大電導(dǎo)鈣激活鉀通道功能調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

朱 倩 (浙江海寧市人民醫(yī)院 314400)

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(也稱作BKCa，MaxiK或Slo-1)是鉀離子通道家族重要的成員之一。它具有大單通道電導(dǎo)、分布廣泛、受膜電位和胞內(nèi)鈣離子雙重調(diào)控等特點(diǎn)，參與許多重要的生理活動。

BKCa通道是由四個形成孔道的α亞基聚集而成的對稱復(fù)合物，在很多組織中由α亞基和β亞基組成，β亞基對通道的功能起調(diào)節(jié)作用。BKCa通道的α亞基的N端有7個跨膜區(qū)段(S0～6)，COOH端包含4個疏水區(qū)段(S7～10)，這一區(qū)段對通道的調(diào)節(jié)起著十分重要的作用。S7～8區(qū)段有兩個鉀電導(dǎo)調(diào)節(jié)區(qū)(RCK)，在S10區(qū)段前有一系列保守的帶負(fù)電荷的天冬氨酸殘基，是鈣離子結(jié)合的位點(diǎn)，稱為“鈣池”。此外，在COOH端還有其他的一些調(diào)節(jié)位點(diǎn)，如四聚化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)、鎂離子結(jié)合位點(diǎn)等。在不同組織中，BKCa通道的功能特征有顯著的差異，其功能受很多機(jī)制所調(diào)控，本文就近年來在這方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 β亞基及其他輔助蛋白的調(diào)控

在哺乳動物中，已有4個β亞基（β1～β4）被克隆。盡管β亞基之間的同源性很高，但它們的表達(dá)譜及對BKCa通道功能特征的影響有顯著的差異。β1主要在平滑肌、毛細(xì)胞和某些神經(jīng)元中表達(dá)，通過改變亞基電壓感受器的構(gòu)象及其移動來減慢BKCa通道的門控，并增加通道對鈣的敏感性[1]。此外，β1的共表達(dá)能改變鈣離子對α亞基中兩個主要鈣結(jié)合位點(diǎn)的親和力，當(dāng)通道開放時，鈣離子對RCK1的位點(diǎn)親和力增加，而在關(guān)閉時，對“鈣池”的親和力則下降[2];β2則能加速BKCa通道的失活；β3在睪丸、胰腺和脾臟中表達(dá)，也能加速BKCa通道的失活，但不影響通道對鈣的敏感性；β4在大腦中的表達(dá)最高，能減慢通道的失活，改變通道的鈣依賴性電壓－電導(dǎo)關(guān)系，并且能使BKCa通道對阻斷劑IBTX和ChTX的敏感性下降。當(dāng)β4亞基和α亞基共同形成通道時，通道口的靜電作用及空間位阻可阻止ChTX的進(jìn)入，從而使通道對阻斷劑的敏感性下降。有研究顯示，β4胞外區(qū)中四個連續(xù)的賴氨酸殘基和BKCa通道中央孔道的胞外入口很近，它們組成三個帶正電荷的環(huán)，能降低胞外鉀離子濃度，以賦予BKCa通道的外向性整流特征[3]。Martin等[4]報道，β4能調(diào)節(jié)BKCa通道對酒精的反應(yīng)，當(dāng)α亞基和β4亞基在HEK293中共表達(dá)時，BKCa通道對酒精的急性耐受性會顯著下降；從β4亞基敲除的小鼠中分離的神經(jīng)元中的BKCa通道對酒精能產(chǎn)生快速耐受性，因此β4亞基有可能成為治療酒精中毒的一個靶點(diǎn)。

