CypA的生物學(xué)功能及其與肺癌相關(guān)的研究進展

錢哲 綜述 岳文濤 李寶蘭 審校

肺癌已經(jīng)成為對人類健康威脅最嚴重的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率逐年上升。根據(jù)衛(wèi)生部公布的第三次全國居民死亡原因調(diào)查結(jié)果顯示，我國肺癌的死亡率已經(jīng)高達30.83/10萬，比30年前上升了465%。肺癌的病因至今仍不完全明確，吸煙、遺傳因素、環(huán)境污染、自身免疫狀態(tài)、肺部慢性疾病等均被認為對肺癌的發(fā)病有影響。近年來，伴隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，人們對肺癌的發(fā)生發(fā)展有了更加深入的認識，親環(huán)素A（Cyclophilin A, CypA）與肺癌的關(guān)系也隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展而被揭示出來。CypA在多種惡性腫瘤中呈高表達，并且與腫瘤相關(guān)蛋白的合成、促進腫瘤細胞生長信號的傳遞、抑制凋亡、細胞運動調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等均有密切的關(guān)系。因此，作為一個潛在的早期診斷和靶向治療因子，CypA與肺癌的生物學(xué)關(guān)系的研究或?qū)⒊蔀橐粋€有前景的方向。本文將對CypA與肺癌相關(guān)的研究進展做一綜述。

1 CypA的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)特點

1.1 CypA的發(fā)現(xiàn) CypA是親環(huán)素家族（Cyclophilins, Cyps）中的重要一員，也是最早被發(fā)現(xiàn)的親環(huán)素。親環(huán)素家族最先被認為是環(huán)胞素A（Cyclosporine A, CsA）的胞內(nèi)結(jié)合蛋白，其由一組具有肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)所組成，在進化上有高度的保守性，廣泛表達于原核生物和真核生物中。親環(huán)素家族有16個成員，其中常見的在人體內(nèi)表達的有6個，包括CypA、CypB、CypC、CypD、CypE（Cyp33）和Cyp40。CypA是最早被提純的親環(huán)素家族成員，早在1984年Handschumacher等[1]即利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）從小牛胸腺中提取到了CypA，并為其命名。迄今為止，CypA仍是研究最廣泛的親環(huán)素。

1.2 CypA的分子結(jié)構(gòu)特點 CypA由一條含有165個氨基酸的多肽單鏈構(gòu)成，分子量約為18 kDa。20世紀90年代初，科學(xué)家利用X射線晶體衍射技術(shù)（X-ray crystallography）和核磁共振（nuclear magnetic reson,NMR）技術(shù)對CypA的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行了剖析。研究[2,3]發(fā)現(xiàn)，在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)水平，除了少量的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲外，CypA主要由β-折疊組成。其中最具結(jié)構(gòu)特征的是8條反向平行的β-折疊片段，與兩端的α-螺旋結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成了CypA的桶狀疏水性中心。此中心內(nèi)包含了影響CypA生物學(xué)活性的三個重要的疏水性殘基，它們是Arg55、Gln63和His126，CypA與大多數(shù)配體作用時氫鍵的形成均與這三個殘基密切相關(guān)。

2 CypA的表達與生物學(xué)功能

2.1 CypA的表達與分布特點 人類編碼CypA的基因位于染色體7p13位點，長2 276 bp，內(nèi)含5個外顯子區(qū)域[4]。CypA在原核生物和真核生物中均廣泛表達。由于CypA高度的進化保守性，使得它在各種生物和組織中的表達差異很小[5]。在細胞水平上，CypA主要定位于胞漿，也部分表達在高爾基體和胞核內(nèi)。某些細胞，如血管平滑肌細胞在受到氧化應(yīng)激或者巨噬細胞在受到脂多糖刺激時，它們還可以通過囊泡運輸?shù)姆绞綄ypA分泌到胞外，發(fā)揮類似細胞因子的功能[6]。CypA在人體中的各種正常組織均有表達，占細胞內(nèi)蛋白表達量的0.1%[7]。其中表達量最高的是大腦皮質(zhì)，約為2.8 μg/mg蛋白。在正常肺組織中CypA的表達量約為0.8 μg/mg蛋白。免疫組化顯示CypA在腎臟的近端小管上皮較其它組織呈高表達，這恰好與CsA的腎毒性作用位點相關(guān)[8]。

