非小細(xì)胞肺癌DNA甲基化研究進(jìn)展

張有為 綜述 陳龍邦 審校

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率與死亡率均位于第一位的腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占據(jù)85%-90%。肺癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟，多因素參與的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，涉及遺傳學(xué)（genetic）與表觀遺傳學(xué)（epigenetic）信息的改變。DNA甲基化是最重要的一種表觀遺傳修飾方式，高甲基化所致基因轉(zhuǎn)錄失活，與胚胎發(fā)育和腫瘤疾病有著密切關(guān)系[1]。在本世紀(jì)初，僅有為數(shù)不多的單個(gè)抑癌基因（tumor suppressor gene, TSG）甲基化在小規(guī)模NSCLC樣本中的研究，近十年來(lái)，越來(lái)越多的基因在肺癌中的甲基化狀態(tài)被報(bào)道，并且，甲基化的DNA片段也可以在外周血和支氣管上皮脫落細(xì)胞中檢測(cè)到，某些基因甲基化還與患者不良預(yù)后或腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)，新的高通量高靈敏度的甲基化檢測(cè)方法也得到了較快發(fā)展。本文對(duì)這方面的進(jìn)展予以綜述。

1 DNA甲基化的概念

DNA甲基化，指DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'甲基胞嘧啶的過(guò)程。這種DNA修飾方式并沒(méi)有改變基因序列，但能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)[1]。腫瘤組織中DNA常見(jiàn)重復(fù)序列、組織特異性基因、印記基因的相關(guān)CpG位點(diǎn)往往呈去甲基化狀態(tài)，因此整體甲基化水平比正常組織低20%-60%；但局部區(qū)域如抑癌基因啟動(dòng)子CpG島卻發(fā)生異常高甲基化，使染色質(zhì)螺旋程度增加，基因轉(zhuǎn)錄受到抑制[2]。近來(lái)的證據(jù)[3]表明，DNA甲基化和組蛋白的化學(xué)修飾，如乙?；?、甲基化、泛素化（ubiquitination）、磷酸化、ADP核糖基化（ADP-ribosylation）等存在相互作用，共同調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。一些研究[4]還表明DNA甲基化直接影響組蛋白的乙?；图谆癄顟B(tài)。

DNA甲基化是一個(gè)可逆的過(guò)程，高甲基化沉默的基因可以被DNMTs抑制劑如5-氮雜胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-dC）恢復(fù)表達(dá)，而組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDACs）抑制劑如trichostatin A（TSA）等可顯著增加DNMTs抑制劑的激活效應(yīng)[5]。

2 NSCLC抑癌基因甲基化概述

最初，NSCLC中甲基化的研究集中于單個(gè)或少數(shù)功能相對(duì)明確的抑癌基因，這些研究的內(nèi)容包括觀察甲基化在腫瘤組織和正常組織的差異，以及與臨床病理參數(shù)的聯(lián)系，進(jìn)而作為預(yù)測(cè)或預(yù)后指標(biāo)。如，王銳等[6]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ibulin3基因在NSCLC組織中的甲基化頻率為43.1%（28/65），在相應(yīng)正常組織僅為9.2%（6/65），F(xiàn)ibulin3高甲基化導(dǎo)致其mRNA和蛋白水平表達(dá)下調(diào)，并與腫瘤分化、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；Yu等[7]報(bào)道，EPHB6甲基化引起的基因表達(dá)下調(diào)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)；而Choi等[8]報(bào)道，31.6%（31/98）的NSCLC組織檢出ADAMTS1基因甲基化，與患者臨床病理參數(shù)如年齡、性別、組織學(xué)類(lèi)型和臨床分期等無(wú)相關(guān)。通過(guò)這些研究，許多抑癌基因在NSCLC中的甲基化狀態(tài)得到鑒定，并且證實(shí)DNA甲基化的臨床應(yīng)用價(jià)值，如早期檢測(cè)、診斷、化學(xué)預(yù)防、治療和預(yù)后。進(jìn)一步的研究是聯(lián)合檢測(cè)多基因的甲基化狀態(tài)，以明確NSCLC中甲基化頻率較高的位點(diǎn)，作為潛在的生物標(biāo)記。其中，有些基因得到了較廣泛的關(guān)注，在多項(xiàng)獨(dú)立研究中均被報(bào)道具有較高的甲基化頻率，如APC、CADM1、CDH1、CDH13、p14ARF、p16INK4a、DAPK、FHIT、GSTP1、MGMT、MLH1和RASSF1A等[9]，但也有不一致的結(jié)果，解釋有多種，如研究方法、人種以及腫瘤亞型的差異。

