組織工程骨修復(fù)骨不連研究進展

趙福江，王云亭

（中日友好醫(yī)院 骨科，北京 100029）

組織工程骨修復(fù)骨不連研究進展

趙福江，王云亭?

（中日友好醫(yī)院 骨科，北京 100029）

骨不連是骨折常見并發(fā)癥。美國每年發(fā)生的約600萬骨折患者中，約5%～10%發(fā)生骨不連[1]。骨不連的治療措施多種多樣，自體骨移植是目前臨床上治療骨不連的主要方法。但該方法存在一些缺陷，并可帶來一些并發(fā)癥，不利于其在臨床上的廣泛使用[2]。用組織工程骨替代自體骨移植來促進骨生成是近年來研究的熱點?，F(xiàn)就組織工程骨修復(fù)骨不連的研究進展情況做一綜述如下。

1 骨不連

1.1 骨不連概述

骨不連是指骨折后未形成骨連接，骨愈合過程停止。對于診斷骨不連的確切時間沒有明確的定義，美國食品與藥品管理局（FDA）將其定義為9個月[3]。根據(jù)X線表現(xiàn)，骨不連可以分為萎縮型和肥大型骨不連兩種類型。肥大型骨不連骨折端有充分的血供[4]，萎縮型骨不連主要是由于骨折端血運缺乏所致，成骨能力下降[5]。

1.2 骨不連的病因

引起骨不連的原因很多，主要包括全身因素和局部因素。全身因素包括營養(yǎng)不良，糖尿病，吸煙，骨質(zhì)疏松以及非甾體類抗炎藥的使用；局部因素包括局部感染，血運缺乏，骨折端固定不牢固，骨折端接觸不充分以及高能量損傷等[6]。影響骨折愈合的根本因素在于骨折局部的血液供應(yīng)。Reed等[7，8]研究發(fā)現(xiàn)萎縮型骨不連患者和肥大型骨不連患者骨折處的血管計數(shù)基本相同，并通過動物試驗發(fā)現(xiàn)萎縮型骨不連骨折處血運在早期明顯減少，3周時開始增多，到第8周時和肥大型骨不連處血管計數(shù)基本相同。因此，Reed認為血運不足是引起骨不連的主要原因。后期雖然血運恢復(fù)，但骨愈合過程已停止，骨不連繼續(xù)存在[7]。

1.3 骨不連目前的治療方法及存在的缺陷

骨不連目前主要的治療主要包括牢固的固定和自體骨移植。自體骨移植包括了骨修復(fù)所有的核心因素：（1）骨引導(dǎo)作用的三維支架；（2）骨誘導(dǎo)作用的生長因子；（3）成骨作用的細胞[9]。自體骨移植治療骨不連治愈率較高，但是在取得良好效果的同時也伴隨著一些不利因素，限制了骨移植治療的廣泛使用[2]。自體骨移植來源有限，尤其是在伴有較大的骨缺損或者缺損形態(tài)不規(guī)則的時候，自體骨移植很難提供充足及合適的骨。而且自體骨移植還可能帶來很多并發(fā)癥：自體骨移植需行手術(shù)從患者體內(nèi)取骨，對患者造較大的創(chuàng)傷；還可能造成傷口感染，術(shù)后供骨區(qū)持續(xù)疼痛及傷口處血腫等，給患者帶來很大痛苦。這些不利因素都不利于自體骨移植的廣泛使用。同種異體骨來源也有限，且有傳播肝炎和艾滋病等傳染病的危險，而且牽涉?zhèn)惱韱栴}。異種骨移植雖然來源廣泛，但免疫排斥反應(yīng)嚴重，成骨能力較差[10]。為了克服骨移植在治療骨不連中的缺陷，很多專家學(xué)者開始尋找骨移植的替代治療。

