自體骨髓及纖維蛋白膠在骨組織工程中的應(yīng)用現(xiàn)狀

姚旺祥 馬 安

(1.杭州市第一人民醫(yī)院,浙江 杭州 310006;2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,浙江 杭州 310013)

因創(chuàng)傷、腫瘤所致的骨缺損、骨不連的治療一直是骨科研究的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)的自體骨移植由于其來(lái)源有限且增加創(chuàng)傷使其應(yīng)用受到一定的局限,單純使用同種異體骨及人工骨則有成骨能力受限、費(fèi)用高等缺點(diǎn)[1]。骨組織工程的發(fā)展為解決問(wèn)題帶來(lái)了新的希望。使用體外培養(yǎng)的細(xì)胞有培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、難以及時(shí)使用等缺點(diǎn),而若通過(guò)濃縮骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,則可以及時(shí)獲得治療濃度的細(xì)胞,一次操作解決問(wèn)題[2]。應(yīng)用臨床廣泛使用的纖維蛋白膠作為支架,具有便宜、易得等優(yōu)點(diǎn),且可有效解決細(xì)胞的流失問(wèn)題,為成骨提供支架而促進(jìn)成骨。本文就自體骨髓與纖維蛋白膠在骨組織工程中的應(yīng)用現(xiàn)狀作一綜述。

1 自體骨髓的應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 自體骨髓的主要成分 骨髓位于骨髓腔中,胎兒及嬰幼兒時(shí)期的骨髓都是紅骨髓,成人紅骨髓都分布在扁骨,不規(guī)則骨及長(zhǎng)骨干骺端的松質(zhì)骨中。紅骨髓主要是由造血組織與血竇構(gòu)成。骨髓是由造血系統(tǒng)和基質(zhì)系統(tǒng)組成的復(fù)合組織。一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了骨髓基質(zhì)細(xì)胞系統(tǒng)中存在能夠分化為骨、軟骨、脂肪組織的多能干細(xì)胞,其在合適的條件下可以生成骨、軟骨、肌肉和脂肪及韌帶[3]。

松質(zhì)骨主要由骨髓中的成骨干細(xì)胞分化而來(lái),骨髓的成骨能力早就被應(yīng)用到促進(jìn)骨折愈合中來(lái),例如在異體骨移植時(shí)混合在術(shù)中獲得的骨髓來(lái)增加移植骨的成骨特性[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,骨髓中富含骨形成蛋白、基質(zhì)細(xì)胞、骨內(nèi)膜細(xì)胞和骨祖細(xì)胞等成分。骨髓中的單核細(xì)胞及血小板等能產(chǎn)生各種生長(zhǎng)因子,促進(jìn)骨缺損的修復(fù)[5]。

骨髓的成骨能力主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞完成,而骨髓基質(zhì)細(xì)胞具備干細(xì)胞的兩個(gè)重要特征:強(qiáng)的自我增殖能力和多向分化潛能,具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉(心肌)及神經(jīng)細(xì)胞等組織分化的潛能[6]。骨髓的成骨能力與骨髓中基質(zhì)細(xì)胞的濃度存在正相關(guān),且隨著年齡的增長(zhǎng),骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨活性有所降低[7]。

1.2 自體骨髓在骨組織工程中的應(yīng)用 近年來(lái)已有自體骨髓移植的臨床報(bào)道,它具有來(lái)源廣泛、創(chuàng)傷小、采取方便、不受骨不連部位軟組織條件的限制、不存在免疫反應(yīng)、供區(qū)與受區(qū)并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)[8]。Finkemeier等[9]觀察到骨髓基質(zhì)細(xì)胞可直接轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞。在誘導(dǎo)因子和刺激因子存在的情況下,其他器官組織干細(xì)胞亦可轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞,因此,骨髓不僅本身有成骨作用,還可誘導(dǎo)刺激骨不連處其他器官組織細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞,大大提高了局部成骨能力。

Bruder等[10]采集大鼠、犬和人骨髓中的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后,種植于羥基磷灰石和磷酸三鈣支架材料,復(fù)合后分別將其植入同基因的鼠、犬和去胸腺大鼠體內(nèi),成功地修復(fù)了標(biāo)準(zhǔn)的股骨干骨缺損。Owen等[11]將骨髓細(xì)胞懸液種入擴(kuò)散盒,植入動(dòng)物體內(nèi),發(fā)現(xiàn)有骨形成,由于擴(kuò)散盒能夠阻擋植入部位周圍細(xì)胞及血管的長(zhǎng)入,故其成骨作用不依賴于周圍組織。擴(kuò)散盒的組織由纖維組織向軟骨組織和骨組織轉(zhuǎn)變,與胚胎骨發(fā)生過(guò)程十分相似。以上研究結(jié)果證明了骨髓中存在著不依賴于原有骨髓環(huán)境,能夠獨(dú)立成骨的骨祖細(xì)胞成分。