Toyooka等[10]研究發(fā)現(xiàn)，甲基化方式的差異不僅存在于NSCLC、小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和類(lèi)癌之間，在NSCLC的亞型間也存在，APC和CDH13甲基化在腺癌中顯著高于鱗癌，而p16甲基化頻率在鱗癌中高于腺癌。Gu等[11]分析NSCLC中9個(gè)基因（p16、CDH1、TIMP3、RASSF1A、FHIT、APC、DAPK、MGMT和GSTP1）的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)腺癌的甲基化指數(shù)（methylation index, MI）顯著高于鱗癌。DNA甲基化方式的差異可能也與某些基因型異常有關(guān)，如EGFR突變的腺癌中，p16和CDH13甲基化以及MI均低于野生型；相反，K-ras突變更常見(jiàn)于p16甲基化的組織，K-ras突變的MI也顯著高于野生型[12]。推測(cè)甲基化參與EGFR和K-ras介導(dǎo)的肺腺癌發(fā)生過(guò)程，遺傳學(xué)與表觀遺傳學(xué)異常相互作用，共同促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些高通量的檢測(cè)方法可以同時(shí)檢測(cè)更多位點(diǎn)的甲基化。其中的一個(gè)方法是對(duì)亞硫酸氫鹽處理的DNA進(jìn)行半定量real time PCR（MethyLight），近來(lái)有3篇報(bào)道利用MethyLight方法研究NSCLC中27個(gè)位點(diǎn)[13]、腺癌中28個(gè)位點(diǎn)[14]和鱗癌中42個(gè)位點(diǎn)[15]的甲基化狀態(tài)，結(jié)果均確定了一組敏感而特異的甲基化標(biāo)記。Ehrich等[16]利用MALDI-TOF（matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight）為基礎(chǔ)的技術(shù)，分析96例患者的47個(gè)甲基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)CLEC3B、MGP、RASSF1、SDK2、SERPINB5和XAGE1A這6個(gè)基因的甲基化在癌組織中顯著高于相應(yīng)正常組織。另一項(xiàng)類(lèi)似研究[17]分析288個(gè)腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)28個(gè)潛在的標(biāo)記性位點(diǎn)，其中5個(gè)在肺癌組織中進(jìn)一步研究的結(jié)果確定PAX3和PYCARD/ASC是特異性的高甲基化位點(diǎn)。RLGS（restriction landmark genomic scanning）方法可以分析2 000個(gè)啟動(dòng)子序列，Dai等[18]對(duì)1 184個(gè)CpG島的研究發(fā)現(xiàn)11個(gè)基因在腫瘤組織中有差別的甲基化，其中GNAL和PDX1基因的甲基化比例超過(guò)50%。Illumina Golden-Gate platform是一項(xiàng)新的高通量技術(shù)，Bibikova等[19]在腺癌中對(duì)807個(gè)基因的1 505個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一組特異性的甲基化譜，其中的8個(gè)（ASCL2、CDH13、HOXA11、HOXA5、NPY、RUNX3、TERT和TP73）進(jìn)一步經(jīng)BSP測(cè)序法確認(rèn)。

芯片技術(shù)的發(fā)展為DNA甲基化研究提供了更好的平臺(tái)，使得甲基化研究不再針對(duì)某些特定位點(diǎn)，而能夠在整個(gè)基因組水平上無(wú)偏倚地分析腫瘤與正常組織或細(xì)胞的差異，從而更深入地理解DNA甲基化在NSCLC中的發(fā)生方式，并提供新的標(biāo)記物。通過(guò)基因表達(dá)芯片對(duì)細(xì)胞株以5-Aza-dC處理前后的分析，可以確定DNA甲基化的靶基因，Shames等[20]通過(guò)這種方法發(fā)現(xiàn)132個(gè)腫瘤特異性的甲基化位點(diǎn)，對(duì)其中45個(gè)進(jìn)一步研究，確定7個(gè)（ALDH1A3、BNC1、CCNA1、CTSZ、LOX、MSX1和NRCAM）潛在的肺癌標(biāo)記物。利用MIRA-assisted芯片（methylated CpG island recovery assay coupled with microarray analysis），Rauch等[21]從肺腺癌細(xì)胞A549和支氣管上皮細(xì)胞NHBE中收集富含CpG區(qū)域的片段，與含有12 192個(gè)CpG島的CpG芯片雜交，發(fā)現(xiàn)包括DLEC1、PAX7等基因在內(nèi)的50個(gè)甲基化位點(diǎn)有顯著差異，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)其中11個(gè)位點(diǎn)在鱗癌中的甲基化比例達(dá)到80%-100%[22]。

