自噬體的檢測及其對腫瘤的作用

齊亞莉,王 俊,李 巖,王洪艷,龔守良

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長春130021;2.北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,吉林 132001;3.吉林市腫瘤醫(yī)院放療科,吉林 132001)

1 自噬的概述

1.1 自噬(autophagy)簡介 自噬來源于希臘詞匯,意思是“self”和“eating” ,用來描述細(xì)胞在饑餓時(shí),為了存活而降解細(xì)胞內(nèi)成分獲得營養(yǎng)。自噬是真核細(xì)胞蛋白降解的重要途徑,其作用主要是清除降解細(xì)胞內(nèi)受損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、衰老的細(xì)胞器及不再需要的生物大分子等,同時(shí)也為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的構(gòu)建提供原料,即細(xì)胞結(jié)構(gòu)的再循環(huán)。細(xì)胞對這種合成與降解的精細(xì)調(diào)節(jié),對維持細(xì)胞的自身穩(wěn)態(tài)有重要意義。

1.2 自噬的發(fā)生過程 自噬開始于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)半環(huán)狀雙層或多層膜結(jié)構(gòu)的形成,進(jìn)而包繞大量細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器(如線粒體、內(nèi)吞體、過氧化物酶體等),形成自噬體(autophagosome),其直徑一般為300-900 nm,平均500 nm。包裹膜可能源于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖區(qū)、反面高爾基網(wǎng)絡(luò)或其它有膜囊泡體。自噬體膜相關(guān)蛋白的缺乏是從酵母到哺乳動物的共同特征,故難以確定自噬體膜的起源。自噬體與溶酶體融合,成為自噬溶酶體(autophagolysosome),最終通過溶酶體內(nèi)的蛋白酶降解其內(nèi)成分,完成對包裹物質(zhì)的降解和再循環(huán)利用。

1.3 自噬分類 根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)到溶酶體內(nèi)的途徑不同,自噬可分為以下3類。

1.3.1 大自噬 多數(shù)人認(rèn)為是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的單層膜凹陷形成杯狀雙層膜樣的分隔膜,進(jìn)而完全包繞待降解物形成自噬體,接著與溶酶體融合,自噬體內(nèi)細(xì)胞物質(zhì)(如細(xì)胞器)被溶酶體酶溶解。

1.3.2 小自噬 小自噬是溶酶體的膜直接包裹如長壽命蛋白并在溶酶體內(nèi)降解。

1.3.3 分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)胞漿內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中被溶酶體酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白分子,所以CMA降解途徑在清除蛋白質(zhì)時(shí)有選擇性,而前二者無明顯的選擇性。

1.4 自噬主要有3種作用

1.4.1 自噬是對營養(yǎng)缺乏的一種適應(yīng)性反應(yīng),如氨基酸缺乏在肝臟和培養(yǎng)細(xì)胞中可以誘導(dǎo)自噬。自噬對大分子物質(zhì)的降解能夠產(chǎn)生調(diào)節(jié)新陳代謝和生物合成的氨基酸及其它因子,為細(xì)胞提供能量,維持細(xì)胞的生命活動。氨基酸是自噬的重要調(diào)節(jié)因子,缺失氨基酸在肝臟中迅速誘導(dǎo)自噬,最初可觀察到自噬體,經(jīng)歷7-8 min后降解液泡出現(xiàn)。從自噬體的形成到轉(zhuǎn)化成殘余體這一完整自噬進(jìn)程約需20 min,營養(yǎng)缺乏的肝細(xì)胞中自噬途徑對胞質(zhì)蛋白這種非選擇性的降解率為3%-4%/h[1]。

1.4.2 自噬能夠調(diào)節(jié)過氧化物酶體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的更新,故自噬被認(rèn)為是一種參與細(xì)胞質(zhì)穩(wěn)態(tài)的看家機(jī)制,在許多病理生理和應(yīng)激刺激狀況下可觀察到對這些細(xì)胞器選擇性的分隔。