1.3 自體骨髓及其提取物在臨床的應(yīng)用 Quarto等[12]報(bào)道采用自體髂骨穿刺抽取骨髓,分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)體外擴(kuò)增后復(fù)合羥基磷灰石修復(fù)3例四肢長(zhǎng)骨缺損,采用外固定支架固定。經(jīng)術(shù)后隨訪,1例右脛骨4.0cm的缺損在術(shù)后27個(gè)月、1例右尺骨遠(yuǎn)端4.0cm缺損在術(shù)后16個(gè)月、1例右肱骨7.0cm缺損在術(shù)后15個(gè)月時(shí)均獲得功能恢復(fù)。柴崗等[13]利用骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞后,與同種異體部分脫鈣骨復(fù)合修復(fù)顱頜面骨缺損病11例,術(shù)后1～2.5年的隨訪表明組織工程骨穩(wěn)定存在,無(wú)明顯骨吸收現(xiàn)象,臨床治療效果穩(wěn)定。

Connolly等[7]報(bào)道用自體骨髓注射成功治療20例脛骨骨不連,證實(shí)了自體骨髓的成骨作用。Hernigou等[14]將自體骨髓通過(guò)細(xì)胞分離器濃縮后注射入脛骨萎縮性骨不連患者,證明其有效性與移植骨髓中基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量有關(guān),不經(jīng)濃縮處理,其基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量并不能達(dá)到治療骨不連的理想數(shù)目。干耀愷等[15]利用富集骨髓基質(zhì)細(xì)胞技術(shù),通過(guò)局部注射或與多孔磷酸三鈣材料復(fù)合后回植治療骨缺損患者49例,證實(shí)富集骨髓干細(xì)胞技術(shù)是一種快速、安全、簡(jiǎn)便的臨床細(xì)胞治療手段。這些研究表明,骨髓基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合適宜材料進(jìn)行移植可修復(fù)骨缺損,骨髓基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合材料的成骨能力明顯優(yōu)于單用材料或單用骨髓基質(zhì)細(xì)胞,因?yàn)椴牧咸峁┘?xì)胞生長(zhǎng)的支架而不讓其流失[16]。

在臨床工作中,使用骨髓基質(zhì)細(xì)胞應(yīng)嚴(yán)格遵守細(xì)胞移植治療的適應(yīng)證及禁忌證,遵守我國(guó)《藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范(2003)》制定的全部準(zhǔn)則,謹(jǐn)慎地在較大型的三級(jí)甲等醫(yī)院,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意,進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn),為廣大患者服務(wù)。

2 纖維蛋白膠在臨床及組織工程技術(shù)中的應(yīng)用

2.1 纖維蛋白膠的主要成分及理化性質(zhì) 纖維蛋白膠(Fibrin Glue,FG)是利用哺乳類動(dòng)物或人的血液中有關(guān)成分,通過(guò)人工提取而來(lái)。FG由兩部分組成,第一部分為濃縮纖維蛋白原、XIII因子和抑肽酶,其中纖維蛋白原含量與凝固的強(qiáng)度、凝固時(shí)間直接相關(guān),而XlII因子可以促進(jìn)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及分化;第二部分含凝血酶和氯化鈣。兩者混合后凝血酶酶切纖維蛋白原,釋放出纖維蛋白A肽及B肽,促進(jìn)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白,形成纖維蛋白單體,凝血因子使纖維蛋白分子交聯(lián),聚合成網(wǎng)狀,增加凝集強(qiáng)度。凝血酶在鈣離子存在下參與纖維蛋白多肽的交聯(lián),使之形成堅(jiān)固的不易降解的凝塊[17]。

在體內(nèi)纖溶酶作用下,通常纖維蛋白在體內(nèi)的降解時(shí)間在2～3周左右[18]。纖維蛋白膠內(nèi)不同的組成成分,如纖維蛋白原、凝血酶的濃度、離子強(qiáng)度等都能夠影響纖維蛋白膠的穩(wěn)定性及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。堵疾等[19]研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)在FG中加入不同濃度抑肽酶、氨基酸類化合物,可以調(diào)節(jié)控制其降解時(shí)間。氨基酸類化合物抗纖溶作用機(jī)制主要是抑制纖溶酶原與纖維蛋白的結(jié)合,由于氨基酸類化合物結(jié)構(gòu)與賴氨酸相似,從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制了纖溶酶原與纖維蛋白的結(jié)合,影響其激活,使之不受纖溶作用而溶解;此外,此類氨基酸類化合物也抑制了纖溶酶活性的作用,保護(hù)某些凝血因子,免受纖溶酶的降解。