2 骨組織工程在治療骨不連中的作用

2.1 骨組織工程概述

骨組織工程是將患者或供者的特定細胞（干細胞、祖細胞）在體外支架材料上生長，形成一個三維結(jié)構(gòu)，然后移植到患者體內(nèi)[11]。移植后，細胞分化并轉(zhuǎn)移到支架內(nèi)部，血管附上并蔓延到新組織內(nèi)部，然后生成骨組織。骨組織工程的最終目的是將支架材料在體內(nèi)誘導(dǎo)成骨樣結(jié)構(gòu)，從而取代缺損或病變的骨組織[11]。

2.2 血管化在骨組織工程中的作用

骨折愈合是一個復(fù)雜的過程，要求各種細胞的活化、遷移、分化成熟，合成細胞外基質(zhì)和各種形態(tài)結(jié)構(gòu)[12]。因此血管生成過程是早期創(chuàng)傷和骨折愈合過程中的關(guān)鍵因素，并且是充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，以及引導(dǎo)炎性細胞到達創(chuàng)傷部位最重要的因素[4]。移植后生物材料成功引導(dǎo)骨生成依賴于能發(fā)揮生物活性的細胞[13]。該過程中，骨細胞長入支架內(nèi)部及生物材料內(nèi)部血管生成必須同時發(fā)生。血管的生長范圍決定新生骨生成情況。骨的生長需要血管網(wǎng)絡(luò)提供營養(yǎng)物質(zhì)，帶走代謝產(chǎn)物。但礦化骨不能通過滲透和擴散作用提供營養(yǎng)，血管只能在100μm以內(nèi)提供營養(yǎng)，100μm外的各種細胞因得不到充足營養(yǎng)不能存活[14]。因此，在組織工程骨治療骨不連過程中，提高組織工程骨的血管化水平成為移植成功的關(guān)鍵。

2.3 種子細胞

隨著干細胞與組織工程技術(shù)的進步，對骨組織工程的認識更加深入。許多文獻報道成功的骨移植材料需要提供骨折愈合的三個核心要素：骨引導(dǎo)作用的支架材料，骨誘導(dǎo)作用的生長因子以及成骨細胞[13]。而骨引導(dǎo)與骨誘導(dǎo)作用的發(fā)揮依賴于成骨細胞的作用[9]。對種子細胞的研究也從單純間充質(zhì)細胞過渡到成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞。

2.3.1 間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs是存在于骨髓中非造血干細胞的另一種干細胞，是由中胚層發(fā)育的早期細胞，具有多向分化潛能，不僅能分化為造血實質(zhì)支持造血，還可以分化為多種造血以外的組織細胞，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞，如骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、肝細胞、脂肪細胞等[16]。目前已有研究表明MSCs可以分化為成骨細胞，并已通過特定的條件在體外成功誘導(dǎo)分化出成骨細胞[17]。骨折的愈合主要包括膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨兩個過程。膜內(nèi)成骨是MSCs增殖分化為成骨細胞，由成骨細胞生成骨組織；軟骨內(nèi)成骨是MSCs分化為軟骨細胞，形成軟骨，再通過一系列重塑過程形成骨組織。因此，MSCs是具有成骨潛力的細胞，骨愈合過程離不開MSCs的參與[12]。在當前的骨組織學(xué)研究中，大量學(xué)者使用MSCs做為種子細胞與支架材料結(jié)合研究骨生成情況。有學(xué)者將載有MSCs的三維支架移植到經(jīng)免疫抑制的小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)有新骨組織生成[18]。

將MSCs作為種子細胞的組織工程骨用于治療骨不連，無法解決三維支架內(nèi)部血運缺乏的問題。由于三維支架內(nèi)血管缺乏，將負載MSCs的三維支架材料移植到動物體內(nèi)后，大量MSCs因無法獲得足夠的氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)而壞死[19]，數(shù)量減少。此外，MSCs需轉(zhuǎn)化為成骨細胞才能發(fā)揮成骨作用，而人體內(nèi)MSCs數(shù)量有限，且只有很小一部分能轉(zhuǎn)化為成骨系細胞發(fā)揮成骨作用[20]。鑒于以上不足，一些學(xué)者開始考慮使用具有直接成骨作用的成骨細胞及有成血管作用的內(nèi)皮細胞聯(lián)合來治療骨不連[19，21]。