1.4.3 自噬參與特定的組織特異性功能。自噬與肺泡表面活性劑Ⅱ生物合成有關(guān)。黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元神經(jīng)黑色素的生物合成應(yīng)歸于胞質(zhì)多巴胺-苯醌被分隔入自噬液泡。在紅細(xì)胞成熟過程中,細(xì)胞核排出后需要自噬清除核糖體和線粒體等細(xì)胞器。

1.5 自噬的發(fā)生過程可分為4個(gè)階段

1.5.1 啟動階段 啟動階段是隔離膜形成的階段。在饑餓及某些激素等因素刺激下,有雙層膜的杯狀分隔膜開始在被降解物的周圍形成。

1.5.2 延長階段 此階段即隔離膜彎曲、變大,形成吞噬體膜以包裹吞噬的成分。

1.5.3 成熟階段 在此階段,自噬體形成之初,胞質(zhì)與核質(zhì)變暗,但細(xì)胞核結(jié)構(gòu)無明顯變化,可見線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹,高爾基體增大,胞膜特化結(jié)構(gòu)(如微絨毛、連接復(fù)合物等)消失,胞膜發(fā)泡并可出現(xiàn)內(nèi)陷。自噬后期,自噬體的體積和數(shù)量都有所增加,其內(nèi)常充滿髓脂或液體,胞質(zhì)中可見灰白成分,少數(shù)可見核固縮。

1.5.4 自噬體的裂解 自噬體形成后,將其包裹物運(yùn)輸至溶酶體內(nèi)與溶酶體融合形成自噬溶酶體,這一過程并非簡單的擴(kuò)散,而是通過細(xì)胞骨架微管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的傳輸實(shí)現(xiàn)的。自噬體融合后,最終被溶酶體中的水解酶溶解,首先經(jīng)過囊泡酸化,達(dá)到所需pH值后經(jīng)多種蛋白酶作用使囊內(nèi)容物降解,降解產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)利用。

1.6 自噬體的檢測

1.6.1 以透射電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)檢測(俗稱檢測自噬體的金標(biāo)準(zhǔn))。在透射電子顯微鏡下可見損傷的細(xì)胞器如線粒體的腫脹變性,其周圍出現(xiàn)空泡狀雙層膜樣結(jié)構(gòu),繼而雙層膜環(huán)繞成自噬體,進(jìn)而與溶酶體融合、消化;也可見自噬溶酶體內(nèi)最終不能降解的殘?bào)w等[2]。

1.6.2 自噬體膜標(biāo)志性蛋白質(zhì)的檢測。自噬體膜上標(biāo)志性蛋白質(zhì)有Atg12與Atg5結(jié)合體和微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3(LC3)。Atg12和Atg5在翻譯后就像單個(gè)分子一樣共價(jià)結(jié)合在一起,定位在自噬體雙層隔離膜的整個(gè)延長階段。LC3是酵母菌自噬基因(Apg7/Apg8)在哺乳動物中的同源物,和前者相比,LC3除了定位在自噬體分隔膜上,也一直以和磷脂酰乙醇胺即腦磷脂(PE)結(jié)合的形式(LC3-PE)存在于自噬體形成各階段的內(nèi)外膜上,在自噬溶酶體膜上也可見[3]。通過與綠色熒光蛋白(GFP)結(jié)合成Atg12-Atg5-GFP、LC3-GFP,即可實(shí)現(xiàn)對自噬體的檢測。LC3是目前檢測自噬的唯一標(biāo)志蛋白,有兩型,LC3-Ⅰ分子量為18 kDa,LC3-Ⅱ分子量為16 kDa,可檢測其含量和比值以反映細(xì)胞自噬活性。

1.6.3 單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。此法是自噬發(fā)生過程中分析分子水平機(jī)制的一種特異的檢測自噬體方法[4]。自噬體形成依賴的第二個(gè)泛素樣結(jié)合系統(tǒng)(Atg8)是位于自噬囊泡膜上與MDC特異結(jié)合的生化標(biāo)志,通過熒光染色,在熒光顯微鏡下可見核周區(qū)域陽性顯色。