除了上述4個β亞基外，其他一些輔助蛋白也能調(diào)控BKCa通道。研究者用酵母雙雜交的方法在果蠅中鑒定了兩個BKCa的調(diào)節(jié)蛋白Slob和dSLIP1。dSLIP1能減少BKCa通道在細(xì)胞膜上的表達(dá)，而降低BKCa通道的電流幅度；Slob本身對BKCa通道只有較弱的作用，但當(dāng)它與另一種稱作14-3-3的蛋白共同作用時，可以顯著地抑制BKCa通道的活性。一種Mink相關(guān)肽MiRP3也可以調(diào)節(jié)BKCa通道，在CHO細(xì)胞中它可顯著減小BKCa通道的電流密度，并使通道的電壓－電導(dǎo)的關(guān)系曲線向更去極化的膜電位偏移[5]。在腎臟足細(xì)胞中，nephrin蛋白可調(diào)節(jié)BKCa通道的表面表達(dá)[6]。此外，BKCa通道的表面表達(dá)也受一種稱作MAGI-1的膜支架蛋白抑制，MAGI-1可能在腎臟及大腦等組織中調(diào)節(jié)BKCa通道的活性。大多數(shù)關(guān)于β亞基及輔助蛋白對BKCa通道的研究結(jié)果來自于離體的異源表達(dá)系統(tǒng)，且近年來的研究還發(fā)現(xiàn)BKCa通道的某些β亞基及輔助蛋白對其他的鉀離子通道也有調(diào)節(jié)作用。因此，β亞基及輔助蛋白對BKCa通道在體內(nèi)調(diào)節(jié)作用的特異性仍有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

2 磷酸化調(diào)控

在神經(jīng)、肌肉及非興奮性細(xì)胞中，離子通道功能結(jié)構(gòu)的多樣性是電信號變化的基礎(chǔ)，蛋白磷酸化是產(chǎn)生這種多樣性的重要機(jī)制之一。許多離子通道的內(nèi)在門控特征受細(xì)胞中磷酸激酶和磷酸酶的調(diào)控，這些酶可以通過修飾通道蛋白中某些特定的可逆性磷酸化位點(diǎn)來動態(tài)調(diào)節(jié)通道的活性。BKCa通道是各種常見的絲氨酸/蘇氨酸激酶的重要底物之一，這些酶包括cAMP依賴性蛋白激酶A(PKA), cGMP依賴性蛋白激酶G(PKG)以及二?；视?Ca2+依賴性蛋白激酶C(PKC)等。這些激酶可使BKCa通道的活性與細(xì)胞的各種信號級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，以控制細(xì)胞的興奮性或收縮性。Tian等[7]報道，哺乳動物BKCa通道α亞基的所有剪接體都含有一個保守的PKA位點(diǎn)，此位點(diǎn)位于C端“鈣池”序列附近，通道所有4個亞基在該位點(diǎn)的磷酸化可使其活性提高60%。Yan等的研究[8]顯示，BKCa有至少7個選擇性剪接體，他們鑒定了多達(dá)30個的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，且通過在HEK293細(xì)胞中的電生理實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了BKCa通道α亞基的磷酸化能差異性地調(diào)節(jié)通道的電壓和鈣的敏感性，提示BKCa通道α亞基的動態(tài)磷酸化修飾可能為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的興奮性的控制提供一種分子機(jī)制。

BKCa通道的活性也可受Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的調(diào)控，在用秀麗線蟲為模式動物的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)肌肉接頭的突觸前膜中，CaMKⅡ能通過直接磷酸化線蟲BKCa通道的蘇氨酸殘基T425調(diào)節(jié)其功能，進(jìn)而控制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[9]。Liu等[10]報道，CaMKⅡ能通過磷酸化N端的T107抑制牛BKCa通道的活性，并改變通道對酒精的敏感性。在中樞神經(jīng)中，CaMKⅡ被認(rèn)為是記憶和學(xué)習(xí)過程中的關(guān)鍵分子，它對BKCa通道的作用提示了BKCa通道可能參與神經(jīng)元可塑性的調(diào)節(jié)。

除了α亞基，通過β亞基或其他輔助蛋白的磷酸化也能調(diào)節(jié)通道的功能。有研究指出，當(dāng)BKCa通道在HEK293細(xì)胞中表達(dá)時，其活性與內(nèi)源性的酪氨酸激酶和磷酸酶密切相關(guān)，而這種相關(guān)性依賴于通道的接頭蛋白cortictin的可逆性磷酸化，表明BKCa通道的活性受cortictin磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)[11]。