纖維蛋白在創(chuàng)傷愈合中是一種天然的細(xì)胞生長(zhǎng)支架材料,從創(chuàng)傷開(kāi)始發(fā)生凝血、纖維蛋白支架形成后就開(kāi)始為多種細(xì)胞,如成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞提供遷移至創(chuàng)傷部位的途徑[20]。在整個(gè)創(chuàng)傷愈合過(guò)程中,纖維蛋白不僅是支架材料,還有許多生物活性功能,如吸引和激活血細(xì)胞、促進(jìn)血小板黏附等。

FG有良好的組織相容性,生物降解性,能較好地介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞間相互作用,可降解并釋放β轉(zhuǎn)化因子和血小板衍生生長(zhǎng)因子促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖,為細(xì)胞提供三維空間,促進(jìn)組織再生[21]。天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),長(zhǎng)期穩(wěn)定的纖維蛋白膠是細(xì)胞生長(zhǎng)和分泌特異性基質(zhì)的必要條件。如果纖維蛋白膠降解吸收過(guò)快或其纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)過(guò)于緊密則會(huì)抑制細(xì)胞增殖與遷移,影響細(xì)胞外基質(zhì)的形成。

2.2 纖維蛋白膠在骨組織工程中的應(yīng)用 現(xiàn)已廣泛用于外科臨床的PG是從全血中分別提取出纖維蛋白原和凝血酶后分開(kāi)包裝的一種可注射型制劑。使用時(shí)將兩者混合注入機(jī)體內(nèi)。纖維蛋白膠可用于減少根治性乳房切除術(shù)和腫塊切除術(shù)后血腫的形成,同時(shí)該制劑可用于粘合手術(shù)縫合處。纖維蛋白膠在歐洲的臨床應(yīng)用指癥是止血、組織粘合、促進(jìn)縫合創(chuàng)口的愈合、封閉體內(nèi)空腔和蛛網(wǎng)膜下隙等[17]。

研究發(fā)現(xiàn)FG不僅具有封閉創(chuàng)面、止血、促進(jìn)愈合、生物粘合等多種功能,還因其特有的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使其可作為藥物緩釋載體[22]。FG作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白的載體進(jìn)行骨缺損修復(fù)研究發(fā)現(xiàn),兩者復(fù)合物的骨修復(fù)能力明顯大于單一成分[23]。Naif等[24]的研究證實(shí)FG能增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附率并顯著促進(jìn)其增殖。由于纖維蛋白膠在成型之前兩種成分都是液體成分,具有可以任意塑型的特點(diǎn),聚合后通過(guò)凝膠狀纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)發(fā)揮支架作用,作為一種可注射性細(xì)胞支架材料目前已經(jīng)在組織工程學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[25]。

FG本身也是一種優(yōu)良的骨修復(fù)材料,凝固后獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)使其為細(xì)胞的黏附提供了支架。Pei等[26]取自體膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞與纖維蛋白膠復(fù)合后旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)1個(gè)月,見(jiàn)細(xì)胞保持原有形態(tài),將其與材料復(fù)合后成功修復(fù)了兔股骨髁的骨軟骨缺損。Tayapongsak等[27]在下頜骨重建術(shù)中,將患者自體纖維蛋白黏合劑注入到骨移植區(qū),發(fā)現(xiàn)骨修復(fù)速度明顯加快。Isogai等[28]將培養(yǎng)后的牛骨膜細(xì)胞與FG混合植入裸鼠背部皮下,12周時(shí)有新骨形成,而單純FG植入無(wú)新骨形成。

Abiraman等[29]的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)FG可能有骨誘導(dǎo)活性,他們將PG包被羥基磷灰石顆粒,生物活性玻璃陶瓷和磷酸鈣硅酸鈣系統(tǒng)分別植入鼠股四頭肌,以未包被材料作為對(duì)照,結(jié)果表明FG可能有骨誘導(dǎo)作用。纖維蛋白膠的降解作用有利于組織的愈合,復(fù)合的細(xì)胞及細(xì)胞因子的釋放,從而與成骨同步起來(lái)[30]。另外FG可以促進(jìn)形成新的毛細(xì)血管及膠原沉積,這也將有利于骨形成[31]。

總之,濃縮自體骨髓含有成骨細(xì)胞、豐富的成骨因子,可及時(shí)使用,而纖維蛋白膠則可提供細(xì)胞附著的支架,將兩者結(jié)合,可望為骨缺損的治療提供新的思路。

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