因RSK1后能夠結(jié)合并磷酸化tuberin，抑制其功能[21]，ERK也可通過(guò)直接磷酸化tuberin特異的氨基酸位點(diǎn)如s664位點(diǎn)，導(dǎo)致hamartin/tuberin解離，大大消弱tuberin抑制mTOR信號(hào)、細(xì)胞增生和細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)化的能力，參與腫瘤的形成[22]。此外還存在一個(gè)正性調(diào)節(jié)TSC2的磷酸化機(jī)制，LKB1是Peutz-Jeghers綜合征中發(fā)生突變的腫瘤抑制基因，可以磷酸化細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)感受器AMP依賴蛋白激酶（AMP dependent protein kinase，AMPK）進(jìn)而磷酸化激活tuberin，增強(qiáng)hamartin/tuberin復(fù)合體的GAP活性，抑制Rheb依賴的mTOR活性[23]。

7 TSC蛋白的泛素化調(diào)節(jié)

許多細(xì)胞內(nèi)的蛋白被泛素化降解，其共同特點(diǎn)是存在一個(gè)PEST元件，序列研究發(fā)現(xiàn)tuberin也存在PEST元件。Benvenuto等[24]發(fā)現(xiàn)hamartin與tuberin的結(jié)合可使其免受泛素化。hamartin也可被泛素化，但是程度較小，可以通過(guò)與tuberin共表達(dá)保持穩(wěn)定。Pam是神經(jīng)元特異性蛋白，能夠調(diào)節(jié)突觸的生長(zhǎng)，其末端包含一個(gè)與tuberin結(jié)合的RING鋅指結(jié)構(gòu)域，可能通過(guò)該結(jié)構(gòu)域作為E3泛素化連接酶，與tuberin相互作用，調(diào)整hamartin/tuberin復(fù)合物被泛素化降解的過(guò)程[25]。HERC1（HECTdomain and RCC1 domain）屬于E1泛素化連接酶，可以與tuberin相互作用，hamartin/tuberin復(fù)合體的形成可抑制tuberin與HERC1的相互作用，使tuberin保持穩(wěn)定[26]。

8 TSC基因與疾病發(fā)生

Tuberin和hamartin作為腫瘤抑制因子，雜合性缺失（1oss of heterozygosity，LOH）或二次打擊突變常發(fā)生在多種與結(jié)節(jié)性硬化相關(guān)的錯(cuò)構(gòu)瘤或腫瘤中，如淋巴管平滑肌增多癥（LAM），腦巨細(xì)胞星形細(xì)胞瘤和腎臟腫瘤。最近有數(shù)據(jù)表明，TSC基因LOH或者突變導(dǎo)致蛋白的功能失活可能與一些非TSC疾病相關(guān)腫瘤如散發(fā)性膀胱癌、卵巢癌、膽囊癌、鼻咽癌、肺腺癌、子宮內(nèi)膜癌和非小細(xì)胞肺癌等有關(guān)[27-33]。Jiang等[34]研究了TSC基因在乳腺癌中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSC基因mRNA和蛋白水平表達(dá)降低，而且TSC基因的低表達(dá)與乳腺癌的侵襲性增強(qiáng)和低生存率有關(guān)。Wienecke等[35]通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR和免疫印記分析了49例成人、10例兒童非TSC室管膜細(xì)胞瘤患者TSC2 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明存在TSC2表達(dá)降低和缺失，但主要針對(duì)成人。Kataoka等[36]通過(guò)免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄PCR分析了42例胰腺癌患者中tuberin的表達(dá)水平，24例（57%）腫瘤標(biāo)本tuberin表達(dá)陰性且TSC2在腫瘤組織中的表達(dá)較相應(yīng)的非腫瘤組織中表達(dá)要低。

9 TSC1與TSC2的腫瘤抑制性

根據(jù)Knudson 腫瘤抑制基因突變和體細(xì)胞二次突變學(xué)說(shuō)（即腫瘤易感性和腫瘤發(fā)生學(xué)說(shuō)），TSC錯(cuò)構(gòu)瘤基因突變的多樣性表明TSC基因是一個(gè)腫瘤抑制基因。腫瘤抑制基因能夠抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，對(duì)正常細(xì)胞的增殖起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，該基因失活常常表現(xiàn)為一個(gè)等位基因缺失和另一個(gè)殘留等位基因的突變，等位基因缺失就是由腫瘤中常見(jiàn)的染色體區(qū)域或片段缺失所致，同時(shí)會(huì)伴有腫瘤抑制基因相鄰區(qū)域的雜合性缺失（LOH）。通過(guò)LOH分析及檢查基因組特定染色體上多態(tài)標(biāo)記，可定位腫瘤抑制基因并能發(fā)現(xiàn)新的腫瘤抑制基因的位點(diǎn)。多種形式的TSC1和TSC2等位基因及相鄰區(qū)域雜合性缺失，與TSC2位點(diǎn)相比，LOH較少發(fā)生于TSC1位點(diǎn)上。LOH在TSC1和TSC2位點(diǎn)上的發(fā)生率不同，可能是由于在散發(fā)患者中，TSC1和TSC2種系突變發(fā)生率不同，也可能是由于在2個(gè)位點(diǎn)上LOH和小突變（包括小片段缺失或插入、點(diǎn)突變、沉默突變） 相對(duì)發(fā)生率不同所致。

10 展 望

隨著TSC1和TSC2基因的定位及克隆，使人們對(duì)TSC 的分子發(fā)病機(jī)制有了一定的了解，為TSC的基因診斷和治療創(chuàng)造良好的條件。目前TSC1 和TSC2 基因與腫瘤抑制基因之間的關(guān)系需進(jìn)一步明確，它們的表達(dá)產(chǎn)物錯(cuò)構(gòu)瘤蛋白和馬鈴薯球蛋白的功能及相互作用尚不清楚，相信隨著研究的深入，人類最終能實(shí)現(xiàn)TSC 的基因治療。

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