2.3.2 成骨細胞

在骨折愈合及骨骼發(fā)育過程中，新骨的生成是一個復(fù)雜、多階段的過程，包括一系列的生物反應(yīng)。在第一階段，成骨細胞或其祖細胞從周圍的組織及血液循環(huán)中募集到將要發(fā)生骨生成的部位[22]。到達特定部位后，細胞增殖分化為成熟的功能成骨細胞，產(chǎn)生細胞外基質(zhì)，形成骨。因此，成骨細胞或其祖細胞聚集到骨折部位是新骨生成的基礎(chǔ)[23]。骨不連，尤其是萎縮型骨不連患者，由于缺乏血供，成骨細胞及其祖細胞無法正常到達骨折部位，使正常骨折愈合過程無法繼續(xù)進行。如果將成骨細胞作為組織工程的種子細胞，移植到骨不連處，成骨細胞即可在原位分泌細胞外基質(zhì)，促進骨不連愈合。使用成骨細胞避免了從MSCs分化為成骨細胞的過程，從而縮短了骨愈合的時間，并可保證成骨細胞的數(shù)量。當前體外誘導(dǎo)分化成骨細胞的技術(shù)已經(jīng)比較成熟，已有很多學(xué)者將骨髓間充質(zhì)細胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化為成骨細胞[17]。

2.3.3 內(nèi)皮細胞

骨組織成功移植需要許多復(fù)雜的過程。首先發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，隨后的修復(fù)過程導(dǎo)致骨折愈合。在這個過程中，骨細胞和血管必須同時長入支架材料。內(nèi)皮細胞是這些過程中主要的細胞。它參加炎性反應(yīng)過程，并通過分泌炎性因子和表達細胞粘附分子參與骨修復(fù)過程[24]。除此之外，內(nèi)皮細胞還構(gòu)成了血管的內(nèi)壁[21]。內(nèi)皮細胞在血管生成刺激物，比如1型膠原、VEGF、和bFGF的作用下，在體外可以生成管腔樣結(jié)構(gòu)[24]。內(nèi)皮細胞可以從人臍靜脈中得到，并通過體外培養(yǎng)得到擴充。但通過這種途徑獲得內(nèi)皮細胞來源有限?，F(xiàn)在，人們發(fā)現(xiàn)MSCs具有分化成內(nèi)皮細胞的潛能。MSCs來源廣泛，已有學(xué)者通過在體外利用血管內(nèi)皮細胞生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、纖維素樣生長因子-B（fibroblast growth factor-B，b-FGF）成功將MSCs誘導(dǎo)成內(nèi)皮細胞[25]。

2.3.4 內(nèi)皮細胞與成骨細胞聯(lián)合作為種子細胞

由于上述內(nèi)皮細胞的成血管作用和成骨細胞的成骨作用，將兩者聯(lián)合作為種子細胞有望成為治療骨不連一種新的方法[14]。包含內(nèi)皮細胞和成骨細胞的三維支架，在植入體內(nèi)前經(jīng)過一段時間的體外誘導(dǎo)，生成血管[21]。植入體內(nèi)后，這些血管就可發(fā)揮功能，帶來氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)，使成骨細胞充分發(fā)揮成骨作用，從而有利于骨折愈合，克服了將成骨細胞單獨作為種子細胞的缺陷。另外，這兩種細胞除了各自的成骨和成血管作用以外，還具有相互促進的作用[26～29]。