毫無(wú)疑問(wèn)，這些高通量的檢測(cè)方法可以迅速地鑒定許多潛在的甲基化標(biāo)記物，但是采用不同方法報(bào)道的甲基化位點(diǎn)又各不相同，彼此之間很少有重復(fù)性，因此，這些新的標(biāo)記物必須通過(guò)傳統(tǒng)方法在原發(fā)腫瘤組織中進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行優(yōu)化組合，盡可能地排除人種、性別及腫瘤異質(zhì)性等因素的影響。

3 游離DNA甲基化與NSCLC早期診斷及篩查

DNA甲基化是腫瘤發(fā)生中較頻繁的早期事件，可作為NSCLC早期診斷和篩查的潛在標(biāo)記。大量研究證實(shí)，甲基化的DNA片段也可以在外周血和支氣管上皮脫落細(xì)胞中檢測(cè)到，這種非侵襲性的檢查方法使甲基化檢測(cè)有了更好的應(yīng)用前景。

外周血是比較理想的樣本，腫瘤患者中存在高水平的循環(huán)DNA（circulating DNA），可能源自腫瘤細(xì)胞自分泌、裂解、壞死或凋亡等方式的釋放，并往往與原發(fā)腫瘤有著相同的基因改變[23]。NSCLC組織中研究較多的一些甲基化位點(diǎn)幾乎均在血漿/血清中得到了證實(shí)。如Hsu等[24]報(bào)道，63例肺癌血漿中，BLU、CDH13、FHIT、p16、RARβ和RASSF1A基因甲基化與相應(yīng)腫瘤組織符合率依次為86%、87%、80%、75%、76%和84%，并且其中任意兩者的甲基化對(duì)腫瘤診斷的敏感性和特異性可達(dá)73%和82%以上。本研究小組在NSCLC循環(huán)血DNA中篩選NSCLC敏感而特異的甲基化位點(diǎn)，先后發(fā)現(xiàn)p16、DAPK、RASSF1A、SFRP1和KLK10的甲基化比例分別為43.1%（28/65）、30.8%（20/65）、33.8%（27/80）、28.2%（22/78）和38.7%（30/78），與肺部良性疾病及正常對(duì)照者差異顯著[25-29]，可作為NSCLC早期診斷的潛在標(biāo)記。另一項(xiàng)研究[30]表明，NSCLC血漿中p16甲基化聯(lián)合微衛(wèi)星改變（microsatellite alterations）將診斷的敏感性提高到62%，p16甲基化與循環(huán)DNA含量的聯(lián)合，可提高敏感性到80%，優(yōu)于單獨(dú)甲基化檢測(cè)。因此，循環(huán)DNA甲基化與其它類(lèi)型腫瘤標(biāo)記物的聯(lián)合也是提高NSCLC診斷效能的一個(gè)研究方向。外周血存在的主要問(wèn)題有部分樣本DNA含量較低（可望通過(guò)提高檢測(cè)技術(shù)的敏感性來(lái)克服）以及缺乏器官特異性。

痰液含有來(lái)自肺和下呼吸道的脫落細(xì)胞，具有一定的特異性，痰液的甲基化位點(diǎn)也有較多報(bào)道。一項(xiàng)研究[31]確定痰液中4個(gè)甲基化位點(diǎn)（APC、p16、HS3ST2和RASSF1A）是NSCLC早期檢測(cè)的理想組合，AUC為0.8。吸煙人群是肺癌發(fā)病的危險(xiǎn)人群，且這部分人痰液較多，不需要誘導(dǎo)即可獲得，因此比較適合早期篩查。Belinsky等[32]報(bào)道，肺癌患者痰液中檢測(cè)到MGMT、RASSF1A、DAPK和PAX5α中三者及以上的位點(diǎn)甲基化，比非腫瘤吸煙者痰液的幾率高6.2倍。進(jìn)一步的前瞻性研究表明，在肺癌診斷前18個(gè)月收集的痰液樣本中，檢測(cè)到p16、MGMT、DAPK、RASSF1A、PAX5β和GATA5這6個(gè)基因中三者及以上的位點(diǎn)甲基化，肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加6.5倍[33]。但是痰液主要來(lái)自于中央的肺門(mén)部位，故可能不適于檢測(cè)腺癌，因后者常發(fā)生于肺的邊緣部位。