1.6.4 應(yīng)用LC3-Ⅱ/DNA雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞自噬與細(xì)胞周期進(jìn)行同步分析,既可以檢測細(xì)胞自噬的發(fā)生,又可以與細(xì)胞周期進(jìn)行同步分析,闡明細(xì)胞自噬的發(fā)生與細(xì)胞周期的關(guān)系,同時(shí)也建立了一種新的檢測自噬的方法[5]。

1.6.5 間接自噬體檢測法。自噬溶酶體及其不能降解的產(chǎn)物殘?bào)w的檢測。自噬體和溶酶體融合后,除上述的LC3-GFP法檢測外,還有吖啶橙染色法,是一種熒光染料作為非極性反膠態(tài)分子團(tuán)的分子探針,在自噬溶酶體內(nèi)酸性磷酸酶活性增強(qiáng)下顯著著色。對殘?bào)w的檢測主要是對脂褐素顆粒的顯微觀察。

2 自噬在腫瘤中的作用

2.1 腫瘤細(xì)胞中自噬活性的降低 在對不同腫瘤細(xì)胞發(fā)展過程的研究中發(fā)現(xiàn),有些腫瘤細(xì)胞,如化學(xué)致癌物導(dǎo)致的肝癌細(xì)胞,在癌變前期的肝結(jié)節(jié)時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)了自噬能力下降的現(xiàn)象;而鼠的胰腺細(xì)胞經(jīng)致癌物質(zhì)誘導(dǎo)后,在癌變前期的結(jié)節(jié)和形成腺瘤時(shí)自噬和降解能力增加,當(dāng)形成癌細(xì)胞時(shí)自噬能力反而減少[6]。這些例子說明,大多數(shù)腫瘤細(xì)胞(如肝臟、胰腺和乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同,但是在癌變之后其自噬能力均減弱。自噬能力的衰退可能有利于腫瘤的發(fā)展。這提示,腫瘤細(xì)胞能快速生長,是由于其打破了細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率與自噬體降解蛋白質(zhì)的平衡[7]。

2.2 腫瘤細(xì)胞中的高自噬活性 盡管大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的自噬活性都降低,但是仍然有一些腫瘤細(xì)胞保持了較高的自噬活性,如大腸癌、肺癌細(xì)胞及人宮頸癌HeLa細(xì)胞等。研究表明,在缺乏血清或氨基酸的情況下約3 h,HeLa細(xì)胞中的自噬部分從4%上升到37%。這些腫瘤細(xì)胞所具有的高自噬活性對腫瘤細(xì)胞在惡劣環(huán)境中的生存起到了一定的保護(hù)作用,也可能使一些腫瘤藥物的作用減弱[8]。

2.3 自噬可作為腫瘤抑制因子 抑制自噬可使蛋白降解減少,合成代謝增加,導(dǎo)致癌前病變細(xì)胞的持續(xù)性生長。與相應(yīng)正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞自噬能力明顯下降,例如,轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞蛋白降解速率低于未轉(zhuǎn)化者,特別是在營養(yǎng)和(或)血清缺失的狀況下。在致瘤動物實(shí)驗(yàn)中也觀察到自噬能力的下降,二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌,癌前結(jié)節(jié)自噬能力較正常肝細(xì)胞下降,正常肝細(xì)胞經(jīng)種植瘤大鼠腹水作用后,自噬性蛋白降解被完全抑制。而且,從肝結(jié)節(jié)和肝細(xì)胞肝癌中分離出的細(xì)胞在培養(yǎng)中較正常肝細(xì)胞在氨基酸缺失的狀況下存活良好。根據(jù)這些資料,Schwarze等[9]提出自噬下調(diào)導(dǎo)致生存優(yōu)勢是因饑餓而防止蛋白過度丟失,蛋白平衡提高的結(jié)果。在體內(nèi),相較于正常肝細(xì)胞,在氨基酸濃度波動的饑餓應(yīng)激下,通過降低自噬維持正蛋白平衡能夠使癌前病變細(xì)胞獲得克隆優(yōu)勢。