3 mRNA 選擇性剪接的調(diào)控

在不同物種中，BKCa通道的α亞基都有很多的選擇性剪接體，其中有些能產(chǎn)生具有顯著鈣敏感性及動力學(xué)差異的通道，以行使不同的生物學(xué)功能[12]。在耳蝸的毛細(xì)胞中，不同剪接體編碼的通道能在毛細(xì)胞的基膜形成一種鉀電流的梯度，調(diào)節(jié)毛細(xì)胞中電壓共振的頻率。這些通道在動力學(xué)上有顯著的不同，它們與電壓門控的鈣通道的組合，在很大程度上決定了毛細(xì)胞的電學(xué)調(diào)諧。在小鼠的發(fā)育過程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中BKCa通道的不同剪接體的豐度有很大變化，說明哺乳動物在大腦發(fā)育過程中，需要具有不同特征的BKCa通道來行使功能。Soom等[13]報道了在原始的大腦組織中，BKCa通道中編碼S6至RCK1區(qū)段的外顯子可以被一個同樣大小的外顯子取代，而通道的門控特征也發(fā)生了變化，在低鈣時通道能被更快激活，而在高鈣時其開放頻率增加。

外顯子選擇性的剪接還能作為一種分子開關(guān)來決定該通道的磷酸化調(diào)控的特性。研究顯示，PKA能通過磷酸化保守的S869而激活通道，但如果通道中包含外顯子STREX時，又能通過磷酸化其中的一個殘基來抑制其活性。因此，外顯子STREX成了BKCa通道在PKA激活型和PKA抑制型之間轉(zhuǎn)換的分子開關(guān)，這種外顯子選擇性剪接和磷酸化修飾的組合大大豐富了BKCa通道活性的調(diào)控模式[14]。

過去十幾年的研究已確立了BKCa通道在生物體對酒精耐受性的產(chǎn)生中起重要的作用[15]。例如在視上核及紋狀體中，BKCa通道對酒精的敏感性會逐漸下降。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，BKCa通道對酒精敏感性下降是由一種含有稱作ALCOREX外顯子的mRNA的選擇性降解所引起的，這種ALCOREX mRNA的選擇性降解提高了其他剪接體的相對比例，使形成的通道對酒精不敏感；mRNA的選擇性降解是由microRNA miR-9所介導(dǎo)，在ALCOREX mRNA的3，-UTR中含有miR-9的識別序列，酒精可以使miR-9的豐度上調(diào)，從而使ALCOREX mRNA得以選擇性的降解。mRNA選擇性剪接的調(diào)控在很大程度上豐富了BKCa通道的生物學(xué)功能。

4 內(nèi)源性代謝物的調(diào)控

近年的研究指出，BKCa通道的功能可被許多內(nèi)源性代謝物調(diào)節(jié)，其中包括氧化亞氮(NO)、一氧化碳(CO)等氣體信號分子，4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)、血紅素等。例如，在海馬CA1錐體神經(jīng)元中，慢性間歇性組織缺氧可顯著降低BKCa通道的開放頻率，這種BKCa通道的活性下降是由NO的不足引起，表明NO的缺失可抑制BK的活性[17]。在培養(yǎng)的人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞中，CO可直接或通過NO及cGMP依賴性途徑激活BKCa通道。在HEK293細(xì)胞中，CO能可逆性地作用于BKCa通道的S9-S10區(qū)段，以濃度依賴性方式快速激活BKCa通道，但不影響通道的單通道電導(dǎo)和去激活[18]。PIP2能直接調(diào)節(jié)BKCa通道的功能，通過增加鈣驅(qū)動的門控過程并改變通道開關(guān)，但不影響通道的單通道特征和電壓依賴性，這種作用能被β1亞基顯著加強(qiáng)[19]。血紅素能結(jié)合BKCa通道，抑制其活性。氧化型及還原型的血紅素都能直接與BKCa通道結(jié)合，降低通道的開放頻率。后來的研究發(fā)現(xiàn)，血紅素是CO作用于BK通道的受體，CO能結(jié)合還原型血紅素，使其由通道抑制劑轉(zhuǎn)變成激活劑，這揭示了氣體信號分子調(diào)節(jié)離子通道的一種新機(jī)制[20]。在氣管平滑肌細(xì)胞中，白細(xì)胞介素IL-4能通過快速增加近膜鈣離子的濃度來調(diào)節(jié)BKCa通道的功能[21]。此外，在血管平滑肌中，BKCa通道能被前列腺素、過氧化氫及脂質(zhì)加氧酶產(chǎn)物等內(nèi)源性代謝物所激活，從而使血管平滑肌超極化而舒張[22]。以上這些研究揭示了內(nèi)源性代謝物對BKCa通道調(diào)節(jié)作用，為尋找新的治療心血管疾病的藥物提供了分子基礎(chǔ)。