支氣管灌洗液（bronchoalveolar lavage, BAL）是另一個(gè)可供選擇的研究樣本，由于支氣管鏡是所有可疑肺癌患者必做的檢查，因此，BAL也較容易獲得，并可能部分含有肺特異性的肺癌細(xì)胞或DNA。Kim等[34]對(duì)85例NSCLC的BAL研究表明，68%的樣本至少檢出p16、RARβ、H-cadherin和RASSF1A其中之一的甲基化；另一項(xiàng)研究[35]報(bào)道，247例可疑肺癌患者（確診89例）的BAL中，聯(lián)合APC、p16和RASSF1甲基化檢測(cè)的診斷敏感性為53%，特異性為99%。

4 DNA甲基化與NSCLC預(yù)后及復(fù)發(fā)

多項(xiàng)研究表明，DNA甲基化與NSCLC臨床分期或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示表觀遺傳學(xué)異常還參與腫瘤演進(jìn)，可作為預(yù)后判斷的指標(biāo)。Tang等[36]報(bào)道，44%（59/135）的I期NSCLC組織表現(xiàn)出DAPK高甲基化，且5年生存率顯著低于未甲基化的患者（0.46 vs 0.68; P=0.007）。Burbee等[37]報(bào)道，30%（32/107）的NSCLC手術(shù)標(biāo)本檢出RASSF1A甲基化，且與患者預(yù)后不良有關(guān)。Seng等[38]在NSCLC中研究位于染色體3p的5個(gè)抑癌基因（RASSF1A 、BLU、RARβ、DLEC1和hMLH1）的甲基化，發(fā)現(xiàn)DLEC1和hMLH1的甲基化比例分別為38.7%和35.7%，二者均與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是不良預(yù)后的獨(dú)立影響因素。另外一項(xiàng)研究[39]發(fā)現(xiàn)RXRG基因甲基化在吸煙的NSCLC患者中，與預(yù)后不良相關(guān)，但在吸煙患者中，反而是保護(hù)因素。此外，NSCLC中報(bào)道較多的預(yù)后相關(guān)的甲基化位點(diǎn)還有APC、ASC/TMS1、CDH1、CDH13、DAL-1、FHIT、MGMT、p16、RUNX3、CADM1/TSLC1等[40]。值得注意的是全基因組的低甲基化與啟動(dòng)子區(qū)域的局部高甲基化一樣，也可作為潛在的預(yù)后指標(biāo)，最近的一項(xiàng)研究[41]在379例NSCLC組織中分析APC、CDH13、RASSF1A和LINE-1（long interspersed nuclear element 1，可代表全基因組甲基化水平）甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)LINE-1低甲基化是Ia期NSCLC預(yù)后不良的獨(dú)立因素。

甲基化與NSCLC復(fù)發(fā)的關(guān)系也有報(bào)道，Brock等[42]對(duì)術(shù)后40個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)的51例和無(wú)復(fù)發(fā)的116例I期NSCLC標(biāo)本，研究p16、MGMT、DAPK、RASSF1A、CDH13、APC和ASC的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p16、CDH13、RASSF1A和APC在腫瘤組織或相應(yīng)淋巴結(jié)（組織學(xué)正常）中的甲基化與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)，并且不受年齡、性別、種族、手術(shù)方式、腫瘤大小、組織學(xué)類(lèi)型及吸煙狀態(tài)的影響；如果p16和CDH13甲基化同時(shí)在腫瘤組織和縱隔淋巴結(jié)檢測(cè)到，復(fù)發(fā)的優(yōu)勢(shì)比（odds ratio, OR）是15.5。作者認(rèn)為這些組織學(xué)正常的淋巴結(jié)中檢測(cè)到DNA甲基化提示腫瘤微轉(zhuǎn)移。