2.4 保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用 自噬除了抑制腫瘤的作用外,作為細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制之一,還具有保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用。例如,使用 100 μ mol/L替莫唑胺(temozolomide)處理惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U3732MG,3 d后可以看到細(xì)胞中有明顯的自噬特征性改變,而且細(xì)胞的增殖受到抑制,但作用7 d后卻發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始增殖[10]。這說明,替莫唑胺誘導(dǎo)的自噬是可逆的,而且這種自噬可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞,防止其死亡。Yan等[11]研究了響尾蛇對白血病K-562細(xì)胞的作用,發(fā)現(xiàn)自噬可以延緩凋亡,維持細(xì)胞活力。Paglin等[12]發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌、乳腺癌及前列腺癌細(xì)胞在接受小劑量放療后,均存在酸性囊泡樣細(xì)胞器(AVO,即自噬泡)堆積現(xiàn)象。事實(shí)上AVO是保護(hù)照射后細(xì)胞的一種防御機(jī)制,因?yàn)橐种艫VO后,輻照細(xì)胞的死亡率升高。有人推測,自噬是凋亡的早期反應(yīng),當(dāng)細(xì)胞的損傷超過自噬保護(hù)負(fù)荷后,線粒體的準(zhǔn)凋亡因子將激活細(xì)胞死亡程序,因此提高自噬能力可減輕或者避免因凋亡所引起的死亡。

2.5 雙重作用 由此可見,自噬在腫瘤中的作用是雙重的,作為腫瘤保護(hù)機(jī)制,自噬可以保護(hù)癌細(xì)胞免受藥物的攻擊;作為腫瘤抑制機(jī)制,自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡、限制細(xì)胞數(shù)量,或者減少DNA的突變概率,以防止腫瘤形成。

[1]溫瑩浩,殷正豐.自噬與腫瘤[J].實(shí)用腫瘤雜志,2006,21(5):482.

[2]Martinet W,De Meyer GR,Andries L,et al.In Situ Detection of Starvatiorr induced Autophagy[J].J Histochem Cytochem,2005,7:[Epub ahead of print].

[3]Bergamini E,Cavallini G,Donati A,et al.The role of macroautophagy in the ageing process,anti-ageing intervention and age-associated diseases[J].Int J Biochem Cell Biol,2004,36(12):2392.

[4]Biederbick A,ken HF,Elsasser HP.Minidansylca daverine(MDC)is a specific in vivo marker forautophagic vacuoles[J].Eur J Cell Biol,1995,66(1):3.

[5]韓中博,張 鵬,付 強(qiáng),等.腫瘤細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)及其細(xì)胞周期分析[J].癌癥,2006,25(9):1063.

[6]Toth S,Nagy K,Palfia Z,et al.Cellular autophagic capacity changes during azaserine induced tumour progression in the rat pancreas Up-regulation in all premalignant stages and down-regulation with loss of cclohexinide sensitivity of segregation along with malignant transformation[J].Cell Tissue RES,2002,309(3):409.

[7]林 芳,顧振綸,秦正紅.自噬及其在細(xì)胞代謝和疾病中的作用[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2005,32(4):298.

[8]Cuervo AM.Autophagy.In sickness and in health[J].Trends Cell Biol,2004,14(2):70.

[9]Schwarze PE,Seglen PO.Reduced autophagic activity,improved protein balance and enhanced in vitro survival of hepatocytes isolated from carcinogen treated rats[J].Exp Cell Res,1985,157(1):15.

[10]Bauvy C,Gane P,Arico S,et al.Autophagy delays sulindac sulfide-induced apoptosis in the human intestinal colon cancer cell line HT-29[J].Exp Cell Res,2001,268(2):139.

[11]Yan CH,Liang ZQ,Gu ZL,et al.Arsenic trioxide induces autophagic cell death inmalignant glioma cells by unregulation or mitochondrial cell deaty protein BNIP3[J].Oncogene,2005,24(6):980.

[12]Paglin S,Hollister T,Delohery T,et al.A novel response of cancer cells to radiation involves autophagy and formation of acidic vesicles.Cancer Res,2001,61(2):439.