研究表明，血管內(nèi)皮細胞可以分泌一些細胞因子影響成骨細胞的功能和分化，而成骨細胞除表達這些細胞因子的受體外還可以分泌細胞因子影響內(nèi)皮細胞的功能[26]。血管內(nèi)皮細胞可以分泌骨形態(tài)蛋白 （bone morphogenic proteins，BMPs）及內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）等細胞生長因子[27]。BMP是作用最強的骨誘導(dǎo)蛋白：BMP能促進成骨細胞的趨化作用，BMP-2能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)祖細胞誘導(dǎo)分化為成骨細胞[28，29]。ET-1能夠誘導(dǎo)成骨細胞增殖和分化，并能夠促進成骨細胞堿性磷酸酶的表達和?型膠原的生成[25]。內(nèi)皮細胞通過這兩種作用提高成骨細胞的成骨能力。除此之外，成骨細胞可以分泌VEGF[30]。VEGF能夠促進MSCs誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞，并使內(nèi)皮細胞生成血管[25]。Unger等[21]將內(nèi)皮細胞與成骨細胞在體外聯(lián)合培養(yǎng)，在不加任何生長因子的情況下見到管腔樣結(jié)構(gòu)和骨樣組織生成。而將兩者單獨培養(yǎng)，則基本上沒有管腔結(jié)構(gòu)，且僅有少量骨組織生成。張建等[31]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞和成骨細胞聯(lián)合作為種子細胞修復(fù)下頜骨缺損時，無論是促進骨生成還是促進血管生成的效果都要明顯高于單純成骨細胞。

3 組織工程骨治療骨不連的現(xiàn)狀及展望

目前，組織工程骨的研究以及在臨床上的使用已經(jīng)取得了一定的成果。Kruyt等[32]使用BMSCs做為種子細胞植入山羊的脊柱間發(fā)現(xiàn)了明顯的成骨反應(yīng)；Kitoh等[17]在施行3例骨延長手術(shù)時，將BMSCs配合富含血小板的血漿注入牽拉成骨的部位，發(fā)現(xiàn)可以明顯提高成骨的速度；Yu等[14]將MSCs誘導(dǎo)為血管內(nèi)皮細胞和成骨細胞，然后將兩種細胞聯(lián)合培養(yǎng)，得到血管化的組織工程骨，植入動物體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)其成骨作用較單純使用成骨細胞有明顯提高。Gan等[15]利用患者自體骨髓細胞進行離心濃縮后，將得到的MSCs與β-三磷酸鈣混合后用用于脊柱融合，取得了較好的效果。楊志明等[33]應(yīng)用自體BMSCs對52例患者多個部位的骨缺損、骨不愈合進行修復(fù)，初步證實：①組織工程骨具有良好的成骨能力和修復(fù)效果；②采用同種異體來源的成骨細胞未發(fā)現(xiàn)明顯組織排斥反應(yīng)及其他并發(fā)癥。

但是，目前組織工程骨的應(yīng)用還存在一些問題：種子細胞往往需要體外培養(yǎng)或誘導(dǎo)達到一定的數(shù)量后，才能在體內(nèi)發(fā)揮最大的作用，而體外環(huán)境無法完全模擬體內(nèi)環(huán)境，因此，種子細胞的安全性問題需要我們更進一步的研究[34]。此外，進行不同類型組織工程骨構(gòu)建研究，以及具有活力的血管化組織工程骨的構(gòu)建，是組織工程臨床應(yīng)用所必須解決的關(guān)鍵技術(shù)問題[35]。

骨組織工程的臨床應(yīng)用尚處于起步階段，距離廣泛的臨床應(yīng)用還有很長的路要走。隨著組織工程越來越受到廣大學(xué)者的關(guān)注，相信不久的將來，組織工程在基礎(chǔ)研究及臨床使用上將會取得突破性的成果。

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R68

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1001-0025（2010）01-0051-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2010.01.016

衛(wèi)生部臨床學(xué)科重點項目[2007]353號；國家自然科學(xué)基金（30772194，30672117）。

*本文通訊作者。

趙福江（1981-），男，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。

2009-08-04

2009-12-29