5 DNA甲基化與化療敏感性

近來(lái)有研究[43]表明，個(gè)別基因的甲基化狀態(tài)與治療反應(yīng)性有關(guān)，如甲基化對(duì)DNA修復(fù)基因MGMT和hMLH的表觀遺傳學(xué)失活，分別與烷化劑和5-FU的敏感性改變有關(guān)，對(duì)指導(dǎo)膠質(zhì)瘤和大腸癌的治療具有一定意義；有絲分裂檢驗(yàn)點(diǎn)（checkpoint）控制基因CHFR的甲基化與微管抑制劑（如VP16）的敏感性有關(guān)。因此，可望通過(guò)甲基化標(biāo)記確定不同的腫瘤亞型以利于個(gè)體化治療。

14-3-3σ基因是主要的G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)控制基因，Ramírez等[44]在115例經(jīng)順鉑聯(lián)合吉西他濱治療的進(jìn)展期NSCLC患者中，研究血清DNA（化療前收集）的14-3-3σ甲基化，結(jié)果表明，39例（34%）患者檢出高甲基化，甲基化組中位生存期（15.1個(gè)月 vs 9.8個(gè)月，P=0.004）和中位進(jìn)展時(shí)間（8 個(gè)月 vs 6.3個(gè)月，P=0.027）更好，Cox回歸模型證實(shí)，只有14-3-3σ甲基化狀態(tài)和ECOG評(píng)分（PS）是影響預(yù)后的獨(dú)立因素。14-3-3σ甲基化可能成為NSCLC鉑類(lèi)聯(lián)合化療的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)。另一項(xiàng)類(lèi)似研究[45]在吉西他濱（或聯(lián)合其它藥物）一線治療的92例IIIb期和IV期NSCLC患者血清中，檢測(cè)APC1A、DAPK、FHIT、p14ARF、p16INK4a、RARβ和RASSF1A的甲基化，盡管沒(méi)有一個(gè)基因的甲基化與總生存期（overall survival, OS）有關(guān)，但在部分緩解（partial response, PR）的病例中，甲基化指數(shù)（methylation index, MI）＞0.3的患者生存期更長(zhǎng)［中位OS，（36.0±10.3）個(gè)月 vs （17.4±4.3 ）個(gè)月，HR=0.12，95%CI：0.053-0.54）］，而在穩(wěn)定和進(jìn)展的病例中，二者無(wú)差別。提示一個(gè)或多個(gè)基因的表觀遺傳學(xué)異?？赡茉谌〉门R床緩解的患者中發(fā)揮作用。并且，單一的RASSF1A基因甲基化在這一亞組中，也較未甲基化的患者生存期更長(zhǎng)［中位OS，（33.6±10.4 ）個(gè)月 vs （12.9±4.7）個(gè)月，P=0.0045），多因素分析表明，RASSF1A甲基化可作為PR患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。

de Caceres等[46]通過(guò)基因表達(dá)芯片分析，證實(shí)順鉑誘導(dǎo)耐受的NSCLC細(xì)胞株中存在IGFBP-3的高甲基化失活，而在順鉑敏感的親本NSCLC細(xì)胞株中，siRNA沉默IGFBP-3表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受；進(jìn)而，分析36例I/II期NSCLC組織的IGFBP-3甲基化，其中19例順鉑治療無(wú)效，17例順鉑敏感，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IGFBP-3高甲基化更常見(jiàn)于順鉑耐受組（14/19 vs 2/17, P＜0.001）；并且，在I期病例中，未甲基化的無(wú)疾病生存期（disease free survival,DFS）有增加的趨勢(shì)。

6 DNA甲基化與NSCLC治療

與基因突變等遺傳學(xué)改變不同，DNA甲基化是可以逆轉(zhuǎn)的過(guò)程。因此，在理論上，對(duì)癌前病變或腫瘤進(jìn)行去甲基化處理可以恢復(fù)某些關(guān)鍵性抑癌基因的功能，從而起到預(yù)防和治療腫瘤的作用。目前，表觀遺傳學(xué)的治療已經(jīng)在血液系統(tǒng)腫瘤中取得重大進(jìn)展，如DNMT抑制劑decitabine（地西他濱）和HDAC抑制劑vorinostat分別被FDA批準(zhǔn)用于骨髓異常增生綜合征（myelodysplastic syndrome, MDS）[47]和皮膚T淋巴細(xì)胞瘤（cutaneous T-cell lymphoma）[48]的治療。但在多種實(shí)體腫瘤中的結(jié)果并不令人滿意，原因可能是對(duì)這些藥物作用的機(jī)制了解不夠，對(duì)適宜患者的選擇以及最佳劑量等仍需要進(jìn)一步探索。在肺癌中的相關(guān)研究也剛剛起步，一項(xiàng)由美國(guó)國(guó)立癌癥研究所支持的I/II期臨床試驗(yàn)[49]正在Johns Hopkins大學(xué)進(jìn)行，初步結(jié)果顯示，Aza-dC聯(lián)合HDAC抑制劑entinostat使部分難治的進(jìn)展期NSCLC患者獲益，并且耐受性較好。