2.2 CypA的生物學(xué)功能

2.2.1 肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomeras,PPIase）活性 在人體中，CypA發(fā)揮著多種生物學(xué)功能，其中最早引起人們注意且最重要的即為CypA的PPIase活性。目前認為PPIase對于含有脯氨酸的蛋白質(zhì)的活性空間結(jié)構(gòu)的形成具有催化作用，是關(guān)鍵限速酶之一[9]。在折疊起始過程中，催化蛋白質(zhì)在順式和反式結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)化以及維持蛋白質(zhì)多聚體的構(gòu)象均有賴于CypA的PPIase活性[10]。同時，也有研究[11]發(fā)現(xiàn)CypA可起到分子伴侶的作用，在細胞遇到諸如熱損傷或者紫外線照射等不良刺激時，CypA可參與損傷蛋白的修復(fù)。CypA的PPIase活性促進了蛋白質(zhì)的合成和功能的發(fā)揮，為細胞的增殖提供了物質(zhì)保證[12]。基于CypA的PPIase活性，人們還發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激條件下，血管平滑肌細胞可以分泌CypA，其通過ROS介質(zhì)激活ERK1/2，促進血管平滑肌細胞的增殖，并且能夠趨化炎癥細胞和血管內(nèi)皮細胞至損傷部位，參與血管的重構(gòu)，提示CypA與血管損傷疾病，如高血壓、動脈粥樣硬化、腫瘤血管新生的發(fā)病機制有關(guān)[13]。

2.2.2 介導(dǎo)CsA參與的免疫抑制 CsA是一種在臨床上廣泛應(yīng)用的免疫抑制劑，多用于抑制器官移植后的免疫排斥反應(yīng)。CypA是CsA最重要的也是發(fā)現(xiàn)最早的胞內(nèi)受體[14]。CsA可以與CypA的疏水性活性中心相結(jié)合形成CypA:CsA二元復(fù)合物，發(fā)揮促進T細胞凋亡、阻斷信號傳導(dǎo)、抑制T細胞活化，從而達到抑制免疫的作用。當CsA進入T細胞后，可以激活CypA的核酸酶活性，降解DNA，參與T細胞的凋亡過程[15]。CypA:CsA二元復(fù)合物可以阻斷MAPK信號通路中的p38、MAPK和JNK的活化，抑制IL-2、IL-4等基因的轉(zhuǎn)錄激活過程，致使T細胞停留在G0期，阻礙T細胞的增殖。同時，CypA:CsA二元復(fù)合物還可以抑制鈣調(diào)神經(jīng)素（calcineurin, CaN）的酶活性，阻斷其去磷酸化活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cell,NF-ATc），下調(diào)淋巴因子的表達，抑制T細胞的活化，產(chǎn)生免疫抑制的功能[16]。實驗[17]證明，在CypA基因缺陷的小鼠體中，CsA無法發(fā)揮免疫抑制作用。因此，人們逐漸認識到CypA與某些免疫缺陷疾病密切相關(guān)，如艾滋病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。其中研究最為深入的是CypA與艾滋病發(fā)病機理的關(guān)系。CypA能特異性結(jié)合HIV-1（human immunodeficiency virus type 1）病毒的gag蛋白，在其進入宿主細胞后，幫助病毒核心在脫衣殼過程中解裝配[18]。這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)被應(yīng)用于抗艾滋病藥物的研究中[19]。

2.2.3 參與膽固醇的代謝 CypA在細胞膜上可與Caveolin-1形成復(fù)合體，參與細胞質(zhì)膜微囊（Caveolae）的合成，介導(dǎo)細胞內(nèi)外膽固醇的轉(zhuǎn)運，維持細胞內(nèi)外膽固醇的平衡。在細胞內(nèi)CypA則與Caveolin-1、CyP40和HSP56形成復(fù)合物，充當細胞質(zhì)內(nèi)的膽固醇運輸載體[20]。細胞膜上介導(dǎo)Caveolae轉(zhuǎn)運膽固醇的關(guān)鍵蛋白是Caveolin-1，CypA的內(nèi)部含有Caveolin-1結(jié)合區(qū)和特異的熱休克蛋白結(jié)合區(qū)，可以通過改變疏水區(qū)兩端的脯氨酸殘基的順-反式結(jié)構(gòu)，加速蛋白折疊，使Caveolin-1在空間構(gòu)象上更有利于膽固醇的結(jié)合而影響膽固醇的代謝[21]。由此可以推斷CypA與脂代謝疾病的發(fā)生有關(guān)。在動脈粥樣硬化動物模型上，Jin等[22]發(fā)現(xiàn)巨噬細胞中的清道夫受體可以調(diào)控CsA的濃度，提示作為CsA胞內(nèi)受體的CypA可以對動脈粥樣硬化的發(fā)病產(chǎn)生影響。