5 其他調(diào)控機(jī)制

BKCa通道蛋白中含大量對很多氧化劑敏感的半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)殘基。半胱氨酸特異性還原劑二硫蘇糖醇(DTT)能加快BKCa通道激活的動力學(xué)過程，增加單通道開放概率。過氧化氫等氧化劑可選擇性地氧化半胱氨酸殘基，抑制BKCa通道的鈣依賴性激活，這種抑制性效應(yīng)部分由C末端911位的半胱氨酸殘基氧化所介導(dǎo)。除了C911外，對RCK區(qū)段C430的氧化修飾也能改變BK通道的鈣依賴性激活。Zhang等報道[23]，BKCa通道的C430和C911殘基與撕裂膜片中通道的時間依賴性衰減有關(guān)，而給予還原劑DTT可以阻止這種衰減。此外，RCK區(qū)段中三個蛋氨酸殘基(M536、M712和M739)的氧化能增加BKCa通道的活性[24]。

某些離子通道也能調(diào)節(jié)BKCa通道的活性。在血管平滑肌細(xì)胞中，瞬時受體電勢(TRP)通道TRPV4能與BKCa通道及ryanodine受體形成鈣信號復(fù)合體，通過鈣誘導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放以引起平滑肌細(xì)胞的超極化和血管舒張。在培養(yǎng)的人支氣管內(nèi)皮細(xì)胞系中，TRPV4與BKCa通道的功能相耦合，鈣離子通過TRPV4激活BKCa通道[25]。在腎臟足細(xì)胞中，BKCa通道能與內(nèi)源性TRPC3和TRPC6結(jié)合，在HEK293細(xì)胞中共表達(dá)時，TRPC6能增加BKCa通道的表面表達(dá)及電流幅度，提示TRPC通道可能作為激活BKCa通道的鈣源之一來調(diào)節(jié)其活性[26]。在血管平滑肌細(xì)胞中，TRPC1能與BKCa通道結(jié)合，通過TRPC1的鈣離子可激活BKCa通道而引起細(xì)胞膜超極化[27]。上述研究表明，在平滑肌細(xì)胞中，TRP通道的存在為BKCa通道的功能調(diào)節(jié)提供了一種新的機(jī)制。

6 結(jié)語

BKCa通道的獨(dú)特之處在于一方面它對鉀離子的高通透性，另一方面它結(jié)合了電壓門控和配體門控離子通道的功能結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因而可以受很多因素的調(diào)控。BKCa通道廣泛表達(dá)于神經(jīng)元、平滑肌、內(nèi)分泌等組織器官中，對細(xì)胞中各種信號的整合、細(xì)胞興奮性的控制、細(xì)胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)平衡等方面起重要的作用。BKCa通道的缺失能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的多種疾病，包括癲癇、運(yùn)動障礙、聽力損傷、高血壓疾病、哮喘等。近年來，科學(xué)家們利用分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)了更多的組織特異性BKCa通道α亞基形式及一些新的輔助蛋白，有關(guān)BKCa通道功能的調(diào)控機(jī)制正在被進(jìn)一步揭示。這些研究將對尋找新的藥物靶點(diǎn)和治療相關(guān)疾病提供重要的理論依據(jù)。