7 DNA甲基化與microRNA

microRNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度為20個(gè)-24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，主要通過(guò)與靶基因3'端非編碼區(qū)發(fā)生不完全配對(duì)，從而降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和分化等生命活動(dòng)[50]。miRNA的表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致癌基因或抑癌基因異?；罨鸵种剖悄[瘤發(fā)生發(fā)展中的常見(jiàn)事件。研究表明DNA甲基化也是miRNA表達(dá)失活的機(jī)制之一。在肺癌中報(bào)道的兩個(gè)位點(diǎn)是miR-34a和miR124a。miR-34家族（miR-34a、miR-34b和miR-34c）是構(gòu)成p53信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的一部分，miR-34a啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化在29.1%（7/24）的肺癌細(xì)胞株中檢測(cè)到[51]；Gallardo等[52]在70例術(shù)后NSCLC標(biāo)本中檢測(cè)miR-34家族的表達(dá)和甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)高甲基化引起的miR-34a低表達(dá)（P=0.008）與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)（P=0.04）。miR124a是CDK6（cyclin D kinase 6）的調(diào)控因子，miR124a甲基化在4/6的肺癌細(xì)胞系和13/27（48%）的原發(fā)腫瘤中檢測(cè)到，而正常肺組織和細(xì)胞株均未甲基化，并且，miR124a高甲基化與轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)，5-Aza-dC處理使其表達(dá)恢復(fù)[53]。

另一方面，F(xiàn)abbri等[54]發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅僅是甲基化調(diào)控的靶點(diǎn)，反過(guò)來(lái)也參與對(duì)DNA甲基化的調(diào)控。DNMT3A和DNMT3B是miR-29s（miR-29a, -29b, -29c）的調(diào)控靶點(diǎn)，NSCLC細(xì)胞（A549和H1299）中miR-29s過(guò)表達(dá)導(dǎo)致DNMT3A和-3B表達(dá)下降，且NSCLC組織中DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)與miR-29s水平呈負(fù)相關(guān)。轉(zhuǎn)染miR-29a、miR-29b和miR-29c到A549細(xì)胞，均導(dǎo)致全基因組甲基化水平的降低，與Dnmt1抑制劑decitabine的效應(yīng)類(lèi)似，同時(shí)，部分抑癌基因，如FHIT和WWOX啟動(dòng)子區(qū)高甲基化得以逆轉(zhuǎn)，表達(dá)恢復(fù)。

8 結(jié)語(yǔ)

隨著人類(lèi)進(jìn)入功能基因組時(shí)代，在時(shí)間和空間上調(diào)控基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)研究受到了廣泛重視。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾的主要方式，在肺癌等腫瘤疾病的研究中也有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，為腫瘤早期診斷、預(yù)后判斷和干預(yù)治療提供了新的思路，展現(xiàn)了良好的前景。但仍有許多問(wèn)題亟待解決，例如，作為腫瘤標(biāo)記物，目前報(bào)道的高頻特異性位點(diǎn)極少，NSCLC中鑒定的大量甲基化位點(diǎn)還需要臨床驗(yàn)證；甲基化檢測(cè)方法眾多，但各自都有一些缺點(diǎn)和局限性，難以普及于臨床；另外，DNMT抑制劑缺乏特異性，可能導(dǎo)致原本處于抑制狀態(tài)的一些基因恢復(fù)活性，促進(jìn)癌變的發(fā)生，具有潛在的副作用。因此，需要繼續(xù)進(jìn)行DNA甲基化在NSCLC中的深入研究，揭示甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，使其可望在將來(lái)成為NSCLC診斷及治療的有效工具。