2.2.4 參與炎癥反應(yīng) 1997年，Billich等[23]在26例類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）患者的膝關(guān)節(jié)滑液里檢測到CypA，同時發(fā)現(xiàn)CypA的含量與關(guān)節(jié)滑膜中的中性粒細胞的數(shù)量呈正比。近期有研究[24]發(fā)現(xiàn)，RA患者血清和滑液中的CypA表達量與RA的發(fā)病嚴重程度正相關(guān)，由此可以認為CypA與炎癥反應(yīng)有關(guān)聯(lián)，可在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮類似細胞因子的功能。實驗[25]證明CypA在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮功能主要依賴與受體CD147分子的結(jié)合。免疫球蛋白CD147在CypA激活ERK的信號級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CypA與CD147的相互作用可以趨化單核細胞、中性粒細胞和嗜酸粒細胞等炎癥反應(yīng)細胞至炎癥發(fā)生部位[26]。在應(yīng)用抗CD147的抗體后，CypA的趨化效應(yīng)受到明顯的抑制，炎癥反應(yīng)也大幅下降[27]。

3 CypA與肺癌

3.1 CypA在肺癌中的表達 第一次揭示CypA在惡性腫瘤中的表達情況是在其被命名20年后。2003年，Campa等[28]應(yīng)用“基體輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）”技術(shù)檢測了10例非小細胞肺癌組織以及相配對的10例正常肺組織，發(fā)現(xiàn)了CypA的表達差異非常明顯。肺癌組織中的CypA含量是正常組織中的7倍，Western blot、免疫印記和免疫組化方法也同樣支持這一結(jié)果。此后Campa等[29]又比較了234例組織學(xué)上不同分級的原發(fā)性非小細胞肺癌標本的組織芯片免疫組化（tissue microarray immunohistochemistry, TMA-IHC），結(jié)果也證明CypA在肺癌組織中表達顯著升高。在表達CypA的組織中有25%呈強陽性，37%呈陽性，38%呈弱陽性。在A549、H1299、H446、SPC-A1等5種肺癌細胞系中H446的CypA的表達量最高，是人肺成纖維細胞系Hs8881u的6倍。CypA的配體CD147在這5種細胞系中的表達量與CypA呈正比[30]。近些年來，應(yīng)用2D電泳、質(zhì)譜分析、MALDI-TOF MS、Realtime PCR、Western blot、免疫組化等方法，人們先后發(fā)現(xiàn)了CypA在胰腺癌、肝癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌以及其它惡性腫瘤中的表達均升高[31]。

3.2 CypA對肺癌生物學(xué)性狀的影響 CypA在肺癌組織中的高表達引起了科學(xué)家的關(guān)注，促進了人們對CypA對肺癌生物學(xué)性狀方面作用的探討。Campa等[28]在利用基因干擾（RNA interference, RNAi）技術(shù)抑制了ADLC-5M2和LC-103H兩種非小細胞肺癌細胞系的CypA表達后，將細胞系接種于裸鼠，1個月后發(fā)現(xiàn)兩種經(jīng)過RNAi后的肺癌細胞的活體成瘤體積相對于正常肺癌細胞分別下降了72%和87%，這一結(jié)果表明下調(diào)CypA的表達可以明顯地抑制肺癌細胞的生長。同時，比較轉(zhuǎn)入了過表達CypA基因和轉(zhuǎn)入空載基因載體的小氣道上皮細胞在裸鼠體內(nèi)的生長情況后，發(fā)現(xiàn)CypA的過表達能夠顯著促進小氣道上皮細胞在活體中的生長[32]。另外，研究[30]證實外源性的CypA可以促進小細胞癌細胞系的生長。異常血管新生也是惡性腫瘤的特征性表現(xiàn)之一，然而抑制CypA表達后并未對肺癌的血管新生產(chǎn)生顯著影響。但是，由于先前有報道[33]稱外源性的CypA可以促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成，而且在低氧和炎癥的情況下CypA還可被內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞分泌至細胞外發(fā)揮功能[34]，因此，不排除是檢測方法和范圍的局限影響了CypA對于血管生成關(guān)系的判斷。除此之外還發(fā)現(xiàn)，抑制CypA對肺癌細胞的凋亡有很大的影響。利用原位末端標記法（terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL）檢測出RNAi后的肺癌細胞系的凋亡數(shù)量明顯上升，提示CypA具有增強肺癌細胞抗凋亡的能力，可能起著保證腫瘤細胞存活功能。抑制CypA還會對肺癌細胞的代謝產(chǎn)生影響，可以使癌細胞對葡萄糖的吸收能力減弱，代謝活動下調(diào)[32]。

3.3 CypA對肺癌作用的分子機制 CypA通過多種機制發(fā)揮它對腫瘤的影響。針對肺癌方面，主要表現(xiàn)在促進肺癌細胞的增殖，這與CypA的PPIase活性和CD147分子密切相關(guān)。CypA的PPIase活性和分子伴侶效應(yīng)可以催化合成肺癌細胞生存生長所必須的蛋白，提高腫瘤細胞抵抗各種不良刺激的能力。在H446細胞系中添加拮抗PPIase活性的物質(zhì)，如CsA等，CypA對H446細胞的促生長效應(yīng)立刻受到抑制。CypA對H446細胞生長的促進還可能是通過其對ERK1/2信號通路的激活來實現(xiàn)的，CypA首先與CD147結(jié)合后再作用于ERK1/2信號通路，拮抗CD147同樣能抑制CypA對細胞生長的促進[30]。最近有研究[27]發(fā)現(xiàn)，CypA可以通過CD147促進RA患者的炎癥細胞分泌金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）。眾所周知，MMP-9在惡性腫瘤中可以促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力，刺激VEGF的分泌，參與多藥耐藥[35]。雖然尚無完整的實驗證據(jù)，但是不難想象CypA可以通過CD147的協(xié)助，刺激MMP-9在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。已有研究證實了CypA對于小細胞肺癌細胞的抗凋亡能力，有人提出CypA可以抵抗缺氧和抗癌藥物對于腫瘤的促凋亡作用，但是其分子機制尚不明了，多數(shù)人認為這與減少活性氧物質(zhì)的威脅和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的調(diào)節(jié)有關(guān)[34]。有關(guān)證實CypA參與腫瘤多藥耐藥的研究[36]認為，高表達CypA的腫瘤細胞對阿霉素和長春新堿的耐藥水平均有提高。近期有研究把CypA作為腫瘤治療的新靶點，希望通過對它的抑制延緩腫瘤的生長。

3.3.4 CypA與肺癌的早期診斷 Howard對234例肺癌組織的CypA表達情況做統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CypA的表達高低與組織病理分級和病人預(yù)后之間無顯著的相關(guān)性，作為預(yù)后指標的可能性不大。那么CypA在不同分期和分級的非小細胞肺癌組織中的高表達究竟能說明什么問題呢？進一步分析后研究[29]認為CypA可能是在肺癌早期癌細胞向惡性轉(zhuǎn)化時起作用，而在后期的分化和侵襲轉(zhuǎn)移中可能不起顯著作用。這點恰好可以用CypA的分子生物學(xué)作用機制解釋：在肺癌形成的早期，CypA的表達明顯升高，充分發(fā)揮PPIase活性而加速癌組織相關(guān)蛋白的折疊和合成，即可為腫瘤的惡性生長提供物質(zhì)保證。作為一種主要存在于胞質(zhì)中的蛋白，在應(yīng)激條件下CypA可以被分泌到細胞外發(fā)揮作用。Suzuki等[6]發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用超氧化物激活劑刺激血管平滑肌細胞后采用Western blot的方法可檢測出CypA在培養(yǎng)基中的表達。Brune等[37]在重癥敗血癥患者的血清中也檢測到了高表達的CypA。因此雖然還未出現(xiàn)有關(guān)CypA在肺癌患者血清中表達含量的數(shù)據(jù)，但是也不排除可以在肺癌患者血清標本中檢測出CypA，這可以大大地提高CypA作為肺癌診斷標志物應(yīng)用的可行性。另外，不同個體之間血清蛋白含量的影響因素較多，就肺癌而言，胸水通常是由腫瘤直接刺激產(chǎn)生，與疾病發(fā)展關(guān)系密切，特異性更高，因此胸水中是否表達CypA以及表達量高低也是值得探討的問題。雖然暫無比較診斷肺癌組織中CypA方法敏感性和特異性的實驗，但考慮到CypA是一種廣泛表達的蛋白，在正常組織中含量也較高，可以推斷出CypA應(yīng)該是一個敏感性高而特異性較低的早期診斷指標。

4 結(jié)語與展望

作為一個表達廣泛、功能多樣的蛋白質(zhì)明星，CypA一直吸引著科學(xué)家們的眼球。PPIase活性、免疫抑制作用、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等諸多功能的發(fā)現(xiàn)以及蛋白質(zhì)組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)上的革新和進步，自然而然地將研究CypA的目光瞄準了惡性腫瘤。最早在肺癌中發(fā)現(xiàn)CypA的高表達后，人們就意識到它會與肺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，隨后發(fā)現(xiàn)它在肺癌中的促生長、抗凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和多藥耐藥方面的作用也證實了人們的假設(shè)[38]。當然，關(guān)于CypA還有很多問題需要我們?nèi)ソ鉀Q：CypA在肺部良惡性病變中表達數(shù)據(jù)尚不全面，表達量范圍尚未界定；CypA的促肺癌細胞生長的分子機制尚不明確；CypA的PPIase活性在肺癌中發(fā)揮作用的途徑尚不全面；CypA如何抗肺癌細胞凋亡；CypA是否有促腫瘤新生血管形成的作用；CypA的抑制能否幫助抗腫瘤藥物更好地發(fā)揮作用等等均亟待更加深入的研究。作為一個潛在的肺癌早期診斷標志物和治療靶點，相信有關(guān)CypA的研究一定能為人們認識和解決肺癌難題開啟新的篇章。